油莎豆塊莖表達(dá)CeTIP4;1基因的克隆、亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析

關(guān)鍵詞：油料作物；虎堅(jiān)果；塊莖；液泡膜內(nèi)在蛋白；亞細(xì)胞定位；表達(dá)模式

中圖分類號：S565.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

液泡膜內(nèi)在蛋白（tonoplast intrinsic protein，TIP）隸屬于水通道蛋白（aquaporin， AQP）家族，因其定位在液泡膜而得名[1]。TIP 最先在模式植物擬南芥中被鑒定，擬南芥γ-TIP1（AtTIP1;1）及其同源基因在蟾蜍卵母細(xì)胞和酵母中異源表達(dá)通常表現(xiàn)出高效的水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性，高于或與細(xì)胞膜定位的質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（plasma membrane intrinsicprotein， PIP）相當(dāng)[2-3]。在體外，有些TIP 還被證實(shí)可以轉(zhuǎn)運(yùn)甘油、尿素、硼酸、NH3、H2O2 等中性小分子[4-10]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組含有10 個TIP 基因，并根據(jù)進(jìn)化關(guān)系分為TIP1～TIP5 等5 個亞類，其中，除TIP4 和TIP5僅有1 個成員外，其他亞類含有2～3 個成員不等[11]。晶體結(jié)構(gòu)顯示，與PIP 類似，TIP 含有6 個由5個親水環(huán)（LA–E）連接的跨膜α 螺旋（TM1–6）、2 個由LB 和LE 折向膜內(nèi)形成的半螺旋以及位于半螺旋頂端的NPA 基序[10， 12]，2 個NPA 基序與位于TM2、TM5 和LE 上的4 個保守殘基（即ar/R選擇性濾器：H2、H5、LE1 和LE2）共同決定了孔道的大小和底物的特異性[13-14]；此外，擬南芥AtTIP2;1 位于LC 的H131 為NH3 的高效轉(zhuǎn)運(yùn)所必須[10]。與PIP 相比，擬南芥TIP 的ar/R 選擇性濾器變異較大，TIP1 為H-I-A-V，TIP2、TIP3 和TIP4為H-I-G/A-R，TIP5 為N-V-G-C，孔徑介于0.67～1.56 ? [15]。研究表明，不同TIP 亞類定位于不同類型的液泡，如TIP1 主要定位于裂解型液泡，TIP2 位于蛋白儲藏型液泡，TIP3 定位于種子的蛋白儲藏型液泡，并在種子的萌發(fā)過程中逐步被TIP1 所替代[16]。TIP4 也在裂解型液泡被發(fā)現(xiàn)，主要參與水分、尿素和甘油的轉(zhuǎn)運(yùn)[5， 9]。

油莎豆（Cyperus esculentus L.），又名虎堅(jiān)果，是一種隸屬于禾本目莎草科莎草屬的新型草本油料作物[17-20]。不同于傳統(tǒng)油料作物在種子中積累油脂，油莎豆不開花或開花不結(jié)實(shí)，但它可在地下塊莖中積累高達(dá)35%的油脂，這使其成為研究營養(yǎng)組織油脂合成與調(diào)控的理想模型[21-23]。油莎豆塊莖起源于地下匍匐莖，其發(fā)育過程主要分為起始、膨大和成熟等3 個階段[21， 24]。通過前期研究，團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)海南地區(qū)塊莖的發(fā)育非常迅速，自起始后35 d 即可成熟，成熟塊莖的含水量約為45%，而在此之前一般維持在85%左右[24]，表明水分平衡在塊莖發(fā)育和代謝中的重要作用。前期研究顯示，在新鮮成熟塊莖的蛋白組中鑒定到多個AQP 基因，如CePIP1;1、CePIP2;1、CeTIP1;1和CeTIP2;1[19， 25-28]。其中，CeTIP1;1 隸屬于TIP1亞類，在塊莖、葉片、葉鞘、根、匍匐莖和芽尖等主要油莎豆組織中均高水平表達(dá)，且其編碼蛋白定位在煙草葉片的液泡[27]。本研究報(bào)道另一個塊莖表達(dá)的TIP 基因CeTIP4;1，該基因源于團(tuán)隊(duì)先前構(gòu)建的油莎豆全長轉(zhuǎn)錄組[29]，其與AtTIP4;1同源。研究顯示，CeTIP4;1 的表達(dá)模式及其編碼蛋白的亞細(xì)胞定位與CeTIP1;1 明顯不同，這些研究結(jié)果將有助于深入解析油莎豆塊莖的水分平衡機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用油莎豆品系為熱研3 號，植株種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院文昌實(shí)驗(yàn)基地，不同發(fā)育時期塊莖的采集詳見文獻(xiàn)[24] ； 本氏煙草（Nicotiana benthamiana）種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所溫室，具體生長條件詳見文獻(xiàn)[30] ； 大腸桿菌DH5α 和根癌農(nóng)桿菌GV3101（內(nèi)含pSoup-P19）感受態(tài)、亞細(xì)胞定位載體pNC-Cam1304-SubN 和pNC-HbPIP2;3-RFP[31]均由本實(shí)驗(yàn)室保存；各類酶、試劑盒及生化試劑詳見文獻(xiàn)[17]。

