稻曲病菌菌株GZ-14-07中攜帶的全病毒基因組特征研究

張婷婷 滕麗 蔡小姚 龍慧 李升愉 劉紅美

（1. 貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550000；2. 貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550000；3. 貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與

疾病監(jiān)控省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550000）

水稻稻曲?。≧ice false smut）稱作偽黑穗病、綠黑穗病，因?yàn)樗喟l(fā)生在高產(chǎn)量收獲的年份，所以又稱為“豐收果”。水稻稻曲病是由于水稻花器官感染了稻曲病菌（有性態(tài)：Villosiclava virens；無(wú)性態(tài)：Ustilaginoidea virens）引起的真菌性病害［1］。感染了稻曲病菌的水稻，稻穗的空秕率增加，稻谷的千粒重降低，從而導(dǎo)致了水稻產(chǎn)量嚴(yán)重下降，稻米產(chǎn)量的損失率與稻曲球的病粒率呈顯著性正相關(guān)［2］。自20世紀(jì)中葉以后，稻曲病在全世界主要稻區(qū)的發(fā)生無(wú)論在規(guī)模上還是嚴(yán)重程度方面均呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢(shì)［3］。過(guò)去數(shù)十年來(lái)我國(guó)稻曲病菌導(dǎo)致的稻曲病的發(fā)生一直呈不斷加重的趨勢(shì)，已由一個(gè)次要病害逐步演變成為危害水稻生產(chǎn)的主要病害之一，在所有水稻種植區(qū)都已成為一種破壞性病害［4-5］。稻曲病菌侵染水稻小穗形成假黑穗球，產(chǎn)生大量的墨綠色或黑色的厚垣孢子可影響其他水稻米粒的光澤，造成巨大的產(chǎn)量損失［6-7］。此外，假黑穗球還含有黑粉菌毒素，此毒素是微管的抑制劑，可明顯抑制動(dòng)物的微管蛋白的組裝，對(duì)人和牲畜都有毒害作用［8］。綜上，稻曲病除了能使水稻嚴(yán)重減產(chǎn)，降低水稻稻米的品質(zhì)，也對(duì)糧食食品安全造成了嚴(yán)重的威脅。

真菌病毒（Mycovirus或Fungal viruses）是一類宿主為真菌的病毒，廣泛的存在于所有類群的真菌中。病毒基因組的核酸類型和病毒基因組的復(fù)制方式是真菌病毒分類的主要依據(jù)，目前所發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)真菌病毒的基因組核酸是雙鏈RNA（doublestranded RNA，dsRNA）。dsRNA病毒主要屬于6個(gè)科，分別是：呼腸孤病毒科（Reoviridae）、全病毒科（Totiviridae）、雙分病毒科（Paritiviridae）、產(chǎn)黃青霉病毒科（Chrysoviridae）、四分體病毒科（Quadriviridae）和巨型雙節(jié)段病毒科（Megabirnaviridae）［9］。其中全病毒科具有無(wú)包膜結(jié)構(gòu)的正二十面體球形顆粒的病毒粒體結(jié)構(gòu)，直徑約為40 nm。病毒基因組不分段，僅由一段4.6-6.7 kb的線性dsRNA分子組成，包含了兩個(gè)開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）分別編碼衣殼蛋白（Capsid protein，CP）和依賴于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependentRNA polymerase，RdRp）［9-10］。衣殼蛋白（CP）靠近5'端，而依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）靠近3'端。全病毒科中一共有5個(gè)屬，分別是：全病毒屬（Totivirus），維多利亞屬（Victorivirus），梨形鞭毛蟲(chóng)病毒屬（Giardiavirus），滴蟲(chóng)病毒屬（Trichomonasvirus）和 利 什 曼 原 蟲(chóng) 病 毒 屬（Leishmaniavirus）［10］。其中能夠侵染真菌的只有兩個(gè)屬，分別為：Totivirus和Victorivirus［11］。Totivirus主 要 侵 染Saccharomyces cerevisiae、Scheffersomyces segobiensis、Xanthophyllomyces dendrorhous等酵母和Ustilago maydis、Tuber aestivum等絲狀真菌［12-14］。Victorivirus只寄生于絲狀真菌中［15］，而且在Victorivirus屬的模式種維多利亞長(zhǎng)螺孢190S病毒（Helminthosporimn victoriavirus 190S；HvV190S）基因組中，靠近5'端的衣殼蛋白（CP）和靠近3'端的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）之間存在一個(gè)AUGA的序列，能啟動(dòng)一種被稱為翻譯終止后又重新啟動(dòng)翻譯（Termination and reinitiation）的機(jī)制將衣殼蛋白（CP）和依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）融合成一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框［16］。

