HPLC 檢測(cè)植物油中黃曲霉毒素B1 含量的不確定度評(píng)價(jià)

韓曉萌，楊臻慧，陸敏芳，俞昕成，王李佳

（嘉興中科檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司 浙江中科院應(yīng)用技術(shù)研究院分析測(cè)試中心，浙江 嘉興 314000）

黃曲霉毒素（aflatox-ins,AF）、赭曲霉毒素（ochratoxins,OT）等曲霉類毒素證明具有致癌、致畸和致突變性，根據(jù)中國農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所統(tǒng)計(jì)，2001 至2011 年10 年間，受真菌毒素污染的影響，我國出口歐盟食品違例事件達(dá)2 559 起，其中真菌毒素超標(biāo)占28.6%。曲霉類真菌毒素污染谷物和油料等作物已成為全球性問題。

黃曲霉毒素檢測(cè)主要有酶聯(lián)免疫法、薄層色譜法、熒光光度法、高效液相色譜法（IAC 技術(shù)（免疫親和柱凈化法）、SPE 技術(shù)（固相萃取凈化法））、液相色譜-質(zhì)譜法（IAC 技術(shù)，SPE 技術(shù)），檢測(cè)方法品種多，適用范圍不同，使得黃曲霉毒素檢測(cè)選擇繁瑣，效率低下，同時(shí)一些檢測(cè)方法的重復(fù)性差，引入的不確定度分量多，導(dǎo)致結(jié)果在置信區(qū)間的范圍寬。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)，本文做了采用ICA 技術(shù)的高效液相色譜法對(duì)植物油中的黃曲霉毒素B1 進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行不確定度評(píng)價(jià)，分析各不確定度分量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，從而在試驗(yàn)過程中控制各分量的輸入，使測(cè)試結(jié)果更加可靠。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑和儀器

高效液相色譜儀：具熒光檢測(cè)器，柱后光化學(xué)衍生裝置（PD3110）（大連依利特分析儀器有限公司）；電子天平，離心機(jī)，氮吹儀，固相萃取裝置，超聲波清洗機(jī)，移液槍，黃曲霉毒素免疫親和柱。

甲醇，實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水，黃曲霉毒素B1 標(biāo)準(zhǔn)品（TMstandard?）。

1.2 提取

稱取5 g 試樣于50 mL 離心管中，加入20 mL 甲醇-水溶液（70＋30），渦旋混勻，置于超聲波清洗機(jī)30 min，在5 000 r/min 下離心10 min，取上清液備用。

1.3 凈化

免疫親和柱恢復(fù)室溫，準(zhǔn)確移取4 mL 上述上清液，加入23 mL 1% TritonX-100，混勻。免疫親和柱內(nèi)的液體放棄后，在免疫親和柱中樣液以 1～3 mL/min 的速度穩(wěn)定下滴。待樣液滴完后，以穩(wěn)定流速用20 mL 水淋洗免疫親和柱。待水滴完后，用真空泵抽干親和柱。脫離真空系統(tǒng)，在親和柱下部放置10 mL刻度試管，2×1 mL 甲醇洗脫親和柱，控制1～3 mL/min 的速度下滴。用真空泵抽干親和柱，收集全部洗脫液至試管中。在50℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两桑? mL 移液槍加入1.000 mL 初始流動(dòng)相。過膜上機(jī)。

1.4 色譜條件

色譜柱：SinoChrom ODS-BP 5 μm 4.6 mm×250 mm。柱溫為35℃。進(jìn)樣量為10 μL。流動(dòng)相為甲醇/乙腈/水（30∶30∶40）激發(fā)波長為360 nm；發(fā)射波長為440 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 不確定度來源

不確定度來源如圖1 所示。

圖1 不確定度來源

2.2 樣品稱量引起的不確定度

電子天平稱量范圍0.01 g～50 g，最大允許誤差為0.000 5 g，屬B 類評(píng)定，標(biāo)準(zhǔn)不確定度如式（1）所示。

稱量引入相對(duì)不確定度，如式（2）所示。

2.3 重復(fù)性不確定度

對(duì)樣品進(jìn)行10 次平行測(cè)定，樣品中黃曲霉毒素B1 測(cè)試結(jié)果如表1 所示，重復(fù)性試驗(yàn)用B 類評(píng)定。

表1 樣品中黃曲霉毒素B1 的平行測(cè)試結(jié)果

由表1 得，10 次重復(fù)性測(cè)試均值如式（3）所示。

實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差如式（4）所示。

被測(cè)量估計(jì)值標(biāo)準(zhǔn)不確定度如式（5）所示。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品的不確定度

黃曲霉毒素B1 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為2.00 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書給出不確定度為3.0%，屬B 類評(píng)定，所以黃曲霉毒素B1 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

對(duì)每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)測(cè)量三次，共18 次，測(cè)得的濃度與峰面積對(duì)應(yīng)值如表2 所示。

表2 黃曲霉毒素B1 標(biāo)準(zhǔn)系列濃度對(duì)應(yīng)峰面積

以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)擬合曲線方程y＝366.951 18 x，相關(guān)系數(shù)r＝0.999 491 2。由表1可知c0＝1.795 5 ng/mL，由表2 可知標(biāo)準(zhǔn)溶液試樣黃曲霉毒素B1 含量通過式（6）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差。

將線性擬合標(biāo)準(zhǔn)不確定度如式（7）所示。

2.6 實(shí)驗(yàn)過程中量器引起的不確定度

量器引入的按B 類評(píng)定，各量器引入的不確定度如表3 所示。

表3 量器引起的不確定度

實(shí)驗(yàn)中量器引入的的相對(duì)不確定度如式（8）所示。

2.7 回收率引起的不確定度

對(duì)陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，回收率如表4 所示。

表4 黃曲霉毒素B1 的加標(biāo)回收率

用A 類評(píng)定，回收率標(biāo)準(zhǔn)不確定度為式（9）所示。

2.8 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度

表5 測(cè)量不確定度分量

結(jié)合表5 各不確定度分量可得合成不確定度如式（10）、（11）所示。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中植物油中黃曲霉毒素B1 含量的不確定度的最終評(píng)定結(jié)果果為：黃曲霉毒素B1 含量為1.795 5 μg/kg 的樣品中，擴(kuò)展不確定度為0.212 μg/kg。實(shí)驗(yàn)所引入的不確定度分量中線性擬合所引入的不確定度對(duì)最終結(jié)果影響最大貢獻(xiàn)占71.0%，其次標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身和溶液稀釋及配制中量器引入的不確定度分量貢獻(xiàn)28.1%，稱量和重復(fù)性、回收率試驗(yàn)所引入的不確定度非常小，可忽略不計(jì)。