Zn2+、Cu2+對翅堿蓬生長的影響研究

趙雨朦，魏海峰*，李 悅，范詩文，牛禹霽， 劉長發(fā)，張明亮，何 潔，夏 寧，趙肖依

(1. 遼寧省近岸海洋環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，遼寧 大連116023； 2. 大連海洋大學(xué)，海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連116023； 3. 大連海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連116023)

重金屬污染是目前最為嚴(yán)峻的土壤污染問題。土壤中的重金屬會引起植物葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的毒害效應(yīng)，抑制細(xì)胞核分裂、細(xì)胞膜的滲透機制紊亂失調(diào)、破損、抗氧化酶系統(tǒng)損傷等[1-5]。有調(diào)查顯示，我國土壤污染超標(biāo)率高達(dá)16.1%，污染類型以重金屬污染為主，其污染物不僅包括 Cd、Cr 等植物非必需的元素，還包括 Cu、Zn 等植物必需的微量元素，在 Cu、Zn 過量時也會對植物產(chǎn)生危害[6-7]。此外重金屬是一類典型的累積性污染物，可通過食物鏈逐級傳遞富集，并在某些條件下轉(zhuǎn)化為毒性更大的金屬有機化合物，嚴(yán)重危害植物和人類健康。鋅作為植物生長發(fā)育的必需生長元素，當(dāng)植物體內(nèi)鋅濃度超過一定閾值，其主要作用由營養(yǎng)轉(zhuǎn)為毒害，抑制植物生長[8]。此外植物體內(nèi)鋅過量還會引起其他必需元素缺乏，進(jìn)而影響植物的一系列正常生理代謝活動[9]。銅不僅參與植物的光合作用，更是多酚氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、抗壞血酸氧化酶等多種酶類的結(jié)構(gòu)成分和催化活性成分，其對于植物的生長發(fā)育過程同樣有重要意義。但過量的銅會對植物同樣會產(chǎn)生毒害作用，使植物的水分代謝、光合作用、呼吸作用等各項生理代謝發(fā)生紊亂，生長緩慢，阻滯生長發(fā)育，降低產(chǎn)量，并可在食用部位積累，對人類健康造成嚴(yán)重危害[10-11]。

翅堿蓬為耐鹽性草本植物，其作為北方灘涂的優(yōu)勢種植物[12]，是一種典型的鹽堿地指示植物，具有良好的經(jīng)濟開發(fā)潛力和生態(tài)價值[13-14]。盤錦紅海灘位于遼河入?？?，依托于濱海濕地而存在，火紅的堿蓬草成為紅海灘得天獨厚的資源，但近年來由于各種污染加劇，翅堿蓬出現(xiàn)大面積死亡的現(xiàn)象。為探究其死亡原因，目前已有很多學(xué)者做出相關(guān)研究，但對于鋅、銅這些植物所必需的微量元素對翅堿蓬生長影響的研究較少。因此，以翅堿蓬為研究對象，研究在不同Zn2+、Cu2+濃度處理下其生長及生理指標(biāo)的變化情況，以期為濕地生態(tài)環(huán)境修復(fù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用翅堿蓬種子取自遼寧省盤錦市大洼區(qū)趙圈河鎮(zhèn)。所用純水由實驗室純水機制出。

1.2 試驗方法

選擇大小一致、飽滿的種子在實驗室進(jìn)行水培養(yǎng)。在種子萌發(fā)后長至一定高度(5 cm)后，選擇長勢一致的翅堿蓬幼苗，將其移栽至更有助于翅堿蓬直立生長的內(nèi)置經(jīng)過75%酒精消毒的太空棉的容器中。生長至20天左右，在翅堿蓬已經(jīng)有一定高度(約10 cm)時，分別加入同體積的不同濃度(0.1、5、10、50 mg/L)Zn2+和Cu2+溶液，并且設(shè)置同體積營養(yǎng)液為對照組，各做三組平行試驗。營養(yǎng)液配置方法參照霍格蘭營養(yǎng)液配置并有所改進(jìn)，具體成分見表1、2。本試驗為了保證翅堿蓬不受病害和污染的影響，以及重金屬溶液濃度的恒定，每隔三天更換一次培養(yǎng)液，且將幼苗放置于室內(nèi)有光照的地方。每五天測定翅堿蓬生理生化指標(biāo)一次，包括花青素、葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量和植株含水率，共進(jìn)行35天。

