藤茶高通量轉錄組分析及黃酮類化合物合成相關基因挖掘

許明　楊志堅　黃學敏　鄭金貴

摘要：【目的】分析藤茶高通量轉錄組序列，從中挖掘出黃酮類化合物合成相關基因，為進一步揭示藤茶黃酮類化合物生物合成調控機制提供理論參考。【方法】分別采集藤茶的幼葉和成熟葉，提取其總RNA構建cDNA文庫，采用Illumina HiSeqTM 4000高通量測序平臺對藤茶葉片進行轉錄組測序，經過濾處理后運用Trinity組裝，將獲得的Unigene與Nr、Nt、Pfam、Swiss-Prot、GO、KO和KOG 7個數(shù)據(jù)庫進行比對注釋，并預測Unigenes的編碼區(qū)序列（CDS）;基于KEGG信號通路富集分析，發(fā)掘藤茶黃酮類化合物合成相關基因?！窘Y果】藤茶葉片轉錄組測序獲得82126236條原始測序序列（Raw reads），過濾處理后得到80156972條高質量序列（Clean reads），進一步組裝拼接得到92472條Unigenes，平均長度為1208 bp，N50長度為1780 bp，其中，至少在1個數(shù)據(jù)庫注釋的Unigenes有84217條，占Unigenes總數(shù)的91.07%，有8944條Unigenes在7個數(shù)據(jù)庫均被注釋，占Unigenes總數(shù)的9.67%。在GO數(shù)據(jù)庫成功注釋的41116條Unigenes可分為生物學過程、細胞組分和分子功能三大類，共56個小類;在KOG數(shù)據(jù)庫注釋的14553條Unigenes可分成25類，其中，一般功能預測注釋成功的Unigenes最多（1946條）;其次是翻譯后修飾、蛋白質翻轉、分子伴侶（1776條），參與次生代謝物質的生物合成、轉運和降解的Unigenes較少，僅有319條;KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，共有15262條Unigenes注釋到128條KEGG信號通路，以注釋為代謝的Unigenes最多，為8694條，其中篩選獲得有98個黃酮類化合物合成相關基因，分別編碼苯丙烷代謝通路的3種關鍵酶和類黃酮代謝通路的14種關鍵酶。藤茶葉片轉錄組Unigenes與Swiss-Prot和Nr數(shù)據(jù)庫比對，獲得52582條CDS序列，ESTScan 3.0.3預測獲得35535條CDS序列。【結論】藤茶在細胞過程、代謝過程、單有機體過程、細胞和細胞部分、結合和催化活性能力分布的基因較豐富，在一般功能、翻譯、翻譯后修飾、蛋白質翻轉及分子伴侶的基因表達量較高，具有較強的碳水化合物代謝能力。多種關鍵酶基因參與藤茶黃酮類化合物的生物合成，推測其生物合成途徑存在多條分支，調控機制也較復雜。

關鍵詞： 藤茶;轉錄組;黃酮類化合物;基因挖掘;高通量測序

中圖分類號： S571.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）08-1797-09

Transcriptome analysis of Ampelopsis grossedentata （Hand. Mazz.） W. T. Wang and mining of putative genes involved in flavonoid biosynthesis

XU Ming1，2， YANG Zhi-jian1，2， HUANG Xue-min3， ZHENG Jin-gui1，2*

（1Key Laboratory of Crop Biotechnology， Fujian Province University， Fuzhou? 350002， China; 2College of Agriculture，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou? 350002， China; 3Forestry Bureau of Yongchun County，

