慢性乙型肝炎中醫(yī)證型與HBV-DNA的相關(guān)性研究

郭慧娟，郭 朋，張引強(qiáng)，鄭 穎，李 琦△

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.肝病科，北京 100091

我國(guó)約有1億慢性乙型肝炎(CHB)患者，每年很多該病患者死于與CHB相關(guān)的肝硬化、肝癌等疾病[1]。CHB屬于中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“脅痛”“黃疸”“虛勞”等范疇[2]。辨證論治是中醫(yī)的核心，確定證型是中醫(yī)治病的前提[3]。西方醫(yī)學(xué)認(rèn)為CHB是因?yàn)榛颊弑灰倚透窝撞《?HBV)感染所致。西醫(yī)和中醫(yī)對(duì)CHB有著不同的治療措施。有研究報(bào)道，中西醫(yī)聯(lián)合治療CHB要優(yōu)于單獨(dú)西醫(yī)治療或單獨(dú)中醫(yī)治療[4]。本文把中醫(yī)的“證”和西醫(yī)的檢測(cè)指標(biāo)結(jié)合一起[5]，探索二者之間的聯(lián)系，使中醫(yī)辨證得以客觀化和標(biāo)準(zhǔn)化。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年2-12月在本院肝病科門(mén)診就診的119例初診CHB患者，其中男63例，年齡22～80歲，平均(56±21)歲；女56例，年齡27～87歲，平均(50±16)歲。通過(guò)醫(yī)院信息系統(tǒng)收集所有患者的證型以及HBV-DNA等實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[6-7]分為濕熱內(nèi)蘊(yùn)組(12例，其中男8例，女4例)、肝腎陰虛組(18例，其中男11例，女7例)、肝郁脾虛組(45例，其中男22例，女23例)、氣滯血瘀組(44例，其中男22例，女22例)。各組年齡和性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有患者及家屬均知情同意，并簽署知情同意書(shū)。

1.2儀器與試劑 DNA檢測(cè)儀：Cobas z480 PCR儀(德國(guó)羅氏公司)；檢測(cè)試劑來(lái)自上海之江生物科技；分子診斷儀器：美國(guó)ABI公司的Gene Amp 7500 ABI實(shí)時(shí)熒光核酸檢測(cè)儀。

1.3方法 檢測(cè)不同中醫(yī)證型組患者的HBV-DNA水平。HBV-DNA拷貝數(shù)陰性標(biāo)準(zhǔn)：≤100 IU/mL。對(duì)HBV-DNA>100 IU/mL的標(biāo)本進(jìn)行X蛋白區(qū)、前C區(qū)和C區(qū)基因位點(diǎn)測(cè)序，測(cè)序區(qū)間為nt1652～nt1976。

1.4診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.4．1西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(2010年版)》[8]：既往乙型肝炎病史或乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性超過(guò)6個(gè)月，目前HBsAg和(或)HBV-DNA仍然為陽(yáng)性者，即可以診斷為慢性HBV感染。

1.4.2中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn) 中醫(yī)證型的分型參考《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)》[6]以及《中醫(yī)診斷學(xué)》[7]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，將CHB分為4種證型：濕熱內(nèi)蘊(yùn)型、肝腎陰虛型、肝郁脾虛型及氣滯血瘀型。

2 結(jié) 果

2.1不同中醫(yī)證型組HBV-DNA陽(yáng)性率及平均拷貝數(shù)比較 4組HBV-DNA陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中濕熱內(nèi)蘊(yùn)組與其他3組、肝腎陰虛組與其他3組HBV-DNA陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝郁脾虛組和氣滯血瘀組HBV-DNA陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4組HBV-DNA平均拷貝數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中濕熱內(nèi)蘊(yùn)組與肝郁脾虛組、氣滯血瘀組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),肝腎陰虛組與氣滯血瘀組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，肝郁脾虛組和氣滯血瘀組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同中醫(yī)證型組HBV-DNA陰性率、陽(yáng)性率及平均拷貝數(shù)比較

2.2不同中醫(yī)證型組基因突變情況比較 對(duì)HBV-DNA>100 IU/mL的標(biāo)本(共50例)進(jìn)行DNA測(cè)序。濕熱內(nèi)蘊(yùn)組、肝腎陰虛組、肝郁脾虛組、氣滯血瘀組的核苷酸突變率分別為90.0%(9/10)、70.0%(7/10)、66.7%(10/15)、60.0%(9/15)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。濕熱內(nèi)蘊(yùn)組、肝腎陰虛組、肝郁脾虛組、氣滯血瘀組人均核苷酸突變數(shù)為2.30、1.90、1.47、1.60個(gè)。統(tǒng)計(jì)這10個(gè)核苷酸位點(diǎn)，突變率位于前3位的分別是A1762T、G1764A、G1896A。核苷酸突變率最高的2個(gè)位點(diǎn)分別是nt1762和nt1764。見(jiàn)表2。

表2 不同證型組核苷酸突變數(shù)量統(tǒng)計(jì)(n)