表1 營養(yǎng)液成分中大量元素濃度Table 1 The concentration of macronutrients in nutrient solution

表2 營養(yǎng)液成分中微量元素濃度Table 2 The concentration of microelements in nutrient solution

1.3 指標(biāo)測定

(1)含水率

每個濃度梯度分別取三株翅堿蓬，記錄編號，瀝干表面水分，分析天平稱重，記錄數(shù)據(jù)(鮮重)；將所有樣品放置在培養(yǎng)皿中，放入烘箱105oC下烘干3 h；取出培養(yǎng)皿，冷卻至室溫，用分析天平稱重，記錄數(shù)據(jù)(干重)。

(2)花青素含量測定參照于曉楠(2000年)試驗方法[15]，并有所改進(jìn)。

取整株樣品，記錄鮮重后用組織勻漿器充分研磨后，用3 mL的0.1 mol/L鹽酸乙醇溶液沖洗組織研磨器，將內(nèi)容物盡量沖出，移至比色管中，室溫下浸提1 h。

將比色管中液體移入比色皿中，用中速濾紙和漏斗進(jìn)行過濾，取澄清濾液，用752N紫外分光光度計分別測定在530、620、650nm波長下的吸光度A530、A620、A650；用下列公式計算花青素含量。

花青素光密度值：OD =(A530-A620)-0.1*(A650- A620)

式中：ξ——摩爾消光系數(shù)(46200)

m——翅堿蓬質(zhì)量(g)

V——提取液體積(mL)

(3)葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量測定參照楊喜珍(2019年)實驗方法[16]。

取整株樣品，記錄鮮重后用組織勻漿器充分研磨后，用10 mL的95%乙醇沖洗至25 mL比色管中，靜置30 min以完成光合色素的提取。

用中速濾紙和漏斗進(jìn)行過濾，取澄清濾液，用752N紫外分光光度計分別于649 nm和665 nm波長下測定吸光度值，記為A649、A665。

葉綠素濃度計算公式：

葉綠素a濃度C(chl-a)=13.95×A665-6.88×A649

葉綠素b濃度C(chl-b)=24.96×A649-7.32×A665

總?cè)~綠素濃度C(chl)=C(chl-a)+C(chl-b)

求得色素濃度后，按下式計算單位鮮重各色素含量：

式中：c——色素濃度(mg/L)

V——提取液體積(L)

n——稀釋倍數(shù)

m——樣品鮮重(g)

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS19.0統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)，對不同濃度處理組之間的差異進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zn2+、Cu2+對翅堿蓬含水率影響

如圖1所示，翅堿蓬含水率隨時間變化未出現(xiàn)明顯的變化趨勢。通過觀察可以發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，不同濃度的Zn2+處理組對翅堿蓬的含水量均產(chǎn)生促進(jìn)作用；但隨著Zn2+濃度的增加，促進(jìn)效果逐漸減弱。以第20天為例，當(dāng)Zn2+濃度為0.1 mg/L時含水率最高，相比于對照組提高了8.0%；當(dāng)Zn2+濃度為50 mg/L時，其相比于對照組提高了4.5%。

圖1 不同Zn2+濃度下的翅堿蓬含水率Fig. 1 Moisture content of S. heteroptera under different concentrations of Zn2+注：同列(行)中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P < 0.05)，下同。

由圖2可知，翅堿蓬含水率隨時間變化未出現(xiàn)明顯的變化趨勢。但通過觀察可以發(fā)現(xiàn)，在同一天中與對照組相比，不同濃度Cu2+處理組對翅堿蓬含水量均產(chǎn)生抑制作用，且隨Cu2+濃度升高抑制作用逐漸增強。

圖2 不同Cu2+濃度下的翅堿蓬含水率Fig. 2 Moisture content of S. heteroptera under different concentrations of Cu2+

2.2 Zn2+、Cu2+對翅堿蓬花青素含量影響

如圖3所示，翅堿蓬中花青素含量隨時間變化未出現(xiàn)明顯的變化趨勢。通過觀察數(shù)據(jù)圖可以發(fā)現(xiàn)，除第15天外，低濃度的Zn2+對花青素的合成有一定的促進(jìn)作用，但未表現(xiàn)出明顯的規(guī)律。

圖3 不同Zn2+濃度下翅堿蓬的花青素含量Fig. 3 Anthocyanin content of S. heteroptera under different concentrations of Zn2+