2013年，首次報(bào)道了水稻稻曲病菌菌株中攜帶真菌病毒［17］。近幾年來(lái)，越來(lái)越多關(guān)于稻曲病菌中攜帶真菌病毒的報(bào)道［17-25］。本研究中，我們報(bào)道了一株從稻曲病菌菌株GZ-14-07中分離的真菌病毒，病毒命名為Ustilaginoidea virensRNA virus 6（UvRV6）。在對(duì)UvRV6的全基因組序列測(cè)序和分析中，發(fā)現(xiàn)UvRV6屬于全病毒科維多利亞屬病毒的新成員。

1 材料與方法

1.1 材料

稻曲病菌菌株GZ-14-07于2014年從貴州省稻曲病菌侵染的水稻稻曲球中分離出。

1.2 方法

1.2.1 稻曲病菌菌株GZ-14-07的分離 將稻曲球切分成小塊，用5%的次氯酸鈉將新鮮的稻曲球進(jìn)行表面消毒1 min左右，用無(wú)菌蒸餾水浸泡3次，隨后用75%的酒精表面消毒l min左右，再用無(wú)菌蒸餾水浸泡3次，然后置于無(wú)菌離心管中震蕩制備成稻曲病菌的厚垣孢子的懸浮液，并用無(wú)菌蒸餾水將厚垣孢子懸浮液稀釋成10倍梯度的孢子液，用移液槍吸取l00 μL不同梯度的孢子液分別涂布在含有100 μg/mL頭孢霉素的土豆葡萄糖培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA）上置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，逐日觀察分離結(jié)果，待菌落長(zhǎng)出后，挑取單個(gè)菌落。對(duì)所有成功分離獲得的菌株進(jìn)行編號(hào)，保存在-20℃冰箱中。

1.2.2 dsRNA的提取和純化 挑取目標(biāo)菌株GZ-14-07，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7-10 d。將菌株GZ-14-07的菌絲體在液氮冷凍條件下用碾缽研磨成粉末狀，裝入無(wú)菌離心管中。每0.4 g樣品中依次加入600 μL 2×GPS、600 μL苯酚（Tris-HCl 飽和，pH 8.0）、600 μL氯仿-異戊醇（24∶1）和138 μL 10% SDS，劇烈振蕩。使之充分混勻，12 000 r/min 4℃離心10 min。然后取上清液約600 μL，加入0.04 g CF-11纖維素粉末和114 μL無(wú)水乙醇，混勻后4℃冰浴過(guò)夜。然后離心機(jī)12 000 r/min離心5 min后棄上清液，倒扣濾紙上吸干殘液，移液器加入600 μL清洗緩沖液，混勻后靜置1 min；重復(fù)洗脫3次后，加入640 μL 1× STE，混合搖勻，12 000 r/min離心8 min并吸取600 μL上清液至新的無(wú)菌離心管中，加入1/10體積的3 mol/L NaAc，加入1倍體積的異丙醇，充分混勻后于-20℃冰箱中靜置2 h，12 000 r/min 4℃離心30 min，去除上清液，加入500 μL 75%乙醇，振蕩無(wú)菌離心管，將沉淀彈起，清洗沉淀，12 000 r/min 4℃離心5 min后棄去上清液，用移液槍吸去管底的多余液體，風(fēng)干沉淀10 min，加入20 μL DEPC-H2O，沉淀溶解完全得到菌株GZ-14-07中的真菌病毒。用DNase I（RNase free，TaKaRa，Dalian，China）和S1核酸酶（TaKaRa，Dalian，China）處理樣品，去除樣品中的DNA和單鏈RNA（single-stranded RNA，ssRNA）污染。樣品在1%瓊脂糖凝膠中電泳，用0.1 μg/mL溴化乙錠染色，紫外下觀察UvRV6的條帶特征。

