雪膽多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性分析

邱磊　張蓉　趙艷　段柯兆　楊生超　張廣輝

摘要：【目的】?jī)?yōu)化雪膽水溶性和水不溶性多糖提取工藝，并分析其抗氧化活性，為雪膽多糖的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎捎脽崴岱ㄌ崛⊙┠懰苄远嗵恰A液浸提法提取雪膽水不溶性多糖，以多糖提取率為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化2種雪膽多糖的提取工藝條件，同時(shí)測(cè)定雪膽多糖清除羥基自由基（·OH）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和超氧陰離子（O^-₂·）的能力及還原能力?！窘Y(jié)果】影響熱水浸提雪膽水溶性多糖的因素排序?yàn)樘崛囟?料液比>提取時(shí)間，最佳提取工藝條件為：料液比1∶16、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間2.0 h，在此條件下，雪膽水溶性多糖提取率為（28.70±0.63）%;影響堿液浸提雪膽水不溶性多糖的因素排序?yàn)榱弦罕?提取溫度>提取時(shí)間，最佳提取條件為：料液比1∶18、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2.0 h，在此條件下，雪膽水不溶性多糖提取率為（31.43±0.42）%。雪膽水溶性多糖和水不溶性多糖對(duì)·OH和DPPH自由基均有較好的清除效果，2種雪膽多糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率在50.00%以上，質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率在50.00%以上;此外，2種多糖具有良好的還原能力和清除O[-2]·能力，均隨多糖質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。【結(jié)論】采用正交試驗(yàn)優(yōu)化獲得雪膽水溶性多糖熱水浸提工藝和雪膽水不溶性多糖堿液浸提工藝，提取操作簡(jiǎn)便，方法可行，提取的2種多糖均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可作為天然抗氧化資源加以利用。

關(guān)鍵詞： 雪膽;水溶性多糖;水不溶性多糖;提取工藝優(yōu)化;活性測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào)： S567.239 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）08-2020-08

Optimization of extraction process of polysaccharides from Hemsleya chinensis and its antioxidant activity

QIU Lei1， ZHANG Rong1， ZHAO Yan1，2*， DUAN Ke-zhao3， YANG Sheng-chao1，

ZHANG Guang-hui1

（1The Key Laboratory of Medicinal Plant Biology of Yunnan Province/National & Local Joint Engineering Research Center on Germplasm Innovation & Utilization of Chinese Medicinal Materials in Southwestern China， Yunnan Agricultural University，Kunming? 650201，China; 2College of Agriculture and Biotechnology， Yunnan Agricultural University， Kunming? 650201， China; 3Yunnan Kezhao Biological Technology Co.， Ltd.， Kunming? 650201， China）

Abstract：【Objective】To optimize the extraction of water-soluble and water-insoluble polysaccharides from Hemsleya chinensis， analyze its antioxidant activity， and? provide a theoretical basis for the further development and utilization of polysaccharides from H.chinensis. 【Method】The water-soluble polysaccharides of H.chinensis were extracted by hot water extraction and water-insoluble polysaccharides of H.chinensis were extracted by alkali extraction. Based on the single factor test and orthogonal experiment， the content of water-soluble polysaccharide and water-insoluble polysaccharide were optimized respectively. Then hydroxyl radical（·OH） scavenging ability，1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH） scavenging ability，superoxide anion（O[-2]·） scavenging ability and reducing power were analyzed. 【Result】The order of factors affecting the extraction of water-soluble polysaccharide from H.chinensis by hot water extraction were as follows：extraction temperature>solid-liquid ratio>extraction time，and the optimal extraction conditions of water-soluble polysaccharide of H.chinensis were as follow： the solid-liquid ratio was 1∶16，and the extraction temperature was 80 ℃，the extraction time was 2.0 h. Under this condition， the extraction rate of water-soluble polysaccharide was （28.70±0.63）%. The order of factors affecting the extraction of insoluble polysaccharides of H.chinensis by alkali extraction were as follow：solid-liquid ratio>extraction temperature>extraction time，and the best extraction conditions of insoluble polysaccharides of H.chinensis were as follow： the ratio of material to liquid was 1∶18， the extraction temperature was 70 ℃，the extraction time was 2.0 h. Under this condition， the extraction rate of water-insoluble polysaccharide was （31.43±0.42）%. The experimental results showed that two kinds of polysaccharide of H.chinensis on ·OH and DPPH free radical clearance had good effect. When the H.chinensis polysaccharide concentration was 0.5 mg/mL，the DPPH free radical clearance rate reached over 50.00%，when polysaccharide concentration was 0.1 mg/mL，the ·OH free radical clearance rate reached more than 50.00%. At the same time，the results showed that two kinds of polysaccharide had good ability associated with reduction capacity and O[-2]· scavenging， and the ability strengthened as the mass concentration of polysaccharide increased. 【Conclusion】The orthogonal experimental optimized H. chinensis water-soluble polysaccharide hot water extraction process and water-insoluble polysaccharide lye extraction process are simple and feasible，and soluble polysaccharide and insoluble polysaccharide from H. chinensis both have strong antioxidant activity，which can be used as natural antioxidant resources.