由圖4可知，翅堿蓬體內(nèi)花青素含量隨時間變化而升高。同一天中花青素含量隨Cu2+濃度增加先升高再降低，且均高于對照組；當(dāng)Cu2+濃度為10 mg/L時，促進(jìn)作用最明顯。這說明在適宜濃度范圍內(nèi)Cu2+對花青素的合成起促進(jìn)作用；若繼續(xù)增加Cu2+濃度，超過適宜濃度范圍，花青素的合成將會受到抑制。

圖4 不同Cu2+濃度下翅堿蓬的花青素含量Fig. 4 Anthocyanin content of S. heteroptera under different concentrations of Cu2+

2.3 Zn2+、Cu2+對翅堿蓬葉綠素a含量影響

由圖5可知，葉綠素a含量隨時間變化呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在第25天葉綠素a含量達(dá)到最高。在同一天中隨著Zn2+濃度升高，葉綠素a含量先增加后減少。以第25天為例，當(dāng)Zn2+濃度為0.1 mg/L時，葉綠素a含量相比于對照組提高了45.21%；當(dāng)Zn2+濃度為50 mg/L時，其含量相比于對照組降低了5.11%。這說明Zn2+對葉綠素a合成的影響表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)、高濃度抑制。

圖5 不同Zn2+濃度下翅堿蓬的葉綠素a含量Fig. 5 Chlorophyll a content of S. heteroptera under different concentrations of Zn2+

如圖6所示，翅堿蓬體內(nèi)葉綠素a含量隨時間變化基本呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，在第25天葉綠素a含量達(dá)到最高。從第15天開始低濃度的Cu2+對葉綠素a的合成有一定的促進(jìn)作用，但未表現(xiàn)出明顯的變化規(guī)律。

圖6 不同Cu2+濃度下翅堿蓬的葉綠素a含量Fig. 6 Chlorophyll a content of S. heteroptera under different concentrations of Cu2+

2.4 Zn2+、Cu2+對翅堿蓬葉綠素b含量影響

如圖7所示，翅堿蓬體內(nèi)葉綠素b的含量隨時間變化先增加后減少，在第25天達(dá)到最大值。同一天中葉綠素b含量隨Zn2+濃度先增加后減少，同樣表現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象，與葉綠素a類似。此外如圖8所示，以第20天為例，可以發(fā)現(xiàn)葉綠素a與葉綠素b的比值隨Zn2+濃度增加而降低。

圖7 不同Zn2+濃度下翅堿蓬的葉綠素b含量Fig. 7 Chlorophyll b content of S. heteroptera under different concentrations of Zn2+

圖8 第20天不同Zn2+濃度下的葉綠素a/b值Fig. 8 Ratio of chlorophyll a to chlorophyll b at different Zn2+ concentrations on the twenty day

由圖9可知，Cu2+對葉綠素b合成的影響未表現(xiàn)出明顯趨勢。此外如圖10所示，以第20天葉綠素a與葉綠素b比值為例，可以發(fā)現(xiàn)葉綠素a/b值隨Cu2+濃度增加而減小，相關(guān)方程及系數(shù)分別為y=-0.3112x+2.3734，R2=0.7453。

圖9 不同Cu2+濃度下翅堿蓬的葉綠素b含量Fig. 9 Chlorophyll b content of S. heteroptera under different concentrations of Cu2+

圖10 第20天不同Cu2+濃度下的葉綠素a/b值Fig. 10 Ratio of chlorophyll a to chlorophyll b at different Cu2+ concentrations on the twenty day

2.5 Zn2+、Cu2+對翅堿蓬葉綠素總量影響

由圖11可知，翅堿蓬體內(nèi)總?cè)~綠素含量隨時間變化先增加后減少，在第25天總?cè)~綠素含量達(dá)到最高。此外在同一天中，總?cè)~綠素含量隨Zn2+濃度升高先增加后減少，當(dāng)Zn2+濃度在0.1～5 mg/L范圍時，總?cè)~綠素含量最高；若Zn2+濃度繼續(xù)增加，則總?cè)~綠素含量開始降低。

圖11 不同Zn2+濃度下翅堿蓬的總?cè)~綠素含量Fig. 11 Total chlorophyll content of S. heteroptera under different concentrations of Zn2+

如圖12所示，翅堿蓬中葉綠素總量隨時間先增加，在第25天后開始減少。此外還可以發(fā)現(xiàn)同一天中，翅堿蓬體內(nèi)葉綠素總量隨Cu2+濃度升高而增加。