油莎豆的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別下載于CNGBdb（https：//db.cngb.org/search/assembly/CNA-0051961/）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/703731）數(shù)據(jù)庫；擬南芥和水稻（Oryzasativa）的TIP 蛋白下載于TAIR11（https：//www.arabidopsis.org/）和RGAP7（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）數(shù)據(jù)庫；菠菜（Spinacia oleracea）的SoPIP2;1 下載于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/pdb/1Z98）數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄 油莎豆塊莖總RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄方法參照文獻(xiàn)[17]，即用天根植物多糖多酚RNA 提取試劑盒抽提總RNA，并用寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 第一鏈。

1.2.2 基因克隆與載體構(gòu)建 本課題組前期通過對油莎豆的全長轉(zhuǎn)錄組[29]進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)1條與AtTIP4;1 同源的轉(zhuǎn)錄本，序列全長1098 bp，包含1 個753 bp 的開放讀碼框。為克隆該基因，采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)巢式PCR 引物對CeTIP4;1F/R （ AAACAAAGCAACCAAGACAG/CTTGCATCTCATGATCCAAA）和CeTIP4;1HF/R（ AGTGGTCTCTGTCCAGTCCTATGGCAAAGATTGCATTAGG/GGTCTCAGCAGACCACAAGTTCAAAATTCTTCACCATCTC）。PCR 擴(kuò)增和載體構(gòu)建參照文獻(xiàn)[17]：首先利用外側(cè)引物CeTIP4;1F/R 分離基因的全長轉(zhuǎn)錄本，隨后采用內(nèi)側(cè)引物CeTIP4;1HF/R 擴(kuò)增基因的編碼區(qū)序列，最后運(yùn)用NC 克隆試劑盒將目的片段克隆到亞細(xì)胞定位載體pNC-Cam1304-SubN。

1.2.3 序列的生物信息學(xué)分析 利用本地BLASTN 程序?qū)⑸鲜鯟eTIP4;1 的轉(zhuǎn)錄本比對到油莎豆的基因組， 提取相應(yīng)的基因序列后用GSDS 2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）在線軟件分析其基因結(jié)構(gòu)；蛋白的理化特性和保守結(jié)構(gòu)域分析分別使用Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）和CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）在線軟件；亞細(xì)胞定位、二級和3D 結(jié)構(gòu)的預(yù)測分別使用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）、SOPMA（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）在線軟件；跨膜螺旋區(qū)及保守殘基的鑒定基于與已結(jié)晶AtTIP2;1[10]和SoPIP2;1[12]的序列比對。

1.2.4 多序列比對與進(jìn)化樹的構(gòu)建 蛋白的多序列比對采用MUSCLE 軟件，進(jìn)化樹的構(gòu)建采用MEGA（v6.06）軟件，所用參數(shù)為最大似然法、1000 次自舉重復(fù)。

