枯草桿菌發(fā)酵對何首烏抗氧化成分及肝癌細胞抗增殖作用的影響

范瓊　趙敏　金明坤　韓丙軍

摘要：【目的】探討何首烏經枯草桿菌發(fā)酵后主要抗氧化成分及其對肝癌細胞抗增殖作用效果的變化，為進一步研究何首烏發(fā)酵炮制方法及開發(fā)何首烏產品提供科學參考?！痉椒ā繉⑸问诪跤每莶輻U菌發(fā)酵處理后，測定生品和發(fā)酵品的游離型蒽醌、結合型蒽醌和總多酚含量等成分的變化，并對比何首烏生品和發(fā)酵品對肝癌細胞HepG2抗增殖作用的變化。【結果】何首烏生品和發(fā)酵品總游離型蒽醌含量分別為1.56和1.60 mg/g，總結合型蒽醌含量分別為1.24和0.79 mg/g，何首烏經枯草桿菌發(fā)酵后結合型蒽醌含量極顯著下降（P<0.01，下同）。何首烏生品和發(fā)酵品水提取液的總多酚含量分別為44.88和74.01 mg/g，乙醇提取液的總多酚含量分別為61.84和93.86 mg/g，何首烏經枯草桿菌發(fā)酵后總多酚含量極顯著增加。0.025 g/L何首烏生品對肝癌細胞HepG2作用24 h后的細胞抑制率為4.2%，0.25 g/L何首烏生品對肝癌細胞HepG2作用72 h后的細胞抑制率為-11.1%（負值表示促進細胞生長），即隨著何首烏生品濃度增加和作用時間延長，其對肝癌細胞生長的作用由抑制轉變?yōu)榇龠M。經枯草桿菌發(fā)酵后，0.025 g/L何首烏發(fā)酵品對肝癌細胞HepG2作用24 h后的細胞抑制率為9.9%，0.25 g/L何首烏發(fā)酵品對肝癌細胞HepG2作用72 h后的細胞抑制率為20.9%，即隨著何首烏發(fā)酵品濃度增加和作用時間延長，其對肝癌細胞HepG2有明顯的抗增殖效果?！窘Y論】枯草桿菌發(fā)酵可降低何首烏的毒性，增強其對肝癌細胞HepG2的抗增殖作用，表明使用枯草桿菌發(fā)酵何首烏的炮制方法是一種安全有效的炮制減毒方法，對開發(fā)相應何首烏炮制品有重要意義。

關鍵詞： 何首烏;枯草桿菌;發(fā)酵;蒽醌類物質;細胞抗增殖

中圖分類號： S567.239? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）08-1932-07

Effects of Polygonum multiflorum Thunb fermented by Bacillus subtilis on main antioxidant ingredient contents and anti-proliferation effects on hepatoblastoma cells

FAN Qiong1，2， ZHAO Min1，2， KIM Myung-kon3，HAN Bing-jun1，2

（1Testing and Analysis Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou? 571101， China; 2Hainan Provincial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables， Haikou? 571101， China; 3Depart-ment of Food Sciences and Biotechnology， Jeonbuk National University， Jeonju-si， Jeollabuk-do? 570-752， Korea）