Key words： Hemsleya chinensis; water-soluble polysaccharide; water-insoluble polysaccharide; extraction process optimization; activity determination

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（81960691，81760694）; Yunnan Science and Technology Major Project（2018ZF011，2019ZF011）

0 引言

【研究意義】雪膽（Hemsleya chinensis）是葫蘆科雪膽屬植物，主要分布于我國(guó)西南的熱帶和亞熱帶地區(qū)，集中分布地區(qū)包括云南及四川的東南部（Li et al.，2010）。雪膽具有抗菌、抗炎等生物活性，為民間習(xí)用藥材，收載于《云南中草藥》《全國(guó)中草藥匯編》，臨床上常用于治療胃腸炎和急性扁桃體炎等疾病（李瑩等，2015），具有很高的藥用價(jià)值。有研究表明，雪膽塊莖中含有多糖，但不同產(chǎn)地及不同生長(zhǎng)期的含量差異明顯（楊王偉等，2014）。多糖是由多個(gè)相同或不同單糖間脫水形成的一類(lèi)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子聚合物，廣泛存在于各種動(dòng)植物體中，是一類(lèi)最豐富的天然產(chǎn)物，具有抗氧化、抗菌及抗病毒等多種生物活性（萬(wàn)芳等，2019;鐘麗霞等，2019）。來(lái)源于植物或真菌中的β-（1→3）-葡聚糖普遍被認(rèn)為具有免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤活性，而α-（1→3）-葡聚糖存在于細(xì)胞壁中，大多數(shù)不溶于水，且難以通過(guò)熱水浸提法進(jìn)行提取，常被認(rèn)為沒(méi)有生物學(xué)功能，對(duì)其研究較少，但可利用堿或酸溶液進(jìn)行處理，獲得細(xì)胞壁內(nèi)層的多糖組分。因此，優(yōu)化水提法和堿提法提取雪膽的2種多糖，對(duì)全面了解雪膽多糖活性，以及充分利用和挖掘雪膽資源均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】雪膽的化學(xué)成分及藥理研究已受到廣泛關(guān)注，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)雪膽屬10余種植物進(jìn)行了詳細(xì)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有50余種葫蘆烷型四環(huán)三萜，如雪膽甲素和雪膽乙素等（Chen et al.，2005，2012;Xu et al.，2014），以及20余種齊墩果烷型五環(huán)三萜類(lèi)化合物，如雪膽皂苷A和雪膽皂苷B等（Chen et al.，2003;林玉萍等，2003;徐金中等，2009）;豐富的雪膽三萜類(lèi)化合物具有抗HIV（Tian et al.，2008）、抗菌、抗炎（Zhi et al.，2008）和抗腫瘤（高申等，2012）等生物活性。關(guān)于雪膽有效成分的提取，喻世濤等（2006）以萃取壓力、溫度和時(shí)間為考察因素，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化獲得超臨界CO2流體萃取中華雪膽中齊墩果酸的最佳工藝條件（萃取壓力40 MPa，萃取溫度55 ℃，無(wú)水乙醇為夾帶劑，用量5%，萃取時(shí)間2 h，CO2流量20 kg/h）;周旋（2015）以水為提取溶劑，利用超聲方法預(yù)處理雪膽，獲得了超聲優(yōu)化提取雪膽素的最佳工藝條件（溫度55 ℃，溶液pH 4.0，超聲時(shí)間90 min），并有效縮短了結(jié)晶時(shí)間?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，已有學(xué)者對(duì)雪膽的化學(xué)成分提取物及活性開(kāi)展了研究，但有關(guān)雪膽水溶性多糖和水不溶性多糖的提取及其抗氧化活性研究尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以提取率為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)3因素3水平正交試驗(yàn)優(yōu)化熱水浸提雪膽水溶性多糖、稀堿溶液提取雪膽水不溶性多糖的工藝條件，并測(cè)定比較2種多糖清除羥基自由基（·OH）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和超氧陰離子（O[-2]·）的活性及還原能力，為雪膽高附加值副產(chǎn)物的挖掘及利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