1.2.3 cDNA合成和分子克隆 將純化的dsRNA樣品作為模板，采用隨機(jī)引物擴(kuò)增法獲得了UvRV6的隨機(jī)序列［26］。病毒末端克隆的方法參考Potgieter等采用的方法［27］，首先在dsRNA的兩末端加上一段已知序列的接頭片段，然后將加上接頭的dsRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，最后用與該序列互補(bǔ)的一段寡核苷酸作為引物，另一引物根據(jù)已測(cè)定序列設(shè)計(jì)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）獲取dsRNA末端的序列。將擴(kuò)增的cDNA產(chǎn)物與pMD18-T載體（TaKaRa，Dalian，China）進(jìn)行連接，并熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，鑒定陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.4 序列拼接和系統(tǒng)進(jìn)化分析 得到的序列被組裝并上傳GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲取的登錄號(hào)為KX171636。序列拼接、分析和比對(duì)使用DNAMAN 7.0和COBALT web 服務(wù)器（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi?link_loc=BlastHomeLink）；序列同源性搜索使用NCBI網(wǎng)站的在線BLAST程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建使用的是鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）。NJ樹(shù)的計(jì)算使用MEGA6.0軟件［28］，采用默認(rèn)參數(shù)設(shè)置，重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000。用DotKnot程序預(yù)測(cè)RNA假結(jié)［29］。

2 結(jié)果

2.1 UvRV6的條帶類型

水稻稻曲病菌株GZ-14-07中提取的真菌病毒，經(jīng)DNase I和S1核酸酶處理，在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)到在6 kb附近有一條單一的明顯的dsRNA條帶（圖1），命名為Ustilaginoidea virensRNA virus 6（UvRV6）。

2.2 UvRV6序列分析

UvRV6全長(zhǎng)5 043個(gè)堿基（圖2），G+C含量為48.8%。通過(guò)隨機(jī)引物擴(kuò)增法得到UvRV6的隨機(jī)片段（圖2中1-15），經(jīng)過(guò)DNAMAN 7.0軟件進(jìn)行序列拼接，發(fā)現(xiàn)并不能完全拼接出一條完整的全基因組序列。隨后，根據(jù)已獲取的基因組序列設(shè)計(jì)特異性的搭橋引物A-F，通過(guò)PCR克隆出未獲得的基因組序列，最后通過(guò)DNAMAN 7.0軟件拼接得到一條完整的UvRV6基因組序列。

圖1 菌株GZ-14-07的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

2.3 UvRV6的全基因組序列

UvRV6含有兩個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF1和ORF2）（圖3）。ORF1起始于第222位堿基，終止于第2 505位的UGA密碼子，全長(zhǎng)2 280個(gè)堿基，編碼760個(gè)氨基酸（79.6 kD）。ORF2起始于第2 502位的AUG密碼子，終止于第4 991位堿基，全長(zhǎng)2 385個(gè)堿基，編碼830個(gè)氨基酸（91.5 kD）。5'和3'末端非翻譯區(qū)分別長(zhǎng)222個(gè)堿基和52 個(gè)堿基。通過(guò)BlastP比對(duì)分析顯示ORF1與全病毒科維多利亞屬病毒的衣殼蛋白（CP）有很高的相似性，尤其是與Ustilaginoidea virensRNA virus 3（UvRv3）的衣殼蛋白（CP）的同源性達(dá)到73%；ORF2與全病毒科維多利亞屬病毒的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）有顯著的相似性，跟UvRV3的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）同源性高達(dá)75%。因此，UvRV6的ORF1編碼病毒的衣殼蛋白（CP），ORF2編碼病毒的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp），UvRV6是全病毒科維多利亞屬中的一員。四核苷酸（AUGA）將ORF1和ORF2連接起來(lái)，它包含ORF1的終止密碼子（UGA）和ORF2的起始密碼子（AUG），在全病毒科維多利亞屬中這4個(gè)核苷酸（AUGA），能啟動(dòng)一種叫翻譯終止后又重新啟動(dòng)翻譯（Termination and reinitiation）的機(jī)制使ORF1和ORF2被融合成一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框（ORF）（圖3）。