Abstract：【Objective】To investigate the changes of main antioxidant ingredients and inhibition effects on hepatoblastoma of Polygonum multiflorum Thunb（PM） after fermentation by Bacillus subtilis（BPM），and provide a scientific referen-ce for further research of the PM fermentation method and exploring the PM fermentation products. 【Method】After fermented by B. subtilis， changes of free anthraquinone， conjugated anthraquinone components and total polyphenol content in PM and BPM were determined， and changes of inhibition effects on hepatoblastoma HepG2 cell of PM and BPM were also investigated. 【Result】In PM and BPM， free anthraquinone content were 1.56 and 1.60 mg/g，conjugated anthraquinone in PM and BPM were 1.24 and 0.79 mg/g. After fermentation， conjugated anthraquinone in BPM were decreased extremely significantly（P<0.01，the same below）. The total polyphenol of PM and BPM water extract were 44.88 and 74.01 mg/g respectively， ethanol extract of PM and BPM were 61.84 and 93.86 mg/g respectively， it indicated that after fermentation by B. subtilis， the total polyphenol content were increased extremely significantly. 0.025 g/L PM extract showed 4.2% inhibition to hepatoblastoma HepG2 cells after 24 h，0.25 g/L PM extract showed -11.1% inhibition to hepatoblastoma HepG2 cells after 72 h（negative number meaned growth promotion）， it indicated that with the increasing of concentration and time， the effect of PM on the hepatoblastoma HepG2 cells changed from inhibition to promotion. And after fermentation by B. subtilis， 0.025 g/L BPM extract exhibited 9.9% inhibition to hepatoblastoma HepG2 cells after 24 h，0.25 g/L BPM extract exhibited 20.9% inhibition to hepatoblastoma HepG2 cells after 72 h， it showed that with the increasing of concentration and time， BPM had an obvious anti-proliferation effect on the hepatoblastoma HepG2 cells. 【Conclusion】These results show that fermentation by B. subtilis can reduce toxicity of PM and increase the anti-proliferation effects on hepatoblastoma HepG2 cells， which indicates that fermentation using B. subtilis can be helpful for the utilization of the BPM preparation method as a new potential procedure to process PM and reduce toxicity.

Key words： Polygonum Multiflorum Thunb; Bacillus subtilis; fermentation; anthraquinone;anti-proliferation of cell

Foundation item：Agricultural International Exchange and Cooperation Program of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs（BARTP-12-HBJ）; Special Fund for Basic Scientific Research of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences（1630082020004，1630082020003）