Fujian Province， Yongchun， Fujian? 362600）

Abstract：【Objective】The study aimed to obtain the high throughput transcriptome sequence? information and explore the genes related to the flavonoid biosynthesis in Ampelopsis grossedentata（Hand. Mazz.） W. T. Wang. It provided the theoretical basis for further revealing the biosynthetic pathway and regulation mechanism of flavonoids in A. grosse-dentata. 【Method】The young and mature leaves of A. grossedentata were collected respectively for the extraction of total RNA which was used to construct cDNA library. The transcriptome of A. grossedentata leaves was sequenced using an Illumina HiSeqTM 4000 high throughput platform. The sequences were assembled with Trinity after data filtering. The obtained Unigenes were compared and annotated with seven databases， including Nr， Nt， Pfam， Swiss-Prot， GO，KO and KOG， and the coding region sequences（CDS） were predicted by Blast and ESTScan software. KEGG signal pathway enrichment analysis was used to identify genes related to flavonoid synthesis in A. grossedentata. 【Result】A total of 82126236 raw reads were obtained with the transcriptome sequencing. After reads filtering， a total of 80156972 clean reads were obtained， which were used to assemble and merge into 92472 Unigenes with an average length of 1208 bp and a N50 length of 1780 bp.Of these unigenes，? 84217（91.07%） were successfully annotated in at least one of the Nr， Nt， Swiss-Prot， KEGG， COG and GO databases， and 8944 unigenes（9.67%） were annotated in all databases. Among them，41116 Unigenes annotated in GO database were matched to 56 sub-classes of biological function， cell component and molecular function，and 14553 unigenes annotated in KOG database were divided into 25 sub-classes. The number of the unigenes annotated in the general function was the greatest（1946）; the post translational modification， protein turn over and chaperones was the second（1776）; the unigenes involved in the biosynthesis of secondary metabolites， transportation and degradation were less（only 319）. The KEGG signal pathway enrichment analysis results showed that a total of 15262 unigenes were participated in 128 KEGG pathways. The unigenes annotated with metabolism were the greatest in number（8694）， 98 of which participated in the flavonoid synthesis pathway of A. grossedentata. They encoded three key enzymes of phenylpropane metabolic pathway and 14 key enzymes of flavonoid metabolic pathway. By comparing with Swiss-prot and Nr database， 52582 CDS were obtained. A total of 35535 CDS sequences were obtained via ESTScan 3.0.3 prediction. 【Conclusion】A. grossedentata has abundant genes related to cell process， metabolic process， single organism process， cell and cell part， binding and catalytic activities. It shows a high level of gene expression in general function， translation， post translational modification， protein turn over， chaperones.And it has a strong carbohydrate metabolic ability as well. Many key enzymes are involved in the biosynthesis of flavonoids in A. grossedentata， suggesting that there might be multiple branches in the biosynthetic pathway， and the regulation mechanisms might also be complex.

Key words： Ampelopsis grossedentata（Hand. Mazz.） W. T. Wang; transcriptome; flavonoids; gene mining; high-throughput sequencing

Foundation item： National Science and Technology Support Program（2013BAD01B05）;Science and Technology Innovation Project of Fujian Agriculture and Forestry University（KFA17424A）