1.2.5 亞細(xì)胞定位分析 以前期報(bào)道的pNCHbPIP2;3-RFP[31]作為細(xì)胞膜定位的陽性標(biāo)記，參照文獻(xiàn)[30]將重組質(zhì)粒pNC-Cam1304-CeTIP4;1導(dǎo)入農(nóng)桿菌，挑選單克隆，用含Kan 和Rif 的LB培養(yǎng)基搖菌，隨后與含陽性標(biāo)記的農(nóng)桿菌工程菌等量混合，制備浸染液，轉(zhuǎn)化受體，選取4 周齡的煙草葉片，熒光觀察采用共聚焦顯微鏡ZeissLMS880。

1.2.6 基因表達(dá)分析 轉(zhuǎn)錄譜分析采用StringTie（v2.2.0）軟件，即將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對到基因組，然后用FKPM（fragments per kilobase of exon permillion fragments mapped）法均一化基因的相對表達(dá)水平。qRT-PCR 分析參照文獻(xiàn)[20]，以CeUCE2（Fq： ATCATCAAGGAGACCCAGCG， Rq： CTTAGGGGCAGCCATAGGA）作為內(nèi)參基因，所用基因特異性引物為CeTIP4;1Fq/Rq（GTCCTCACTTTCTCCCTCCTCT/CACTAACCCGACAAGCAACG）。

2 結(jié)果與分析

2.1 CeTIP4;1的克隆與序列分析

通過將CeTIP4;1 的轉(zhuǎn)錄本比對到基因組，發(fā)現(xiàn)該基因位于Scaffold40 反向鏈的5 229 867～5 231 478 位，基因全長1612 bp，包含2 個內(nèi)含子，5?和3? UTR 分別為154、191 bp（圖1A）。重組質(zhì)粒pNC-Cam1304-CeTIP4;1 的桑格測序顯示，克隆到的序列與基因的對應(yīng)區(qū)域（外顯子）完全一致。進(jìn)一步的序列分析顯示，CeTIP4;1 編碼區(qū)的GC 含量為58.03%，編碼250 個氨基酸（aa），理論分子量（MW）為25.57 kDa，等電點(diǎn)（pI）為6.02，總平均疏水指數(shù)（GRAVY）為0.884，脂肪族指數(shù)（AI）為119.40，不穩(wěn)定系數(shù)（II）為33.70，屬于穩(wěn)定的酸性疏水型蛋白，這與CeTIP1;1、CeTIP2;1 和AtTIP2;1 類似，但不同于SoPIP2;1 的堿性特性（表1）。CDD 分析顯示，CeTIP4;1 的第3～235 位殘基為保守的MIP 結(jié)構(gòu)域（圖1B）。CeTIP4;1 與CeTIP1;1、CeTIP2;1、AtTIP2;1 和SoPIP2;1 的序列相似性分別為67.19%、70.92%、73.81%和44.08%，擁有6 個相對保守的跨膜螺旋（TM1–6）、2 個半螺旋（HB 和HE）以及2 個典型的NPA 基序（圖1C）。CeTIP4;1 的ar/R 選擇性濾器為H-I-A-R，不同于CeTIP1;1 的H-I-A-V、CeTIP2;1 和AtTIP2;1 的H-I-G-R 以及SoPIP2;1的F-H-T-R；CeTIP4;1 的Froger 位點(diǎn)為T-S-A-YW，與CeTIP1;1 和AtTIP2;1 一致，但不同于CeTIP2;1 的T-S-A-Y-I 和SoPIP2;1 的M-S-A-F-W。與SoPIP2;1 相比，CeTIP4;1、CeTIP1;1 和AtTIP2;1具有較短的N 端，且僅含有對應(yīng)于SoPIP2;1 的S96 磷酸化位點(diǎn)；CeTIP4;1 的LC 區(qū)含有一個對應(yīng)于AtTIP2;1 的H131 組氨酸，而CeTIP1;1 和SoPIP2;1 的相應(yīng)位點(diǎn)分別為F 和N（圖1C）。與CeTIP1;1、CeTIP2;1AtTIP2;1 和SoPIP2;1 類似，CeTIP4;1 的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，分別占36.80%和36.00%（表1）?；贏tTIP2;1的同源建模顯示，CeTIP4;1 含有6 個跨膜螺旋，且可形成同源四聚體（圖1D）。