0 引言

【研究意義】何首烏為蓼科植物何首烏[Polygonum multiflorum Thunb（PM）]的干燥塊根，主要成分包括蒽醌類、二苯乙烯苷類、黃酮類、酚類和磷脂類等，其中二苯乙烯苷類和蒽醌類為主要成分（任紅微等，2018）。何首烏分為生首烏和制首烏，兩者功效不同，生首烏具有解毒、潤腸通便等功效，制首烏具有烏須發(fā)、補肝腎、益精血等功效，臨床上多采用制首烏入藥（Xu et al.，2009;石聰等，2011）。然而，自20世紀末期開始，國內外不斷出現服用生何首烏及含何首烏制劑導致肝損傷的研究報道（張栩等，2000;Panis et al.，2005;徐靜等，2009;宋鑫等，2019）。何首烏中的蒽醌類大黃素及大黃素甲醚目前被認為是導致肝細胞損傷的主要物質（張瑞晨等，2012;汪祺等，2016），蒽醌類分為結合型和游離型蒽醌，其中結合型蒽醌成分是致瀉和肝毒性的主要成分，游離型蒽醌類物質則具有一定的抗癌活性（孫桂波等，2008;Yu et al.，2012）。因此，尋找一種可降低結合型蒽醌含量、降低何首烏毒性及提高何首烏抗氧化效果的新型炮制方法，對何首烏的臨床使用及再開發(fā)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】傳統(tǒng)的何首烏炮制方法有九蒸九曬、黑豆汁制和清蒸炮制等，何首烏經傳統(tǒng)炮制后毒性雖有所降低，但其抗氧化性成分含量也相應降低（劉世琪等，2013）。發(fā)酵炮制是一種新型炮制方法，是選用特定微生物定向發(fā)酵炮制何首烏，可促進中藥破壁及有效成分的溶出，且條件溫和，在保證有效成分穩(wěn)定的同時能減少有毒成分，比傳統(tǒng)炮制方法更加安全可靠（劉鑫等，2017）。研究證實，微生物發(fā)酵是何首烏減少肝毒性的新型炮制方法（林艷等，2018），目前國內外已有不少關于利用米根霉、黑曲霉、紅曲霉、乳酸桿菌和枯草桿菌等微生物對何首烏發(fā)酵炮制的研究。杜晨暉等（2008）研究發(fā)現，米根霉和菌株YMS-006可降解何首烏中的蒽醌類成分，而不破壞抗氧化、抗衰老活性物質二苯乙烯苷。Yu等（2012）選用米根霉發(fā)酵何首烏，結果表明發(fā)酵后不僅保留了何首烏的抗氧化活性，還降低了生何首烏的致瀉作用。范瓊和金明坤（2014）采用乳酸桿菌發(fā)酵何首烏，結果表明，發(fā)酵后何首烏的總多酚和類黃酮含量均增加，DPPH自由基清除和抗亞硝酸鹽清除效果明顯增加。鄧強等（2015）研究發(fā)現，蟲草真菌發(fā)酵何首烏后，其結合型蒽醌含量降低，游離型蒽醌成分提高。謝炎福等（2015）選用紅曲霉對何首烏進行雙向發(fā)酵，結果表明發(fā)酵后何首烏結合型蒽醌降低，其藥用價值得到提高。此外，Yousef等（2020）研究發(fā)現，枯草桿菌發(fā)酵酸棗仁可促進多糖生產，進而提高酸棗仁的抗腫瘤抗癌生理活性?！颈狙芯壳腥朦c】枯草桿菌是一類對人體安全的微生物，進入人體后可抑制致病菌，提高人體細胞免疫功能（王金斌等，2014）。本課題組前期研究發(fā)現何首烏經枯草桿菌發(fā)酵后其抗氧化性、抑制黑色素及抗高血壓等生理活性明顯提高（范瓊等，2019），初步驗證了枯草桿菌發(fā)酵何首烏具有可行性，但枯草桿菌發(fā)酵對何首烏結合型和游離型蒽醌、多酚類含量等抗氧化性成分及其抗癌抗腫瘤生理活性變化的影響尚不明確。【擬解決的關鍵問題】研究何首烏經枯草桿菌發(fā)酵后主要抗氧化成分的變化，并探討何首烏不同抗氧化成分變化與抗肝癌細胞增殖的相關性，為進一步研究何首烏發(fā)酵炮制方法及開發(fā)何首烏產品提供科學參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗用何首烏為韓國產，經韓國全北大學藥學院鑒定為蓼科植物何首烏的干燥根。兒茶酸標準品（批號：110809-201205）、大黃素標準品（批號：110756-201610）、大黃素甲醚標準品（批號：110758-201611）、大黃酚標準品（批號：110796-201615）和大黃酸標準品（批號：110757-201506）購自中國食品藥品檢定研究院;碘化丙啶（PI）MTT購自美國Sigma公司;磷酸鹽緩沖液（PBS）和二甲基亞砜（DMSO）購自美國Fisher公司;Minimum essential medium（MEM）培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）胰蛋白酶購自美國GIBCO公司;肝癌細胞HepG2購自韓國首爾大學細胞庫。其余試劑均為分析純。

試驗儀器設備：Waters 600高效液相色譜系統(tǒng)，配有可變波長紫外檢測器（美國Waters公司）;UV-1601型紫外可見分光光度計（日本Shimadzu公司）;旋轉蒸發(fā)儀EYELA N1000（日本東京理化公司）;冷凍干燥機（韓國Inchun公司）;Supra 21K高速離心機（韓國Inchun公司）;SANYO MCO-18AIC恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋公司）;Spoctra Max190型酶標儀（Molecular Devices公司）;生物安全柜（美國Thermo Fisher公司）;Nikon ECLIPSE TE2000-S顯微鏡（Nikon公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 樣品發(fā)酵方法 將生何首烏洗凈切片后60 ℃烘干，粉碎過100目篩，作為何首烏生品待用。稱取500 g何首烏生品粉末加入500 mL蒸餾水，充分混勻后，放入高壓滅菌鍋內121 ℃滅菌10 min，冷卻后接種2.50 mL枯草桿菌液，發(fā)酵72 h后，用冷凍干燥機將何首烏發(fā)酵溶液冷凍干燥12 h，粉碎過100目篩，作為何首烏發(fā)酵品待用。

