柚皮中柚皮苷提取條件優(yōu)化及其貯藏條件分析

王娟娟，賈金萍，張俊杰

山西大學大型科學儀器中心（太原 030006）

柚子是蕓香科柑橘屬的一種水果，其果實鮮食甘酸可口，沁人心脾，令人贊不絕口，具有消炎防菌、化痰止咳、理氣清腸、下氣消食、補血健脾等功效。柚子是佳果，又是良藥。然而，厚厚的柚皮往往被棄之不用，其實柚皮不僅可作為居室里的空氣清新劑，還有食療功效。柚皮占整個柚子質量的40%～55%[1-2]，不僅含有維生素和礦物質這些人體必需的營養(yǎng)素，還含有多種對人體健康有益的非營養(yǎng)性生理活性成分，如黃酮類化合物、多糖、果膠、香精油等，這些成分高于柚果實，具有較高保健和藥用價值[3-8]。

柚皮苷（naringin）全稱4, 5, 7-三羥基-黃烷酮-7-鼠李糖葡萄糖苷，是一種二氫黃酮類化合物，主要存在于柚、橘、橙等柑橘類水果的外層果皮中。柚皮苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗衰老、降血脂、抗動脈粥樣硬化等廣泛的生物活性，是重要的醫(yī)藥原料。試驗研究大都集中于柚皮中柚皮苷的提取純化方面[6,9-13]，很少關于直接飲用柚皮水的研究報道。

網(wǎng)上和民間都流傳著許多種簡單可行的柚子皮治療咳嗽的做法，如開水沖泡、沸水煎煮等服用方法[14-17]。柚皮雖是止咳良藥，但尚缺乏科學依據(jù)證明其有效性及如何才能使其更有效。

因此，采用高分辨液質聯(lián)用儀分析測定開水沖泡和沸水煎煮柚皮水提液中止咳化痰成分柚皮苷含量，研究干燥后及-18 ℃冷凍期間柚皮水提液中柚皮苷含量的變化規(guī)律，為合理用藥提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮柚皮取自琯溪蜜柚，產(chǎn)地為福建省。

甲醇、乙腈、乙酸（色譜純，Thermo Fisher Scientific公司）；柚皮苷對照品（百靈威科技有限公司）；純凈水（娃哈哈）。

1.2 儀器與設備

Thermo fisher U3000超高效液相色譜儀，配置在線脫氣機、四元梯度泵、柱溫箱、自動進樣器（Thermo Fisher Scientific）；Thermo Scientific Q Extractive質譜儀（Thermo Scientific，Germany），Syncronis C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；十萬分之一天平（奧豪斯儀器有限公司）；美的電磁爐；海爾冰箱。

1.3 方法

1.3.1 檢測條件

色譜條件：色譜柱Syncronis C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相，乙腈（A），0.1%乙酸水（B）。梯度洗脫：0～0.5 min，5% A；0.5～3 min，5%～95% A；3～5 min，95% A；5～5.2 min，95%～5%A；5.2～7 min，5% A；流速0.25 mL/min；柱溫45 ℃；進樣量1 μL。

質譜條件：離子源，電噴霧離子源（ESI）；掃描方式，負離子同時掃描；噴霧電壓2.7 kV；鞘氣流速35 psi；輔助氣流速10 psi；毛細管溫度320 ℃；探頭加溫器溫度300 ℃；最大噴霧電流100 A；S-Lens分辨率55；掃描范圍m/z150～1 000；質量分辨率70 000。

1.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取10.0 mg柚皮苷對照品置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備

1) 采用開水沖泡、沸水煎煮2種方法。具體過程：將鮮柚皮切成1 cm×2 cm大小的塊，精密稱取5.0 g柚皮，分別用100 mL開水沖泡3，5，10，15和20 min，適量沸水煎煮3，5，10，15和20 min，將水提液移至100 mL容量瓶中用純凈水定容，搖勻，微孔濾膜（0.22 μm）過濾后作為供試溶液。