圖12 不同Cu2+濃度下翅堿蓬的總?cè)~綠素含量Fig. 12 Total chlorophyll content of S. heteroptera under different concentrations of Cu2+

3 討論

3.1 Zn2+、Cu2+對翅堿蓬含水率的影響

鋅是植物生長發(fā)育的必需元素。但過量的鋅會使根系生理代謝過程失調(diào)，植物根系生長受到抑制，從而導(dǎo)致根系吸收能力減弱，使植物缺乏營養(yǎng)。根系是植物吸收水分和礦質(zhì)營養(yǎng)的重要器官[17]，因此植物體內(nèi)含水量的大小與根系的生長情況有直接聯(lián)系。試驗結(jié)果表明，在試驗所設(shè)的濃度范圍內(nèi)(0～50 mg/L)，Zn2+對翅堿蓬體內(nèi)的含水率均有促進(jìn)作用，促進(jìn)效果隨著Zn2+濃度的增加先增強后減弱。由此推斷，若繼續(xù)增加Zn2+濃度，高濃度的Zn2+將對翅堿蓬的含水率產(chǎn)生抑制作用。有研究表明[18]，低濃度Zn2+對鹽地堿蓬根系活力有促進(jìn)作用；當(dāng)Zn2+濃度超過0.4 g/L時，Zn2+開始對根系活力呈現(xiàn)抑制作用，這與本試驗結(jié)果一致。低濃度Zn2+使根系活力增強的原因可能是，其作為甘油醛-3-磷酸脫氫酶和乙醇脫氫酶的組成成分，進(jìn)入細(xì)胞后使酶的合成量增加，酶活性增強，根系活力隨之增強[18]。但過量的Zn2+會傷害植物根系，使植物根系生長受到阻礙，過量的Zn2+還會使植物地上部分出現(xiàn)褐色斑點并壞死[19-20]。

試驗結(jié)果表明，不同濃度的Cu2+(0～50 mg/L)均對翅堿蓬含水量產(chǎn)生抑制作用。Sheldon等人發(fā)現(xiàn)不同濃度Cu2+使羅德草(ChlorisgayanaKnuth.)的根毛數(shù)量和長度減少，根部明顯受損，分生組織被損害[21]。此外當(dāng)植物體內(nèi)Cu2+過量時，隨著Cu2+在根部沉積，根系生長將進(jìn)一步受到抑制[22]。祝沛平等[23]研究認(rèn)為，過量的Cu2+將抑制脫羧酶活性，最終造成根部大量NH4+的積累，植物根部損傷嚴(yán)重，主根伸長受到抑制，根尖出現(xiàn)硬化，生長點細(xì)胞分裂受到抑制，根毛數(shù)量減少甚至枯死。

3.2 Zn2+、Cu2+對翅堿蓬花青素含量的影響

花青素是植物次級代謝產(chǎn)物類黃酮中的一種重要的水溶性色素。類黃酮分子結(jié)構(gòu)上的酚羥基可以通過自身氧化釋放電子，直接清除自由基，起到抗氧化的作用[24]。因此植物組織在受到逆境刺激發(fā)生氧化脅迫時，花青素可以保護(hù)葉片降低其受到光抑制、氧化或動物啃食等傷害程度[25-26]。試驗結(jié)果表明，作為植物必需的營養(yǎng)元素，低濃度的Zn2+和Cu2+對花青素的合成均有促進(jìn)作用。若繼續(xù)增加Zn2+和Cu2+濃度，植物將會受到重金屬脅迫，體內(nèi)的抗氧化酶活性下降或抗壞血酸耗盡，此時花青素含量仍然上升，通過清除H2O2以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡[27-28]。但如果重金屬濃度超過植物可耐受的最大限度，其對植物的毒害作用就會表現(xiàn)出來，最終導(dǎo)致機體死亡。