1. 2. 2 樣品提取液制備

1. 2. 2. 1 乙醇提取液 取何首烏生品和發(fā)酵品粉末各5 g，加入50 mL 70%乙醇，靜置24 h，離心過濾，濾液用旋轉蒸發(fā)儀蒸干后用70%乙醇溶解定容補足至50 mL，所得濾液即為何首烏生品和何首烏發(fā)酵品乙醇提取液。

1. 2. 2. 2 水提取液 取何首烏生品和發(fā)酵品粉末各5 g，加入50 mL去離子水，在85 ℃水浴中回流5 h，離心過濾，濾液用旋轉蒸發(fā)儀蒸干后用蒸餾水溶解定容補足至50 mL，所得濾液即何首烏生品和何首烏發(fā)酵品的水提取液。

1. 2. 3 細胞系及培養(yǎng)條件 選用狀態(tài)良好的對數生長期肝癌細胞HepG2，在含10% FBS的MEM HEPES完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下進行常規(guī)培養(yǎng)，隔天更換1次營養(yǎng)液。

1. 2. 4 何首烏蒽醌含量測定

1. 2. 4. 1 RP-HPLC色譜條件 美國Halo C18色譜柱（4.6 mm×100 mm I.D.，2.7 ?m）;流動相：甲醇∶水∶磷酸=750∶250∶0.001;檢測波長：254 nm;柱溫：30 ℃;流速：0.5 mL/min;進樣量：10 ?L。

1. 2. 4. 2 供試液制備 精確稱取0.5000 g何首烏生品和發(fā)酵品粉末，加入70%甲醇25 mL，超聲提取30 min，將提取液過濾后蒸干。于蒸干殘渣中加入10 mL水和2 mol/L硫酸，后加入10 mL氯仿提取，共加入3次，合并每次氯仿提取液，蒸干，加入甲醇5 mL，得游離型蒽醌類供試溶液;水層提取液加入0.6 mL濃硫酸和10 mL氯仿，在80 ℃水浴中回流2 h，再用氯仿提取3次，每次10 mL，合并所有氯仿提取液，蒸干，加入甲醇5 mL，即得結合型蒽醌類供試溶液。

1. 2. 4. 3 標準曲線制備 將標準品大黃素、大黃素甲醚、大黃酚和大黃酸分別溶解于甲醇中，稀釋成不同濃度（150、75、37.5、18.75和9.375 ?g/L），分別吸取10 ?L，注入液相色譜儀。以峰面積積分值對含量做線性回歸，得其回歸方程，大黃素：y=18303700x-79061.2，大黃素甲醚：y=11864400x-40955.4。

1. 2. 5 總多酚含量測定 以總多酚中的兒茶素計算，配制1000 mg/L兒茶素標準溶液：準確稱取0.100 g兒茶素標準品，甲醇溶解，定容到100 mL;吸取標準溶液0、1.5、2.5、5.0、7.5和10.0 mL定容到50 mL。吸取上述標準溶液各0.1 mL，各加入1 mL 2%碳酸鈉溶液和0.1 mL Folin酚顯色劑，混勻后在30 ℃下水浴0.5 h后，在750 nm波長下測定吸光值。標準曲線回歸方程為y=0.00978x+0.02724，x為兒茶酚含量（mg），y為吸光值，R2=0.9998，線性良好。何首烏提取液總酚含量：取1.2.2.1和1.2.2.2何首烏生品和發(fā)酵品的乙醇提取液和水提取液各0.1 mL，依照上述方法測定后，根據標準曲線計算提取液中的總多酚含量。

1. 2. 6 樣品對肝癌細胞HepG2的抗增殖作用 肝癌細胞HepG2在MEM HEPES培養(yǎng)基下培養(yǎng)，以2×104個/孔分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入單細胞懸液180 μL，培養(yǎng)板外圍四周的孔不加細胞懸液，加入180 μL DMSO作空白對照。培養(yǎng)24 h后加入20 μL樣品水提取液，使發(fā)酵何首烏和生何首烏的濃度為0.025、0.05、0.15和0.25 g/L，每個濃度平行做6孔，重復3次。分別培養(yǎng)24、48和72 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入新鮮配制的5 g/mL MTT液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清液，加入200 μL DMSO后振蕩1 min，在酶標儀550 nm波長處讀取吸光值（OD），計算細胞抑制率。