雪膽采自云南柯兆生物科技有限公司雪膽種植基地，經(jīng)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)楊生超教授鑒定。粉碎過(guò)100目篩，密封于干燥器中備用。無(wú)水乙醇、苯酚和葡萄糖購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;氯仿、正丁醇和濃硫酸購(gòu)自重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司;冰醋酸、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、水楊酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸和三氯化鐵購(gòu)自西隴化工股份有限公司;以上試劑均為分析純。DPPH購(gòu)自Sigma公司。主要儀器設(shè)備：722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）、DRHH型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、DC-600高速多功能粉碎機(jī)（武義縣鼎藏日用金屬制品廠）和電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 雪膽水溶性多糖提取及樣品制備 稱(chēng)取雪膽粉末5.00 g，按樣品與水1∶16的料液比，提取溫度設(shè)為80 ℃，熱水浸提時(shí)間設(shè)為2.0 h，重復(fù)提取3次（因試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)增加提取次數(shù)，提取率有顯著增加趨勢(shì)，故采用重復(fù)3次，下同）后，離心收集上清液，濾渣用于水不溶性多糖提取。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮上清液至100 mL左右，加入活性炭進(jìn)行脫色，經(jīng)振蕩離心去除沉淀后，加入5倍Sevage液（氯仿∶正丁醇=5∶1），經(jīng)20 min振蕩并離心取上清液，加入1倍體積的無(wú)水乙醇混勻，放入4 ℃冰箱靜置12 h后，醇沉淀液2500 r/min離心3 min，沉淀物在80 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，即為雪膽水溶性多糖。

1. 2. 2 雪膽水不溶性多糖提取及樣品制備 取1.2.1的濾渣置于圓底燒瓶中，按濾渣與5%氫氧化鈉溶液1∶16的料液比、提取溫度設(shè)為70 ℃、提取時(shí)間設(shè)為2.0 h，重復(fù)提取3次后，離心棄沉淀，得到的上清液中加入冰醋酸溶液進(jìn)行中和，離心棄上清液，沉淀經(jīng)干燥后為雪膽水不溶性粗多糖。用3%氫氧化鈉溶解，加入活性炭進(jìn)行脫色，經(jīng)振蕩離心去除沉淀，在上清液中加入5倍Sevage液（氯仿∶正丁醇=5∶1），經(jīng)20 min振蕩并離心收集上清液，加入1倍體積的無(wú)水乙醇混勻，置于4 ℃冰箱12 h，離心后得到的沉淀物干燥即為雪膽水不溶性多糖。

1. 2. 3 雪膽多糖提取率測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.10 g干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品，加蒸餾水制成0.20 mg/L對(duì)照品溶液。吸取對(duì)照品溶液分別稀釋為0.04、0.08、0.12和0.16 mg/mL的梯度溶液;分別吸取上述溶液1 mL與等體積的5%苯酚溶液混合，再加入8 mL濃硫酸搖勻，于40 ℃水浴中保溫30 min，室溫冷卻，以加入蒸餾水的空白溶液作對(duì)照，在486 nm處測(cè)其吸光值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖質(zhì)量濃度和提取率：

提取率（%）=（C×V×m1×100）/（m×1000）

式中，C為提取液中多糖質(zhì)量濃度（μg/mL），V為定容體積（mL），m1為提取多糖重量（g），m為樣品重量（g）。

1. 2. 4 單因素試驗(yàn)

1. 2. 4. 1 雪膽水溶性多糖單因素試驗(yàn) 稱(chēng)取雪膽粉末5.00 g，按照1.2.1的方法提取雪膽水溶性多糖：在固定提取溫度80 ℃、料液比1∶16的條件下，分別提取1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h;在固定提取溫度80 ℃、提取時(shí)間2.0 h的條件下，分別以1∶12、1∶14、1∶16、1∶18和1∶20的料液比提取;在固定料液比1∶16、提取時(shí)間2.0 h的條件下，分別在50、60、70、80和90 ℃下提取。每組試驗(yàn)平行3次，考察單因素對(duì)雪膽水溶性多糖提取率的影響。