2) 將一部分鮮柚皮塊自然晾干（含水量78.34%），精密稱取1.1 g干柚皮，用適量沸水煎煮15 min，將水提液移至100 mL容量瓶中用純凈水定容，搖勻，微孔濾膜（0.22 μm）過濾后作為供試溶液。

3) 將剩余鮮柚皮塊置于-18 ℃冰箱中保存，分別在冷凍2，4，6和8個月時取樣檢測，每次精密稱取5.0 g柚皮，用適量沸水煎煮15 min，將水提液移至100 mL容量瓶中用純凈水定容，搖勻，微孔濾膜（0.22 μm）過濾后作為供試溶液。

按1.3.1的液相色譜及質譜條件進行檢測，柚皮苷標準品和柚皮苷試驗樣品的提取離子圖見圖1和圖2。

圖1 柚皮苷標準品的提取離子流圖

圖2 柚皮苷樣品的提取離子流圖

1.3.4 標準曲線的建立

分別精密吸取0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 mL對照品溶液，分別置于10 mL量瓶中，用純凈水定容至刻度，搖勻。以峰面積積分值為縱坐標，柚皮苷對照品進樣量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線。其回歸方程為Y=4.654 88×107X+1.653 87×107（R2=0.998 7），線性范圍為4.738～39.446 μg。

1.3.5 精密度試驗

以開水沖泡10 min柚皮水溶液進樣1 μL，連續(xù)重復6次，測定峰面積，柚皮苷相對標準偏差RSD為0.96%。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗

取沸水煎煮3 min柚皮水溶液，每隔1 h進樣1 μL，觀察6 h內(nèi)穩(wěn)定性，RSD為2.90%。

1.3.7 重復性試驗

稱取6份同一批柚皮，各5 g，分別用沸水煎煮3 min后進樣1 μL，柚皮苷峰面積的RSD為2.46%，表明方法重復性良好。

1.3.8 加樣回收率試驗

精密稱取9份5 g柚皮，分別加入低、中、高3個濃度的柚皮苷對照品（分別相當于開水沖泡10 min柚皮水溶液中柚皮苷含量的80%，100%和120%），按1.3.3的方法開水沖泡10 min柚皮制備供試品溶液，取1 μL進樣測定，計算含量，求得平均回收率為98.11%，RSD為1.53%。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0 for Windows（SPSS Inc.，USA）軟件進行方差分析，用Tukey法進行多重比較，p＜0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 柚皮中柚皮苷提取條件

柚皮苷易溶于熱水，通過加熱處理可使其溶出[11]。根據(jù)柚皮苷特性，分別研究不同開水沖泡時間、沸水煎煮時間對柚皮中柚皮苷溶出量的影響。

2.1.1 開水沖泡時間的確定

開水沖泡柚皮不同時間后，柚皮水提液中止咳化痰成分柚皮苷含量的變化如圖3所示。在3～20 min內(nèi)，隨著開水沖泡時間增加，柚皮水提液中柚皮苷含量基本呈現(xiàn)逐漸增加趨勢。開水沖泡柚皮5和10 min時水提液中柚皮苷含量無顯著差異（p＞0.05），開水沖泡柚皮20 min時水提液中柚皮苷含量升高到11.61 μg/mL，顯著高于沖泡3，5，10和15 min時（p＜0.05），開水沖泡柚皮20 min后，水溫較低，不適宜飲用。綜合考慮，開水沖泡柚皮20 min較為適宜。

圖3 開水沖泡時間對柚皮水提液中柚皮苷含量的影響

2.1.2 沸水煎煮時間的確定

沸水煎煮柚皮不同時間后，柚皮水提液中止咳化痰成分柚皮苷含量的變化如圖4所示。在3～20 min內(nèi)，隨著沸水煎煮時間增加，柚皮水提液中柚皮苷的含量呈現(xiàn)先增加后下降趨勢。沸水煎煮柚皮5，10，15和20 min時水提液中柚皮苷含量均顯著高于3 min時（p＜0.05），沸水煎煮柚皮15 min時水提液中柚皮苷含量達到最大值（24.36 μg/mL），繼續(xù)煎煮，柚皮苷含量下降。沸水煎煮柚皮20 min時降至19.62 μg·mL-1，與煎煮5和10 min時相比差異不顯著（p＞0.05）。這一結果表明，煎煮20 min時間過長，過度加熱會導致柚皮苷的分解，從而導致柚皮苷含量降低，類似的結果在文獻[18-19]中提及。因此，最佳沸水煎煮柚皮時間為15 min。