細胞抑制率（%）= （1-[A/B]）×100

式中，A為樣品加藥的吸光值，B為1% DMSO空白對照的吸光值。

1. 2. 7 細胞形態(tài)學觀察 倒置顯微鏡下動態(tài)觀察肝癌細胞HepG2分別在50 μg/mL何首烏生品和發(fā)酵品水提取物作用48 h下的細胞形態(tài)變化并攝影。

1. 3 統(tǒng)計分析

每個樣品重復3次，所有數據用x±SD表示。采用Excel 2007對試驗數據進行方差分析。

2 結果與分析

2. 1 何首烏生品和發(fā)酵品的蒽醌類含量

由表1可知，何首烏中的蒽醌成分主要是大黃素和大黃素甲醚。何首烏生品中游離型大黃素和大黃素甲醚含量分別為1.00和0.56 mg/g，何首烏發(fā)酵品中游離型大黃素和大黃素甲醚含量分別為1.33和0.27 mg/g，發(fā)酵品中的總游離型蒽醌含量（1.60 mg/g）極顯著高于何首烏生品（1.56 mg/g）（P<0.01，下同）。何首烏生品和發(fā)酵品中結合型大黃素含量分別為1.01和0.71 mg/g，結合型大黃素甲醚含量分別為0.23和0.08 mg/g，何首烏經發(fā)酵后結合型大黃素和結合型大黃素甲醚含量均低于生品，導致何首烏發(fā)酵品中結合型蒽醌含量（0.79 mg/g）極顯著低于何首烏生品（1.24 mg/g）。

2. 2 何首烏生品和發(fā)酵品的總多酚含量

從表2可看出，何首烏生品和發(fā)酵品水提取液的總多酚含量分別為44.88和74.01 mg/g，70%乙醇提取液的總多酚含量分別為61.84和93.86 mg/g，何首烏發(fā)酵品水提取液和乙醇提取液的總多酚含量均高于何首烏生品，且差異極顯著。

2. 3 何首烏生品和發(fā)酵品對肝癌細胞HepG2的抑制率

由表3可知，何首烏生品在低濃度（0.025 g/L）、短時間（24 h）作用下對肝癌細胞HepG2的抑制作用最強，其細胞抑制率為4.2%。同一時間條件下隨著濃度增加，或同一濃度條件下隨著作用時間延長，何首烏生品對肝癌細胞HepG2的細胞抑制率均逐漸降低甚至變?yōu)樨撝担ㄘ撝当硎敬龠M細胞生長），表明何首烏生品對肝癌細胞HepG2生長的作用均由抑制轉變?yōu)榇龠M（或促進作用逐漸增強）。由表4可知，何首烏發(fā)酵品在低濃度（0.025 g/L）、短時間（24 h）作用下對肝癌細胞HepG2的抑制作用最弱，其細胞抑制率為9.9%。與何首烏生品相比，何首烏發(fā)酵品在相同條件下對肝癌細胞HepG2抑制率的變化趨勢相反，即同一時間條件下隨著濃度增加，或同一濃度條件下隨著作用時間延長，何首烏發(fā)酵品對肝癌細胞HepG2的細胞抑制率均逐漸增強。表明何首烏生品在高濃度長時間作用下會對肝癌細胞產生促進作用，但經枯草桿菌微生物發(fā)酵后則可抑制肝癌細胞生長。

2. 4 細胞形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡下對肝癌細胞HepG2的形態(tài)進行觀察，發(fā)現在何首烏生品水提取物作用下培養(yǎng)48 h后，肝癌細胞HepG2形態(tài)變化不明顯，相鄰細胞連接成片，形態(tài)舒展，細胞核大且明顯（圖1-A）;在何首烏發(fā)酵品水提取物作用下培養(yǎng)48 h后，肝癌細胞HepG2明顯收縮變小，與周圍細胞分離，細胞數量明顯減少（圖1-B）。表明何首烏發(fā)酵品對肝癌細胞HepG2增殖確實起到了抑制作用。