1. 2. 4. 2 雪膽水不溶性多糖單因素試驗(yàn) 按照1.2.2的方法提取雪膽水不溶性多糖：在固定提取溫度70 ℃、料液比1∶16的條件下，分別提取1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h;在固定提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2.0 h的條件下，分別以1∶12、1∶14、1∶16、1∶18和1∶20的料液比提取;在固定料液比1∶16、提取時(shí)間2.0 h的條件下，分別在50、60、70、80和90 ℃下提取。每組試驗(yàn)平行3次，考察單因素對(duì)雪膽水不溶性多糖提取率的影響。

1. 2. 5 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以雪膽水溶性多糖和水不溶性多糖的提取率為考察指標(biāo)，選擇提取時(shí)間、提取溫度和料液比為考察因素（表1），設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)。

1. 2. 6 雪膽多糖清除·OH能力測(cè)定 配制不同濃度梯度雪膽水溶性多糖和水不溶性多糖溶液，分別吸取2 mL，加入9 mmol/L硫酸亞鐵溶液和9 mmol/L過(guò)氧化氫溶液各2 mL混勻，置于黑暗處反應(yīng)20 min，再加入2 mL的9 mmol/L水楊酸鈉溶液，靜置反應(yīng)20 min后，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值A(chǔ)1，以水代替多糖溶液測(cè)定吸光值A(chǔ)0，以水代替過(guò)氧化氫溶液測(cè)定吸光值A(chǔ)2，以同等濃度梯度抗壞血酸溶液為對(duì)照。根據(jù)下式計(jì)算·OH清除率：

·OH清除率（%）= （1-[（A₁-A₂）/A₀]）×100

1. 2. 7 雪膽多糖清除DPPH自由基能力測(cè)定 配制不同濃度梯度雪膽水溶性多糖和水不溶性多糖溶液，分別吸取2 mL，與2 mL的0.2 mmol/L DPPH-無(wú)水乙醇溶液混勻，黑暗處?kù)o置30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值A(chǔ)1，以水代替多糖溶液測(cè)定吸光值A(chǔ)0，以乙醇溶液代替DPPH溶液測(cè)定吸光值A(chǔ)2，以同等濃度梯度抗壞血酸溶液為對(duì)照。根據(jù)下式計(jì)算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率（%）=（1-[（A₁-A₂）/A₀]）×100

1. 2. 8 雪膽多糖清除O[-2]·能力測(cè)定 配制不同濃度梯度雪膽水溶性多糖和水不溶性多糖溶液，分別吸取0.2 mL，加入5.7 mL的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8）， 25 ℃反應(yīng)20 min，再加入0.1 mL的6 mmol/L鄰苯三酚溶液，靜置反應(yīng)5 min，于360 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值A(chǔ)2，以水代替多糖溶液測(cè)定吸光值A(chǔ)1，以同等濃度梯度抗壞血酸溶液為對(duì)照。根據(jù)下式計(jì)算O[-2]·清除率：

O[-2]·清除率（%）=[（A₁-A₂）/A₁]×100

1. 2. 9 雪膽多糖還原能力測(cè)定 配制不同濃度梯度雪膽水溶性多糖和水不溶性多糖溶液，分別吸取2種多糖溶液1 mL與1 mL的2 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.6）混合，再加入1%鐵氰化鉀溶液和10%三氯乙酸溶液各1 mL，靜置反應(yīng)20 min后，加入0.1%三氯化鐵溶液0.25 mL，最后加入蒸餾水2 mL，靜置反應(yīng)20 min，于360 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，以同等濃度梯度抗壞血酸溶液為對(duì)照。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013整理數(shù)據(jù)，以SPSS 20.0中的LSD法進(jìn)行差異顯著性分析，并用SigmaPlot 12.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

以吸光值（y）為縱坐標(biāo)、葡萄糖對(duì)照品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），其線性方程為y=8.12x+0.01（R2=0.9997）。