0 引言

【研究意義】藤茶[Ampelopsis grossedentata（Hand.Mazz.） W. T. Wang]是我國栽培歷史悠久的一種茶藥兩用植物，其主要藥效成分為黃酮類化合物，具有良好的開發(fā)利用前景（何桂霞等，2007;冉京燕等，2016）。但由于藤茶基因組及轉錄組數(shù)據(jù)缺乏，遺傳背景尚不清楚，嚴重制約了藤茶種質資源鑒定和保護、遺傳多樣性分析及分子育種等工作的開展。此外，產地、栽培條件等諸多因素均會導致藤茶黃酮含量存在明顯差異，從而影響藤茶產品的質量和療效（王家勝等，2014;冉京燕等，2016）。因此，開展藤茶轉錄組及其黃酮類化合物的代謝途徑研究，了解藤茶遺傳信息及其藥效成分合成的分子調控機制，對藤茶種質資源的持續(xù)高效利用及藥用品質提升具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】迄今，國內外針對藤茶的研究主要集中在化學成分的分離鑒定及藥理作用等方面（Zhang et al.，2006;譚沙等，2015），其基因水平的相關研究僅有少量報道。黃海波（2008）從生理生化層面分析了藤茶不同季節(jié)苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性與藤茶黃酮含量變化的相關性;付明等（2013）利用RT-PCR克隆藤茶查爾酮合成酶（CHS）基因;許明等（2017）篩選了適用于藤茶不同組織實時熒光定量PCR分析的內參基因。轉錄組測序是指利用第二代高通量測序技術進行cDNA測序，能在無參考基因組信息的情況下，對某一物種的轉錄組進行全面分析，現(xiàn)已成為揭示特定生物學過程分子機制的一種有效手段（Wilhelm and Landry，2009;嚴志祥等，2019）。目前，利用高通量測序技術已完成較多藥用植物的轉錄組分析，并鑒定出大量與黃酮類化合物合成相關的基因。馬婧等（2016）對草麻黃進行轉錄組測序分析，鑒定出黃酮類化合物代謝相關基因70個;劉偉等（2018）對銀杏不同生長時期葉片進行轉錄組測序分析，篩選出50個銀杏類黃酮生物合成相關的候選基因;鄒福賢等（2019）對3個生長時期的金線蓮進行轉錄組測序，找出22個黃酮類代謝通路上的差異表達基因，并結合其黃酮類成分，繪制出相應的生物合成途徑;Yang等（2019）對不同季節(jié)的大葉蛇葡萄葉片進行轉錄組分析，鑒定出31個類黃酮生物合成相關基因和50個黃酮轉運和生物修飾相關基因?！颈狙芯壳腥朦c】至今，鮮見有關藤茶轉錄組測序及其黃酮類化合物合成相關基因挖掘的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】利用Illumina HiseqTM 4000高通量測序平臺對藤茶葉片進行轉錄組測序，將獲得的序列信息進行拼接和組裝，并利用生物大分子公共數(shù)據(jù)庫對所得基因進行功能注釋和分類，挖掘出藤茶黃酮類化合物生物合成相關基因，為進一步揭示黃酮類化合物生物合成調控機制提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試藤茶引自福建尤溪縣下村林場。Qubit RNA Assay Kit購自美國Invitrogen公司。主要儀器設備：NanoDrop ND2000超微量分光光度計（Thermo，美國）、Agilent 2100生物分析儀（Agilent，美國）。

1. 2 總RNA提取

分別采集藤茶的幼葉和成熟葉，參照許明等（2015）的方法提取其總RNA，并采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。利用Qubit RNA Assay Kit測定RNA濃度。

1. 3 cDNA文庫構建及測序

將上述2種葉片RNA等比例混合成1 mg樣品，以干冰保存送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行cDNA文庫構建，并采用Illumina HiSeqTM 4000高通量測序平臺進行轉錄組測序。

1. 4 轉錄組組裝

對測序獲得的原始測序序列（Raw reads）進行過濾處理，得到高質量序列（Clean reads），然后采用Trinity對其進行拼接，將得到的轉錄本（Transcript）作為參考序列，并取每條基因中最長的轉錄本作為Unigene，用于后續(xù)轉錄組序列分析。

1. 5 基因功能注釋和分類

為獲得全面的基因功能信息，將拼接得到的Unigene分別在Nr、Nt、Pfam、Swiss-Prot、GO、KO和KOG等7個數(shù)據(jù)庫中進行功能注釋和分類，以及進行KEGG信息通路富集分析。

1. 6 編碼區(qū)序列（CDS）預測及分析

按照Swiss-Prot和Nr數(shù)據(jù)庫的優(yōu)先級順序，將藤茶葉片轉錄組Unigene進行BLAST比對。從比對上的序列中提取出Transcript開放閱讀框（ORF），并將CDS序列翻譯成氨基酸序列。未比對上或比對上未預測出結果的序列則采用ESTScan 3.0.3預測其ORF，根據(jù)CDS序列翻譯獲得氨基酸序列。

2 結果與分析

2. 1 轉錄組測序及組裝結果

藤茶葉片轉錄組測序獲得82126236條Raw reads，過濾處理后得到80156972條Clean reads，有效測序長度達12.02 Gb，堿基錯誤率為0.02%，Q20和Q30分別為97.30%和92.97%，GC含量為43.36%，說明測序質量好，可用于后續(xù)分析。