3 討 論

在4組中，以濕熱內(nèi)蘊(yùn)組HBV-DNA陽(yáng)性率最高，說(shuō)明HBV的復(fù)制與濕熱具有高度聯(lián)系。有研究發(fā)現(xiàn)，在一定程度上，HBV復(fù)制的活躍程度是與濕熱輕重呈正相關(guān)的[9]，即HBV復(fù)制越活躍，其濕熱之邪越重。血清HBV-DNA是HBV復(fù)制和傳染性的重要標(biāo)志物，在HBV感染者血清中，HBV-DNA結(jié)果可持續(xù)陽(yáng)性。中醫(yī)理論認(rèn)為，HBV-DNA可以歸屬于“疫毒”。從微觀辨證來(lái)看，HBV-DNA為中醫(yī)之“疫毒”“邪氣”。人體“正氣”可理解為西醫(yī)的免疫系統(tǒng)。關(guān)于CHB不同證型的HBV-DNA病毒載量的比較有很多的報(bào)道，但HBV-DNA陽(yáng)性率比較的報(bào)道較少。本研究得出：濕熱內(nèi)蘊(yùn)組的HBV-DNA陽(yáng)性率最高，與另外3組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝腎陰虛組HBV-DNA陽(yáng)性率與另外3組相比，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝郁脾虛組和氣滯血瘀組的HBV-DNA陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。有報(bào)道稱，HBV拷貝數(shù)與濕熱程度密切相關(guān)，濕熱越重者HBV拷貝數(shù)越高，測(cè)定HBV-DNA水平可以作為中醫(yī)辨證中濕熱的客觀指標(biāo)[10]。本研究中濕熱內(nèi)蘊(yùn)組與肝郁脾虛組、氣滯血瘀組的HBV-DNA拷貝數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且4組中濕熱內(nèi)蘊(yùn)組HBV-DNA平均拷貝數(shù)最高，說(shuō)明病毒復(fù)制能力在濕熱內(nèi)蘊(yùn)組是最強(qiáng)的。

HBV-DNA長(zhǎng)鏈主要分為P、C、X、S 4個(gè)區(qū)，能夠編碼蛋白質(zhì)。本研究對(duì)HBV-DNA陽(yáng)性的患者進(jìn)行核苷酸檢測(cè)，從nt1652～nt1976對(duì)T1753、T1754、T1758、A1762、G1764、C1766、T1768、G1862、G1896、G1899這10個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)濕熱內(nèi)蘊(yùn)組HBV-DNA陽(yáng)性患者核苷酸突變率最高，達(dá)90.0%，其次是肝腎陰虛組，基因突變率為70.0%，接下來(lái)為肝郁脾虛組和氣滯血瘀組，突變率分別是66.7%和60.0%。但是這4組的基因突變率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？紤]可能是本研究選取的病例數(shù)太少所致，以后在研究中還要增加病例數(shù)，減少因抽樣所引起的誤差。這4組的人均核苷酸變異個(gè)數(shù)分別是2.30、1.90、1.47和1.60個(gè)。本研究50例HBV-DNA陽(yáng)性的患者核苷酸突變的總數(shù)為88個(gè)，以堿基改變?yōu)橛?jì)數(shù)基準(zhǔn)，其中核苷酸突變率最高的是A1762T，占核苷酸突變總數(shù)的27.3%(24/88)，其次為G1764A，占26.1%(23/88)，第3為G1896A，占19.3%(17/88)。核苷酸突變率最高的2個(gè)位點(diǎn)分別是nt1762和nt1764，與相關(guān)的報(bào)道結(jié)果大致相同[11]。這2個(gè)位點(diǎn)皆與肝損傷和E抗原假性轉(zhuǎn)陰相關(guān)。有研究表明，HBV的突變與HBV導(dǎo)致的慢性肝臟疾病的長(zhǎng)期感染密切相關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)：人均A1762T突變?cè)跐駸醿?nèi)蘊(yùn)組、肝腎陰虛組、肝郁脾虛組和氣滯血瘀組分別為0.7、0.6、0.3、0.4個(gè)；人均G1764A突變?cè)跐駸醿?nèi)蘊(yùn)組、肝腎陰虛組、肝郁脾虛組和氣滯血瘀組分別為0.8、0.5、0.3、0.3個(gè)。相關(guān)研究指出，肝損傷及肝病進(jìn)程與HBV的BCP區(qū)、PreC區(qū)和C基因區(qū)突變相關(guān)，特別是影響E抗原前體表達(dá)的nt1762和nt1764雙突變，此雙突變與肝損傷直接相關(guān)[13]。

由于時(shí)間有限，樣本例數(shù)較少，本研究只做了大致趨勢(shì)的說(shuō)明，為了避免偏倚，未進(jìn)一步分析。希望能在以后的研究中增加更多的數(shù)據(jù)，來(lái)研究突變位點(diǎn)和中醫(yī)證型的關(guān)系。