2. 2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1 提取時(shí)間對(duì)雪膽多糖提取效果的影響 從圖2可看出，雪膽水溶性多糖提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為2.0 h時(shí)，雪膽水溶性多糖提取率達(dá)最大值（11.70%），顯著高于1.0、1.5和3.0 h的提取率（P<0.05，下同）;而雪膽水不溶性多糖提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈顯著上升趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為3.0 h時(shí)，雪膽水不溶性多糖提取率為3.19%，較2.0 h的提取率（2.66%）增加19.92%。從能源損耗等因素考慮，雪膽水溶性多糖和水不溶性多糖的提取時(shí)間以2.0 h為宜。

2. 2. 2 料液比對(duì)雪膽多糖提取效果的影響 由圖3可知，雪膽水溶性多糖提取率隨著料液比的減小呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，料液比為1∶16時(shí)，提取率達(dá)最大值（16.12%）;雪膽水不溶性多糖提取率隨料液比的減小呈緩慢上升趨勢(shì)，當(dāng)料液比達(dá)1∶18后，雪膽水不溶性多糖提取率略有下降。隨著提取溶劑體積的增大，雪膽多糖提取率增加，同時(shí)綜合考慮成本等因素，雪膽水溶性多糖和水不溶性多糖提取的料液比選擇1∶18為宜。

2. 2. 3 提取溫度對(duì)雪膽多糖提取效果的影響 由圖4可知，雪膽水溶性多糖提取率隨提取溫度的升高呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度達(dá)80 ℃時(shí)，提取率達(dá)最大值（9.90%），顯著高于其他提取溫度的提取率，超過(guò)80 ℃后，雪膽水溶性多糖提取率有所下降;而雪膽水不溶性多糖提取率隨提取溫度的升高呈先顯著上升后趨于平穩(wěn)的變化趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度達(dá)70 ℃后，雪膽水不溶性多糖提取率無(wú)顯著變化（P>0.05），提取溫度為80 ℃時(shí)達(dá)最大值（2.22%）。高溫有可能造成多糖結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的降低。因此，雪膽水溶性多糖和水不溶性多糖的提取溫度選擇80 ℃較合適。

2. 3 雪膽多糖提取正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

雪膽水溶性多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，從表中可知影響熱水浸提雪膽水溶性多糖的因素排序?yàn)樘崛囟?料液比>提取時(shí)間;根據(jù)正交試驗(yàn)k值結(jié)果，雪膽水溶性多糖提取的理論優(yōu)化方案為A2B2C2，但根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際及水溶性多糖提取率的綜合考慮，選擇優(yōu)化組合為A1B2C2，即料液比1∶16、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間2.0 h。進(jìn)行最佳工藝條件驗(yàn)證，稱(chēng)取雪膽粉末10.00 g，在料液比1∶16、提取溫度80 ℃的條件下回流提取2.0 h，提取結(jié)束對(duì)提取液進(jìn)行抽濾，測(cè)定雪膽水溶性多糖提取率。經(jīng)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到雪膽水溶性多糖提取率為（28.70±0.63）%，說(shuō)明該工藝組合提取效果較穩(wěn)定。

雪膽水不溶性多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，從表中可知影響堿液浸提雪膽水不溶性多糖的因素排序?yàn)榱弦罕?提取溫度>提取時(shí)間，篩選出最佳工藝組合為A2B1C2，即料液比1∶18、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2.0 h。盡管雪膽水不溶性多糖最佳工藝組合出現(xiàn)在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，但仍有必要對(duì)獲得的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證。稱(chēng)取雪膽粉末10.00 g，以1.2.2的方法提取雪膽水不溶性多糖，在料液比1∶18、提取溫度70 ℃的條件下回流提取2.0 h，測(cè)定雪膽水不溶性多糖提取率。經(jīng)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到雪膽水不溶性多糖提取率為（31.43±0.42）%，說(shuō)明該工藝組合提取效果較穩(wěn)定。

2. 4 雪膽多糖活性測(cè)定結(jié)果

2. 4. 1 雪膽多糖清除·OH能力測(cè)定結(jié)果 由圖5可知，雪膽水溶性多糖對(duì)·OH的清除率稍低于抗壞血酸，在0.5～0.7 mg/mL質(zhì)量濃度區(qū)間的量效關(guān)系較好，表明雪膽水溶性多糖對(duì)·OH具有良好的清除能力，清除率最高可達(dá)83.33%;在0.2 mg/mL后，雪膽水不溶性多糖對(duì)·OH的清除率與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，雪膽水不溶性多糖和抗壞血酸對(duì)·OH的清除能力增強(qiáng)趨勢(shì)明顯，表明雪膽水不溶性多糖對(duì)·OH有較強(qiáng)的清除能力。