2.2 CeTIP4;1 進(jìn)化分析

為確認(rèn)CeTIP4;1 的進(jìn)化關(guān)系，本研究將其與已報(bào)道的AtTIP[11]和OsTIP[32]構(gòu)建如圖1E 所示的無根進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，這些蛋白被聚為5 組，分別對應(yīng)于前期報(bào)道的TIP1～TIP5[11]，其中，CeTIP4;1與擬南芥和水稻中的TIP4 亞類聚在一起，其與AtTIP4;1、OsTIP4;1、OsTIP4;2 和OsTIP4;3 的序列相似性分別為78.57%、71.71%、69.62%和82.94%。以上結(jié)果證實(shí)CeTIP4;1 屬于AtTIP4;1的直系同源基因，而水稻中的3 個成員可能在其與油莎豆分化之后產(chǎn)生。

2.3 CeTIP4;1 亞細(xì)胞定位分析

為揭示CeTIP4;1 所起的功能部位，利用含pNC-Cam1304-CeTIP4;1 的農(nóng)桿菌工程菌對煙草葉片進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)化，共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果如圖2 所示。雖然Plant-mPLoc 預(yù)測CeTIP4;1 定位在液泡膜，但本研究結(jié)果顯示其定位在細(xì)胞膜，并與細(xì)胞膜標(biāo)記HbPIP2;3-RFP 的紅色熒光信號高度重合。

2.4 CeTIP4;1 基因表達(dá)分析

如圖3A 所示，轉(zhuǎn)錄譜分析顯示CeTIP4;1 主要在塊莖、根、匍匐莖和芽尖中表達(dá)，而在幼嫩葉片、葉鞘和成熟葉片中的表達(dá)量極低，表現(xiàn)出明顯的組織特異性。為進(jìn)一步揭示基因在塊莖發(fā)育過程中的表達(dá)模式，本研究選取起始期、膨大中期、膨大晚期和成熟期等4 個典型的時期進(jìn)行qRT-PCR 分析，結(jié)果顯示，CeTIP4;1 在4 個典型時期的表達(dá)量呈先升后降的趨勢，峰值出現(xiàn)在膨大中期，最低的是成熟期（圖3B）。

3 討論

在植物中，細(xì)胞的水分平衡主要由細(xì)胞膜定位的PIP 和液泡膜定位的TIP 介導(dǎo)[1， 33]。PIP 高度保守，僅存在2 個進(jìn)化小組，相比而言，TIP高度分化，其在高等植物中至少存在5 個進(jìn)化小組[3， 11， 32， 34-37]。本研究報(bào)道的CeTIP4;1 隸屬于TIP4 亞組，其與AtTIP4;1、OsTIP4;1、OsTIP4;2和OsTIP4;3 在蛋白水平的相似性介于69.62%～82.94%，且在進(jìn)化分析中被聚在一起，推測它們可能具有類似的生物學(xué)功能。CeTIP4;1 含有2 個內(nèi)含子，這與AtTIP4;1 和OsTIP4;1 一樣，但不同于僅含有1 個內(nèi)含子的OsTIP4;2 和OsTIP4;3[11， 32]。蓖麻（ Ricinus communis ）、麻瘋樹（ Jatrophacurcas）、木薯（Manihot esculenta）、橡膠樹（Heveabrasiliensis）和楊樹（Populus trichocarpa）等植物中的TIP4 成員均含有2 個內(nèi)含子，且內(nèi)含子位置高度保守[11， 34-37]，這極可能是OsTIP4;2 和OsTIP4;3 的第2 內(nèi)含子發(fā)生了丟失， 而非CeTIP4;1 和OsTIP4;1 獲得了新的內(nèi)含子。