圖2 UvRV6的克隆策略示意圖

圖3 UvRV6的翻譯終止后又重新啟動(dòng)翻譯機(jī)制

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

為了構(gòu)建UvRV6的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，我們選擇了21株全病毒科成員，包括4株Totivirus、9株Victorivirus、3株Leishmaniavirus、3株Trichomonasvirus和2株Giardiavirus?；谶x擇的21株全病毒科成員 和UvRV6的RdRp區(qū) 域，運(yùn) 用MEGA6.0軟 件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)得知，UvRV6跟其他的全病毒科（Totiviridae）維多利亞屬（Victorivirus）的病毒成員匯集在一起，屬于全病毒科維多利亞屬的新成員。尤其跟Ustilaginoidea virensRNA virus 3（UvRV3）的親緣關(guān)系最近（圖4）。

2.5 UvRV6和相關(guān)病毒在病毒大小及其他結(jié)構(gòu)方面的比較分析

圖4 UvRV6的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

表1 UvRV6和相關(guān)病毒在病毒大小和其他結(jié)構(gòu)方面的比較分析

選擇6個(gè)已報(bào)道的從U.virens中分離的全病毒科維多利亞屬的真菌病毒，在大小及其他結(jié)構(gòu)方面的一些特征與UvRV6進(jìn)行比較（表1）。與其他6個(gè)真菌病毒相比，UvRV6顯示出一些異同點(diǎn)。由表1可知UvRV6的基因組全長(zhǎng)5 043個(gè)堿基，其他成員的基因組都在5 000 個(gè)堿基左右，基因組的長(zhǎng)度相差不大；UvRV6的兩個(gè)ORF框的重疊區(qū)域是四核苷酸（AUGA），而其他成員的ORF框重疊區(qū)域是五核苷酸（UAAUG），顯示出UvRV6和這6個(gè)全病毒科維多利亞屬的真菌病毒中都存在翻譯終止后又重新啟動(dòng)翻譯（Termination and reinitiation）的機(jī)制，但是它們的重疊區(qū)域不同；通過(guò)對(duì)UvRV6和維多利亞屬的這6個(gè)真菌病毒分析，發(fā)現(xiàn)這些真菌病毒的5'末端和3'末端分別有5個(gè)核苷酸是較保守的序列，其中UvRV6的5'末端是GGGCU，U. virensRNA virus 5、U. virensRNA virus 1 strain Uv0901和U.virensRNA virus 1 strain JYH-ZT是UGAAA，U. virensRNA virus L和U. virensRNA virus 3是CGAAA，U.virensRNA virus 1 strain HNHS-1是UAAUG，UvRV6的5'末端與這幾個(gè)病毒相比都是不同的；UvRV6的3'末端是CAUCG，U. virensRNA virus 5是UCAAA，U. virensRNA virus L是UUUUU，U. virensRNA virus 3是GCCAA，U. virensRNA virus 1 strain Uv0901和U. virensRNA virus 1 strain JYH-ZT是GGCAA，U.virensRNA virus 1 strain HNHS-1是ACAAA，UvRV6的3'末端與這幾個(gè)病毒相比都是不同的，從UvRV6的ORF框重疊區(qū)域和5'末端，3'末端與其他病毒相比沒(méi)有相同的地方，顯示了UvRV6在基因組結(jié)構(gòu)上的獨(dú)特性。BlastP分析表明，UvRV6的衣殼蛋白（CP）與U. virensRNA virus 3的同源性最高為73%，與其他病毒的同源性為38%-39%；UvRV6的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）與U. virensRNA virus 3的同源性最高為75%，與其他病毒的同源性分別為31%-38%。另外，UvRV6和其他6個(gè)病毒都有合成H型假結(jié)或莖環(huán)的結(jié)構(gòu)。