2. 4. 2 雪膽多糖清除DPPH自由基能力測(cè)定結(jié)果

由圖6可知，雪膽水溶性多糖在0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度的增加對(duì)DPPH自由基的清除能力也逐漸增強(qiáng)，0.5 mg/mL之后雪膽水溶性多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力趨于平穩(wěn)，與抗壞血酸相比，雪膽水溶性多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力在0.5 mg/mL之后差距變大，但其在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基具有良好的清除能力;雪膽水不溶性多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力隨多糖質(zhì)量濃度的增加而加強(qiáng)，具有良好的量效關(guān)系，雪膽水不溶性多糖對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力。

2. 4. 3 雪膽多糖清除O[-2]·能力測(cè)定結(jié)果 由圖7可知，雪膽水溶性多糖對(duì)O[-2]·的清除率低于抗壞血酸，但總體上隨樣品質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，表明雪膽水溶性多糖具有一定的O[-2]·清除能力;雪膽水不溶性多糖對(duì)O[-2]·的清除能力稍弱于抗壞血酸，但總體上呈現(xiàn)出隨樣品質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)的變化趨勢(shì)，表明雪膽水不溶性多糖具有一定的O[-2]·清除能力，且稍強(qiáng)于雪膽水溶性多糖。

2. 4. 4 雪膽多糖還原能力測(cè)定結(jié)果 由圖8可知，雪膽水溶性多糖和水不溶性多糖的還原能力均隨樣品質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，其中雪膽水不溶性多糖的還原能力稍強(qiáng)于水溶性多糖，但二者均弱于抗壞血酸。

3 討論

提取多糖的方法主要有溶劑提取、酶解、超聲波輔助提取、微波輔助提取和超臨界輔助提取等（李瑤佳，2019），其中溶劑提取法操作簡(jiǎn)便，條件溫和，對(duì)儀器設(shè)備要求低，是目前工業(yè)上提取多糖應(yīng)用最多的一種方法（朱玲等，2017），被廣泛用于植物多糖的提取，如羊肚菌多糖提取（周益帆等，2019）、芒果皮渣多糖提?。ㄚw巧麗等，2019）等。本研究采用熱水浸提法提取雪膽水溶性多糖、堿液提取法提取雪膽水不溶性多糖，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化得到2種雪膽多糖提取最佳工藝條件。在單因素試驗(yàn)中，延長(zhǎng)提取時(shí)間，雪膽水溶性多糖隨時(shí)間的變化呈先上升后下降趨勢(shì)，而雪膽水不溶性多糖的提取率呈不斷增加趨勢(shì)，可能是由于2種雪膽多糖隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷溶解于提取溶劑水或堿性溶液中，導(dǎo)致一定時(shí)間范圍內(nèi)多糖提取率不斷提高。料液比也會(huì)影響多糖提取率，提取獲得的雪膽水溶性多糖隨料液比減小呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，而水不溶性多糖隨料液比減小而逐漸趨于穩(wěn)定，推測(cè)是由于料液比高時(shí)，雪膽水不溶性多糖在溶劑中的溶解度早已達(dá)到飽和，從而抑制了剩余雪膽水不溶性多糖的釋放。此外，提取溫度也影響雪膽多糖提取率，因?yàn)樘崛囟冗^(guò)低時(shí)，雪膽多糖在溶劑中的溶解度也低，從而抑制了剩余雪膽水溶性多糖的釋放，而當(dāng)高溫時(shí)可能降低多糖結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

利用DPPH法、·OH清除法、O[-2]·清除法和還原能力測(cè)定法評(píng)價(jià)植物有效成分的抗氧化作用，因操作簡(jiǎn)便、快速、有效而應(yīng)用廣泛。本研究通過(guò)測(cè)定雪膽水溶性多糖和水不溶性多糖對(duì)·OH、DPPH自由基和O[-2]·的清除能力及還原能力，并與抗壞血酸對(duì)比，發(fā)現(xiàn)2種雪膽多糖均具有較強(qiáng)的自由基清除能力和還原能力，能有效清除·OH、DPPH自由基和O[-2]·，且清除能力與還原能力隨多糖樣品質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，其中雪膽水不溶性多糖的抗氧化活性明顯高于水溶性多糖。相關(guān)研究表明，中草藥提取物如中草藥多糖作為飼料添加劑，能有效改善動(dòng)物腸道微生物區(qū)系，提高免疫力（劉惠，2007）。僧曉蘭（2016）以峨眉雪膽原料制備成微丸，作為中草藥飼料添加劑能增強(qiáng)斷奶仔豬的抗氧化能力，顯著增加血清超氧化物歧化酶（SOD）活性，且有長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)影響，同時(shí)能提高仔豬谷胱甘肽（GSH）活性，在一定程度上降低丙二醛（MDA）含量。因此，本研究結(jié)果可為雪膽水不溶性多糖的高值化利用提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化獲得雪膽水溶性多糖熱水浸提工藝和雪膽水不溶性多糖堿液浸提工藝，提取操作簡(jiǎn)便，方法可行，提取的2種多糖均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可作為天然抗氧化資源加以利用。