采用Trinity將所有Clean reads拼接得到153528條轉錄本，平均長度為841 bp，N50為1541 bp，其中，以長度200～500 bp的序列數(shù)量最多，為83963條，占54.69%;以長度>2000 bp的序列數(shù)量最少，為16368條，占10.66%。將轉錄本進一步組裝拼接得到92472條Unigenes，平均長度為1208 bp，N50為1780 bp，其中，以長度500～1000 bp的序列數(shù)量最多，為26916條，占29.11%;以長度>2000 bp的序列數(shù)量最少，為16368條，占17.70%（表1）。

2. 2 Unigene功能注釋結果

將92472條Unigenes分別在7個數(shù)據(jù)庫進行比對注釋，每個數(shù)據(jù)庫中注釋成功的Unigenes數(shù)量及其占Unigenes總數(shù)的比例如表2所示。在7個數(shù)據(jù)庫中，至少在1個數(shù)據(jù)庫注釋的Unigenes有84217條，占Unigenes總數(shù)的91.07%，其中，在Nt數(shù)據(jù)庫中注釋的Unigenes最多（80266條），占總數(shù)的86.80%，其次是Nr數(shù)據(jù)庫（58148條），占Unigenes總數(shù)的62.88%，KOG數(shù)據(jù)庫中注釋的Unigenes數(shù)量最少（14553條），占Unigenes總數(shù)的15.73%;有8944條Unigenes在7個數(shù)據(jù)庫均被注釋，占Unigenes總數(shù)的9.67%。

基于Nr數(shù)據(jù)庫比對注釋的結果，統(tǒng)計并繪制比對上的物種分布情況（圖1），發(fā)現(xiàn)注釋到葡萄的Unigenes數(shù)量最多，所占比例高達88.17%，遠高于可可（1.17%）、蓮（1.11%）、麻風樹（0.69%）、甜橙（0.60%）及其他物種（8.27%），究其原因可能是藤茶與葡萄同屬于葡萄科植物，親緣關系更近。

2. 3 Unigene的GO功能分類結果

從圖2可知，在GO數(shù)據(jù)庫成功注釋的41116條Unigenes可分為生物學過程、細胞組分和分子功能三大類，共56個小類。由于存在同一個Unigene注釋到不同功能的情況，有106044條Unigenes注釋歸屬于生物學過程，其中，以細胞過程、代謝過程和單有機體過程最多;有66390條Unigenes注釋歸屬于細胞組分，其中以細胞和細胞部分最多;有51272條Unigenes注釋歸屬于分子功能，其中，主要以結合和催化活性為主。

2. 4 Unigene的KOG功能分類結果

通過KOG注釋可將14553條Unigenes分成25類（圖3），其中，一般功能預測注釋成功的Unigenes最多（1946條）;其次是翻譯后修飾、蛋白質翻轉、分子伴侶（1776條）;翻譯、核糖體結構和生物起源注釋成功的Unigenes有1250條;參與次生代謝物質的生物合成、轉運和降解的Unigenes較少，僅有319條。此外，有988條未知功能的Unigenes有待進一步研究。

2. 5 Unigene的KEGG信號通路富集分析結果

利用KEGG數(shù)據(jù)庫中的通路數(shù)據(jù)庫（Pathway databases）對Unigene的功能進行富集分析（表3），結果發(fā)現(xiàn)共有15262條Unigenes能注釋到128條KEGG信號通路。這些通路可分成細胞進程、環(huán)境信號處理、遺傳信息處理、代謝和有機系統(tǒng)五大類。其中，注釋為代謝的Unigenes最多，為8694條，占注釋Unigenes總數(shù)的56.97%，其次是注釋為遺傳信息處理的Unigenes，為4120條，占注釋Unigenes總數(shù)的26.99%。

KEGG信號通路富集分析結果（表3）表明，在五大類通路中，與代謝有關的通路最多，有98條，占所有通路的76.56%，其中，Unigene注釋最多為碳水化合物（1671條），其次是氨基酸代謝（1176條）。有512條Unigenes參與苯丙素類、生物堿、黃酮、花青素等生物合成相關的11個其他次生代謝標準通路。