3 討論

在很多病毒的基因表達(dá)過(guò)程中存在一種叫程序性核糖體移碼（Programmed Ribosomal Frameshifting，PRF）的蛋白質(zhì)翻譯調(diào)節(jié)機(jī)制，常見(jiàn)的類型包括，-1程序性核糖體移碼機(jī)制（-1PRF）和+1程序性核糖體移碼機(jī)制（+1PRF）。-1PRF機(jī)制的產(chǎn)生需要兩個(gè)主要的信號(hào)元件，一個(gè)是七聚體核糖體移碼序列（XXX_YYY_Z，XXX=（AAA，TTT，CCC，GGG），YYY=（AAA，UUU），Z=（A，U，C））；另一個(gè)是能刺激程序性-1PRF的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)序列，即一個(gè)“莖環(huán)”或“假結(jié)”結(jié)構(gòu)；目前研究表明，+1PRF機(jī)制的產(chǎn)生只需要一個(gè)六聚體核糖體移碼序列元件（UUU_CGN，N=A，U，G，C）［32］。然而，在真菌病毒的全病毒科（Totiviridae）維多利亞屬（Victorivirus）成員中，由連續(xù)的終止密碼子和起始密碼子序列（如AUGA，UAAUG）和上游一個(gè)“莖環(huán)”或“假結(jié)”結(jié)構(gòu)構(gòu)成的-1程序性核糖體移碼機(jī)制，這種機(jī)制也被稱為內(nèi)部起始機(jī)制［9，33］。

在UvRV6的ORF1和ORF2之 間，我 們 發(fā) 現(xiàn)AUGA移碼序列和上游莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列（小寫(xiě)字母表示形成莖的堿基對(duì)）：（GAUGCggccAcagcCACUgcugg gccUGCGCCGCAAGUAUGA）的存在。另外，UvRV6的BlastP比對(duì)結(jié)果，表明UvRV6中ORF1與全病毒科維多利亞屬病毒的衣殼蛋白（CP）非常相似，其中，跟Ustilaginoidea virensRNA virus 3（UvRv3）的衣殼蛋白（CP）有73% 的同源性。Phomopsis vexansRNA virus（PvRV）的衣殼蛋白（CP）有66%的同源性。ORF2也與全病毒科的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）有顯著的相似性，包括跟UvRV3的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）同源性為75%。Phomopsis vexansRNA virus（PvRV）的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）同源性為51%和Nigrospora oryzaevictorivirus 1（NoV1）的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）同源性為50%。從UvRV6的ORF1和ORF2跟全病毒科維多利亞屬的衣殼蛋白（CP）和依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）的相似性來(lái)看，可以推測(cè)出UvRV6屬于全病毒科維多利亞屬中的新成員。新的真菌病毒的發(fā)現(xiàn)，以及獲取真菌病毒的全基因組序列并對(duì)其進(jìn)行分類學(xué)研究，能豐富真菌病毒資源庫(kù)，并提升對(duì)真菌病毒分類和進(jìn)化方面的認(rèn)識(shí)。

4 結(jié)論

UvRV6屬于全病毒科維多利亞屬的新成員，全長(zhǎng)5，043個(gè)堿基，含有兩個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF1和ORF2）。ORF1 長(zhǎng)2，280個(gè)堿基，760個(gè)氨基酸（79.6 kD），編碼衣殼蛋白（CP）；ORF2 長(zhǎng)2 385個(gè)堿基，830個(gè)氨基酸（91.5 kD），編碼依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）。UvRV6的ORF1和ORF2之間存在由AUGA移碼序列和上游莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列構(gòu)成的-1程序性核糖體移碼信號(hào)元件。