參考文獻(xiàn)：

高申，于孟可，魏佳慧，劉百歌. 2012. 雪膽甲素對(duì)人非小細(xì)胞肺癌 A549 細(xì)胞增殖的抑制作用[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志，25（1）：69-71. [Gao S，Yu M K，Wei J H，Liu B G. 2012. Inhibitory effect of cucurbitacinⅡa on proliferation of human non-small cell lung cancer A549 cells[J]. Chinese Journal of Biologicals，25（1）：69-71.]

李瑤佳. 2019. 植物多糖提取方法研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，（1）：222-223. [Li Y J. 2019. Research progress on extraction methods of plant polysaccharides[J]. Modern Agricultural Science and Technology，（1）：222-223.]

李瑩，徐曉婷，鄭重飛，李玲，姚慶強(qiáng). 2015. 雪膽屬植物的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J]. 中草藥， 46（18）：2800-2808. [Li Y，Xu X T，Zheng Z F，Li L，Yao Q Q. 2015. Research progress on chemical constituents and biological activities of plants from Hemsleya Cogn.[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs，46（18）：2800-2808.]

林玉萍，邱明華，李忠榮，高旭紅. 2003. 古藺雪膽中的新三萜皂苷[J]. 云南植物研究，25（2）：235-240. [Lin Y P，Qiu M H，Li Z R，Gao X H. 2003. New triterpenoid glycosides from Hemsleya penxianensis var. gulinensis[J]. Acta Botanica Yunnanica，25（2）：235-240.]

劉惠. 2007. 中草藥復(fù)合粗多糖對(duì)斷奶仔豬腸道消化生理影響的研究[D]. 長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué). [Liu H. 2007. Study on effects of compound polysaccharides on digestion physiology of weaned piglets[D]. Changsha：Hunan Agricultural University.]

僧曉蘭. 2016. 峨眉雪膽微丸的制備及對(duì)斷奶仔豬免疫功能和抗氧化性能的影響[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué). [Seng X L. 2016. Preparation of Emei Hemsleya pellets and its effects on immune function and antioxidant capacity in weaned piglets[D]. Yaan：Sichuan Agricultural University.]

萬(wàn)芳，張冕，李瑤瑤. 2019. 白芨多糖載納米粒對(duì)肝癌小鼠抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，29（2）：14-17. [Wan F，Zhang M，Li Y Y. 2019. Antitumor activity of Bletilla striata polysaccharide-loaded nanoparticles on liver cancer in mice[J]. China Journal of Modern Medicine，29（2）：14-17.]

徐金中，董建勇，葉筱琴，馬喜彥，張紅葉. 2009. 中華雪膽皂苷類(lèi)化學(xué)成分研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，34（3）：291-293. [Xu J Z，Dong J Y，Ye X Q，Ma X Y，Zhang H Y. 2009. Studies on triterpenoid saponins in Hemsleya chensnsis[J]. China Journal of Chinese Material Medica，34（3）：291-293.]

楊王偉，雷祖培，王為民，梁衛(wèi)青，周瑩瑩，金孝鋒. 2014. 不同產(chǎn)地和不同生長(zhǎng)期的浙江雪膽有效成分積累變化[J]. 中國(guó)中藥雜志，39（16）：3123-3127. [Yang W W，Lei Z P，Wang W M，Liang W Q，Zhou Y Y，Jin X F. 2014. Changed accumulation of active ingredient in different localities and growth period of Hemsleya zhejiangensis（Cucurbitaceae）[J]. China Journal of Chinese Material Medica，39（16）：3123-3127.]