3 討論

蒽醌化合物是一類具有抗菌抗腫瘤活性的物質（李敏等，2018），其中結合型蒽醌具有瀉下作用，易引起腹痛、惡心等反應，是何首烏致瀉和肝毒性的主要成分，游離型蒽醌類物質具有抗氧化作用。本研究分析了何首烏經枯草桿菌發(fā)酵前后蒽醌含量的變化，結果表明何首烏經枯草桿菌發(fā)酵后結合型蒽醌含量降低，游離型蒽醌含量增加，與謝炎福等（2015）研究得出的通過微生物發(fā)酵可水解結合蒽醌中糖苷鍵，轉化為無毒性游離蒽醌的結果一致。郜丹等（2017）研究發(fā)現，大黃素甲醚是何首烏導致肝毒性的主要毒性成分之一。本研究發(fā)現何首烏經枯草桿菌發(fā)酵后游離型和結合型大黃素甲醚含量均降低，毒性下降，而游離型總蒽醌含量的增加則會促進其抗氧化性效果。同時，多酚有較強的抗氧化和清除自由基能力，具有抗腫瘤、抗老化、抗輻射等生理活性（王立峰等，2013）。本研究中何首烏經枯草桿菌發(fā)酵后總多酚含量明顯增加，進一步增強了何首烏抗氧化抗癌的生理活性。

本研究結果表明，低濃度的何首烏生品對肝癌細胞增殖有一定的抑制作用，但達到一定濃度和時間后，何首烏生品表現出促進肝癌細胞生長的作用，尤其是有肝病基礎上會促進肝癌細胞的生長從而引起相關性肝損傷，與徐靜等（2009）研究口服何首烏致肝毒害的結果相符，也驗證了張瑞晨等（2012）研究得出何首烏中大黃素及其他蒽醌類物質在一定高劑量濃度下具有肝毒性的結果。何首烏經枯草桿菌發(fā)酵后對肝癌細胞HepG2抗增殖作用變強，且隨著濃度增加和作用時間延長，抗增殖效果更明顯，其原因可能與蒽醌類物質和總多酚等抗氧化性成分發(fā)生變化有關。

目前，雖已有許多關于何首烏肝毒性的研究，但肝毒性成分和肝毒性機制相關研究較少（林艷等，2018）。本研究發(fā)現何首烏生品中結合型蒽醌含量較高，高濃度長時間作用下可促進肝癌細胞生長，而何首烏發(fā)酵品中的結合型蒽醌降低，多酚含量提高，對肝癌細胞生長有一定的抑制作用，初步推斷結合型蒽醌含量降低及總多酚含量增加均與肝癌細胞HepG2抗增殖效果有密切關系，結合型大黃素和大黃素甲醚為何首烏肝毒性的物質基礎。但由于本研究只針對性探討了何首烏蒽醌類和多酚類物質的變化，是否還有其他化學成分綜合影響何首烏的細胞損傷及其抗癌效果還需深入研究。

4 結論

枯草桿菌發(fā)酵可降低何首烏的毒性，增強其對肝癌細胞HepG2的抗增殖作用，驗證了結合型蒽醌含量與肝毒性的密切關系，初步揭示了何首烏微生物枯草桿菌炮制的減毒機制，表明使用枯草桿菌發(fā)酵何首烏的炮制方法是一種安全有效的炮制減毒方法，對開發(fā)相應何首烏炮制品有重要意義。

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（責任編輯 王 暉）

收稿日期：2019-12-17

基金項目：農業(yè)農村部農業(yè)國際交流與合作項目（BARTP-12-HBJ）;中國熱帶農業(yè)科學院基本科研業(yè)務費專項（1630082020004，1630082020003）

作者簡介：范瓊（1988-），主要從事農產品質量安全研究工作，E-mail：joanhee@126.com