CeTIP4;1 含有1 個保守的MIP 結(jié)構(gòu)域，其中包含6 個跨膜螺旋、2 個半螺旋以及2 個典型的NPA 基序，且具有與AtTIP4;1 和OsTIP4;3 完全一樣的ar/R 選擇性濾器（即H-I-A-R），其孔徑大小與AtTIP1;1 相當(dāng)（0.72 ? vs 0.67 ?）[15]，推測CeTIP4;1 可能具有AtTIP1;1 類似的水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性。事實(shí)上，AtTIP4;1 和OsTIP4;1 均已被證實(shí)具有高效的水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性[5， 9]。相比于SoPIP2;1[12]，CeTIP4;1 與AtTIP2;1[10]的結(jié)構(gòu)比較接近，且其LC 區(qū)含有1 個與NH3 轉(zhuǎn)運(yùn)所必須的H 殘基[10]，推測CeTIP4;1 可能具有高效的NH3 轉(zhuǎn)運(yùn)活性。此外， 研究還顯示AtTIP4;1 可以轉(zhuǎn)運(yùn)尿素[5]，OsTIP4;1 可以轉(zhuǎn)運(yùn)甘油[9]。

在擬南芥原生質(zhì)中的亞細(xì)胞定位分析顯示AtTIP4;1 主要定位在液泡[5]，而本研究結(jié)果顯示CeTIP4;1 定位在煙草葉片的細(xì)胞膜，其中的原由還有待進(jìn)一步研究?？赡艿脑蚴牵海?）TIP4 的亞細(xì)胞定位與組織類型有關(guān)，其中包括液泡的類型與數(shù)量，前人用的是原生質(zhì)[5]，而本研究用的是幼嫩的煙草葉片；（2）TIP4 原本定位在液泡，但可以與PIP 互作從而定位到細(xì)胞膜，因?yàn)橛醒芯匡@示AtTIP1;2、AtTIP2;1 和AtTIP3;1 均可與AtPIP2;1 互作[38]；（3）CeTIP4;1 本身就定位在細(xì)胞膜，但這與其pI<7 的酸性特性不太相符。

作為主要塊莖表達(dá)的TIP1 基因，CeTIP4;1同時被發(fā)現(xiàn)在根、匍匐莖、芽尖中也有較高水平的表達(dá)，卻很少在光合組織葉片和葉鞘中表達(dá)，這與CeTIP1;1 和CeTIP2;1 的組成型高水平表達(dá)不同[27-28]。在塊莖發(fā)育過程中， CeTIP4;1 與CeTIP1;1 和CeTIP2;1 均表現(xiàn)出鐘型趨勢，但峰值出現(xiàn)不同，CeTIP4;1 和CeTIP2;1 較早，出現(xiàn)在膨大中期，而CeTIP1;1 出現(xiàn)在膨大晚期；此外，CeTIP4;1 和CeTIP2;1 在成熟期的表達(dá)量顯著低于起始期，而CeTIP1;1 在起始期和成熟期的表達(dá)量差異不顯著[27-28]。這表明CeTIP4;1 與CeTIP2;1類似，主要在塊莖發(fā)育前期起作用，同時也解釋了CeTIP4;1 未能在成熟塊莖的蛋白組中被鑒定到的原因[19]。與CeTIP1;1 相比，CeTIP4;1 在塊莖發(fā)育過程中的表達(dá)模式與含水量趨勢更為吻合，因?yàn)樵诒狙芯糠治龅? 個時期中，起始期和膨大中期的含水量約為85%，膨大晚期為75%，成熟期為45%[24]。

綜上，本研究首次報(bào)道了1個油莎豆TIP4 基因CeTIP4;1，該基因含有2 個保守的內(nèi)含子，為AtTIP4;1 的直系同源基因；CeTIP4;1 定位在細(xì)胞膜，具有AtTIP2;1 類似的理化特性和結(jié)構(gòu)特征；CeTIP4;1 的表達(dá)具有明顯的組織特異性，且其在塊莖發(fā)育過程中的表達(dá)模式與含水量趨勢基本吻合。本研究結(jié)果為深入解析油莎豆塊莖的水分平衡機(jī)制及遺傳改良奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。