2. 6 Unigene的CDS序列預測結果

按照Swiss-Prot和Nr數(shù)據(jù)庫的優(yōu)先級順序，將藤茶葉片轉錄組Unigene在這2個蛋白數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，獲得52582條CDS序列;將未比對上或比對上未預測出結果的序列采用ESTScan 3.0.3進行CDS預測，結果獲得35535條CDS序列。在獲得的88117條CDS序列中，以長度0～200 nt的CDS序列最多，有52828條;其次是長度201～400和401～600 nt的CDS序列，分別為20564和8796條，其余長度范圍的CDS序列均不足4000條（圖4）。

2. 7 黃酮類物質生物合成相關基因挖掘及分析結果

黃酮類化合物的主要合成途徑：首先通過苯丙烷途徑將苯丙氨酸轉化為香豆酰-CoA，然后香豆酰-CoA進入黃酮合成途徑，與3分子丙二酰CoA結合生成查爾酮，再經分子內的環(huán)化反應生成二氫黃酮類化合物，最后通過分支途徑合成黃酮、異黃酮、黃酮醇、黃烷醇和花色素等黃酮類化合物（鄒麗秋等，2016）?；贙EGG信號通路富集分析結果，共篩選獲得98個藤茶黃酮類化合物合成相關基因（表4），其中18個映射到苯丙烷代謝通路上，分別編碼苯丙氨酸向香豆酰-CoA轉化所需的3種關鍵酶：苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）和對香豆酸—輔酶A連接酶（4CL）;有80個Unigenes映射到類黃酮類化合物代謝通路上，編碼該通路中的14種關鍵酶，包括從香豆酰-CoA向二氫黃酮轉化所需的查爾酮合成酶（CHS）和查耳酮異構酶（CHI），以及從二氫黃酮到黃酮醇和黃烷醇合成支路所需的黃烷酮-3-羥化酶（F3H）、類黃酮-3-羥化酶（F3H）、類黃酮-3，5-羥化酶（F35H）、黃酮醇合成酶（FLS）、二氫黃酮醇還原酶（DFR）、花青素還原酶（ANR）、無色花色素還原酶（LAR）、無色花色素雙加氧酶（LDOX）、香豆酰酯3羥化酶（C3H）、咖啡酰輔酶A-O甲基轉移酶（CCOAOMT）、黃酮醇3-甲基轉移酶（F3OMT）和莽草酸羥基肉桂轉移酶（HCT）共12種。

3 討論

本研究利用第二代高通量測序技術對藤茶葉片轉錄組進行測序分析，共獲得92472條Unigenes。與其他藥用植物比較，藤茶轉錄組測序得到的Unigenes多于銀杏（劉偉等，2018）、大葉蛇葡萄（Yang et al.，2019）和金線蓮（鄒福賢等，2019）等，與山茱萸（朱畇昊等，2017）和掌葉大黃（李歡等，2018）相當，究其原因可能與物種基因型和取材等因素有關。從Unigene長度來看，本研究得到Unigene的平均長度為1208 bp，N50為1780 bp，二者均明顯高于連翹（861 bp，1497 bp）（王興春等，2015）、草麻黃（453 bp，525 bp）（馬婧等，2016）及短絲木犀（697 bp，1200 bp）（陳林等，2016）等，與櫻椒樹（1116 bp，1768 bp）（Zhou et al.，2015）和掌葉大黃（1108 bp，1794 bp）（李歡等，2018）等相近。N50是評價組裝序列完整性的重要指標，其數(shù)值越大表示組裝得到的長片段越多，當N50≥800 bp說明組裝得到序列完整性較好（胡俊杰等，2017）。本研究中N50>800 bp，表明藤茶轉錄組組裝后得到的序列完整性較好，能滿足轉錄組分析的要求，從而保證功能注釋能得到較理想的比對結果。