3.3 Zn2+、Cu2+對翅堿蓬葉綠素含量的影響

葉綠素是植物光合作用中最重要的色素，是植物能否通過合成有機化合物將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能的關(guān)鍵。其在高等植物中主要以葉綠素a和葉綠素b的形式存在。鋅在葉片中大多數(shù)以自由離子、低分子化合物和金屬蛋白存在，也有少部分和細(xì)胞壁結(jié)合，呈現(xiàn)不溶的形態(tài)，植物中可溶的Zn2+是引起生理作用的主要形態(tài)[29]。試驗結(jié)果表明，隨著Zn2+濃度的增加，葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量均呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，當(dāng)Zn2+濃度在0.1～5 mg/L范圍時，葉綠素含量最高。即低濃度的Zn2+促進(jìn)葉綠素合成，高濃度的Zn2+抑制葉綠素合成。鋅作為植物生長所需的元素，參與葉綠素的合成過程，并且低濃度的Zn2+會加速葉綠素的合成。但如果Zn2+濃度過高，其將會改變植物對鐵的利用性。鐵的利用對葉綠素形成起著決定性的作用，一旦葉綠素的形成受到抑制，會大大影響植物光合作用，從而使葉片失綠，減少干物質(zhì)產(chǎn)量[30-31]。此外，劉茵[32]等也發(fā)現(xiàn)鋅對植物光合作用的影響的直接表現(xiàn)便是植物葉綠素含量降低，這與本試驗結(jié)果一致。

銅也是植物生長發(fā)育過程中一種必需元素，但過多的銅同樣會抑制植物光合作用，且引起葉色失綠，從而抑制植物生長[33]。試驗結(jié)果表明，在試驗所設(shè)的濃度范圍內(nèi)(0～50 mg/L)，不同濃度的Cu2+對翅堿蓬體內(nèi)葉綠素的合成均起促進(jìn)作用。其原因可能是，銅作為植物生長必需的元素，低濃度的Cu2+有利于植物體內(nèi)葉綠素的合成。此外植物對外部環(huán)境有一定的防御性，低濃度的Cu2+刺激葉綠素含量增加，這可能與翅堿蓬本身的抗性機制有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)的金屬蛋白結(jié)合了外來的有毒金屬離子，從而使重金屬的毒害作用被解除[33]。但如果Cu2+濃度過高，其毒害作用就會表現(xiàn)出來。過量的Cu2+與合成葉綠素的某些酶(原葉綠素酸酯還原酶、膽色素原脫氨酶和8-氨基乙酰丙酸合成酶)的-SH結(jié)合，改變了酶的結(jié)構(gòu)[34]，阻礙了葉綠素前體的合成，導(dǎo)致葉綠素分解；或Cu2+直接破壞葉綠體結(jié)構(gòu)阻礙葉綠素合成，導(dǎo)致葉綠素含量降低[33]。朱健等人[35]研究銅對?；ú松L的影響時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Cu2+濃度在 0.1～10 mg/L范圍內(nèi)時，海菜花幼苗中葉綠素含量隨 Cu2+處理濃度的增加而逐漸降低，與本文的試驗結(jié)果不一致。其原因可能是不同植物對于Cu2+的耐受性存在差異，因此需要進(jìn)一步研究。

3.4 Zn2+、Cu2+對翅堿蓬葉綠素a/b值的影響

葉綠素a主要吸收紅光，葉綠素b主要吸收藍(lán)紫光。葉綠素循環(huán)是植物在不同生理條件下實現(xiàn)的葉綠素a和葉綠素b間的相互轉(zhuǎn)化[36]。葉綠素a/b值可以表征葉片的老化，其值越小，表明葉片老化越嚴(yán)重[37]。試驗結(jié)果表明，以第20天為例，隨著Zn2+、Cu2+濃度的升高，不同處理組中葉綠素a/b的值減小。這說明重金屬對葉綠素a合成的抑制作用大于對葉綠素b合成的抑制作用，并且在重金屬脅迫下葉綠素a的降解速率大于葉綠素b的降解速率。此外，在重金屬的脅迫下，植物可能通過加快葉綠素a向葉綠素b的轉(zhuǎn)化而增加對弱光的利用，從而抵抗脅迫對其生長的影響[36]。

4 結(jié)論

鋅和銅作為植物必需的營養(yǎng)元素，低濃度的Zn2+和Cu2+作用于翅堿蓬時，對翅堿蓬的生長，花青素、葉綠素的合成產(chǎn)生促進(jìn)作用。當(dāng)環(huán)境中Zn2+和Cu2+濃度不利于翅堿蓬生長時，短時間內(nèi)翅堿蓬可以通過自身的應(yīng)激反應(yīng)來抵抗逆境。若環(huán)境中Zn2+和Cu2+濃度過高，毒害時間過長，翅堿蓬生長將會受到抑制，直至死亡。本研究結(jié)果可望為更深入研究濱海濕地的重金屬污染防治提供數(shù)據(jù)資料。