圖4 沸水煎煮時間對柚皮水提液中柚皮苷含量的影響

2.1.3 柚皮有效利用方法的確定

在試驗分析基礎上，將開水沖泡20 min、沸水煎煮3 min、沸水煎煮15 min時的柚皮水提液中柚皮苷含量作比較，如圖5所示。開水沖泡柚皮20 min和沸水煎煮柚皮3 min這2種方法的水提液中柚皮苷含量無顯著差異（p＞0.05），推測其止咳化痰效果基本相同。與開水沖泡柚皮20 min時相比，沸水煎煮柚皮15 min時水提液中柚皮苷含量顯著提高（p＜0.05），由此可見，柚皮苷易溶于熱水，通過加熱處理可使柚皮苷溶出更多，該結論與楊秋明等[11]的研究結果一致。因此，確定沸水煎煮柚皮15 min為柚皮有效利用的最佳方法。

圖5 柚皮不同利用方法的比較

2.2 干燥對柚皮中柚皮苷含量的影響

柚皮干燥后，沸水煎煮柚皮15 min時水提液中柚皮苷的含量下降為鮮柚皮的58.58%（p＜0.05），如圖6所示。結果表明，柚皮苷在干燥過程中有顯著降解，將柚皮干燥后存放，并不能有效利用柚皮。

2.3 冷凍期間柚皮中柚皮苷含量的變化

為延緩柚皮苷的降解，將鮮柚皮塊置于-18 ℃冰箱中凍藏。冷凍8個月后進行水提，柚皮水提液中柚皮苷含量測定結果如圖7所示。冷凍后柚皮苷含量同樣呈明顯下降趨勢（p＜0.05），但其下降速度較干燥后小得多，柚皮中柚皮苷分別在第2和第4個月時有顯著降解，其中第2個月水提液中柚皮苷含量為未凍藏時的85.39%，第4個月為未凍藏時的70.69%；而第4～6個月呈緩慢下降趨勢，差異不顯著（p＞0.05），6個月以后又快速下降，至第8個月時，柚皮水提液中柚皮苷含量已下降為未凍藏時的45.53%，柚皮化痰止咳效果大大降低。

圖6 干燥后柚皮水提液中柚皮苷含量的變化

圖7 冷凍期間柚皮水提液中柚皮苷含量的變化

3 討論與結論

柚皮味辛甘苦，性溫，無毒，具有化痰，消食，下氣，快膈等功效，在《唐本草》《本草求原》《列子》《本草綱目》《四川中藥志》等文獻中均有記載[20]。采用開水沖泡、沸水煎煮方法提取柚皮中的止咳化痰成分柚皮苷，并用GC-MS分析，同時研究干燥后及-18 ℃冷凍期間柚皮水提液中柚皮苷含量的變化規(guī)律。結果表明，鮮柚皮沸水煎煮15 min水提液中柚皮苷含量最高，可達24.36 μg/mL；柚皮干燥后，柚皮水提液中柚皮苷含量下降至14.27 μg/mL，柚皮苷有顯著降解；鮮柚皮冷凍2，4，6和8個月后，水提液中柚皮苷含量分別為未凍藏時的85.39%，70.69%，65.60%和45.53%，柚皮苷含量冷凍2個月和4個月時下降極顯著，冷凍4個月到6個月之間變化不大，6個月以后又快速下降。因此，選擇沸水煎煮15 min作為柚皮利用的最佳方法，將鮮柚皮冷凍可有效延緩柚皮苷的降解，冷凍保存不超過6個月為宜。在民間，柚皮用于止咳歷時已久，但缺乏合理應用的科學依據(jù)，試驗為有效利用柚皮這一天然資源提供參考依據(jù)。