本研究將獲得的92472條Unigenes在7個Nr數(shù)據(jù)庫中進行比對注釋，結果顯示，有84217條Unigenes（91.07%）至少在1個數(shù)據(jù)庫被注釋，有8944條Unigenes（9.67%）在7個數(shù)據(jù)庫均被注釋，且有20956條（22.66%）、41116條（44.46%）和14553條（15.73%）分別在KO、GO和KOG數(shù)據(jù)庫被注釋。從本研究Nr數(shù)據(jù)庫同源比對匹配的物種分布結果可知，注釋到葡萄的Unigenes最多，所占比例高達88.17%。與其他藥用植物相比，藤茶轉錄組Unigenes的注釋率（91.07%）明顯高于草麻黃（81.81%）（馬婧等，2016）、銀杏（81.67%）（劉偉等，2018）和夏枯草（53.13%）（朱畇昊等，2019）等，可能是因為藤茶為葡萄的近緣物種，在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫葡萄的蛋白序列信息較豐富，導致藤茶Unigenes注釋率也較高。

黃酮類化合物的種類較多、分布較廣，其生物合成途徑目前已基本清楚，各步驟催化反應的所需酶及其基因均有大量研究（Hichri et al.，2011;鄒麗秋等，2016）。藤茶是富含黃酮類化合物的一種天然植物，其嫩莖葉中的總黃酮含量高達43.4%～45.52%，遠高于其他植物，且藤茶中的黃酮類化合物種類多樣，除二氫楊梅素外，還含有其他多種黃酮類成分，如槲皮素、花旗松素、山奈酚、藤茶素、楊梅苷、橙皮素、洋芹素、大黃素和阿福豆素等（Zhang and Yang，2001;何桂霞等，2007;付明等，2015）。本研究對藤茶轉錄組Unigenes進行KEGG信號通路富集分析，結果發(fā)現(xiàn)在五大類通路中，有98條與代謝有關的通路，占所有通路的76.56%，通過進一步篩選，共獲得98個黃酮類化合物合成相關的基因，分別編碼17種關鍵酶，包括3個苯丙烷代謝途徑的所需酶（PAL、4CL和C4H）和14個類黃酮代謝途徑的所需酶（CHS、CHI、F3H、F3H、F35H、FLS、DFR、ANR、LDOX、LAR、F3OMT、HCT、C3H和CCOAOMT），為深入研究藤茶黃酮生物合成途徑及其相關關鍵基因的篩選、功能鑒定及調控機制打下了基礎。今后還將通過實時熒光定量PCR等技術檢測上述關鍵酶基因的差異表達情況，同時結合藥效成分含量分析，解析上述基因在藤茶藥效成分生物合成過程的功能。

4 結論

藤茶在細胞過程、代謝過程、單有機體過程、細胞和細胞部分、結合和催化活性能力分布的基因較豐富，在一般功能、翻譯、翻譯后修飾、蛋白質翻轉及分子伴侶的基因表達量較高，具有較強的碳水化合物代謝能力。多種關鍵酶基因參與藤茶黃酮類化合物的生物合成，推測其生物合成途徑存在多條分支，調控機制也較復雜。

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（責任編輯 陳 燕）

收稿時間：2019-08-15

基金項目：國家科技支撐計劃項目（2013BAD01B05）;福建農林大學科技創(chuàng)新專項（KFA17424A）

作者簡介：*為通訊作者，鄭金貴（1949-），教授，主要從事地方特色作物種質資源挖掘與創(chuàng)新利用研究工作，E-mail：jgzheng@ fafu.edu.cn。許明（1978-），博士，主要從事藥用植物生物技術研究工作，E-mail：xmfau@163.com

優(yōu) 秀 青 年 學 者 論 壇

許明（1978-），博士，主要從事藥用植物生物技術研究工作。先后主持或作為主要成員參與國家科技支撐計劃項目“地方特色作物種質資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用”、國家轉基因重大專項“功能型轉基因水稻新品種的培育”、農業(yè)農村部“948”計劃項目“臺灣優(yōu)質農產品技術的引進、創(chuàng)新與推廣”和福建省特色現(xiàn)代農業(yè)項目“特種作物新品種試驗篩選與功能品質鑒定”等國家級、省部級科研項目10余項;在《Molecular Genetics and Genomics》《International Journal of Molecular Sciences》《Iranian Journal of Biotechno-logy》《中國農業(yè)科學》《南方農業(yè)學報》《西北植物學報》《中草藥》《生物技術通報》等國內外核心期刊上發(fā)表學術論文20余篇;申報國家發(fā)明專利4項，獲福建省科學技術獎三等獎1項。