不同加工方法對(duì)覆盆子活性成分影響初探*

蔡妙婷 戴迪 袁源見 鄭明敏 楊海燕 王小青 李晶

（江西省中醫(yī)藥研究院 南昌330046）

覆盆子是薔薇科植物掌葉覆盆子RubuschingiiHu的干燥果實(shí)，具有益腎、固精、縮尿、養(yǎng)肝明目的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，覆盆子中含有黃酮、萜類等化合物[2～4]，具有較強(qiáng)的抗氧化、保肝作用[5～7]?！吨袊?guó)藥典》2015版記載含覆盆子的復(fù)方制劑多達(dá)十種，并將鞣花酸及山柰酚-3-0-蕓香糖苷作為覆盆子質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，規(guī)定按干燥品計(jì)算，含鞣花酸不得少于0.20%，含山柰酚-3-0-蕓香糖苷不得少于0.03%。中藥材產(chǎn)地加工干燥方法的不同，往往會(huì)對(duì)藥材的藥性產(chǎn)生影響，《中國(guó)藥典》2015 版記載覆盆子的加工方式為置沸水中略燙或略蒸，取出，干燥。目前，覆盆子的加工方法主要采用直接烘干的方式，龜鹿補(bǔ)腎丸中覆盆子則需蒸制，而不同加工方法對(duì)覆盆子中活性成分會(huì)產(chǎn)生何種影響，還未見文獻(xiàn)報(bào)道。故而本研究將采收的覆盆子分別用蒸法、煮法及直接烘干法進(jìn)行加工，以鞣花酸及山柰酚-3-0-蕓香糖苷的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，初步探討不同加工方法對(duì)覆盆子中活性成分的影響，為今后系統(tǒng)性研究覆盆子合理采收加工方法，優(yōu)化覆盆子產(chǎn)地加工技術(shù)，提高和控制覆盆子藥材質(zhì)量奠定了研究基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260 高效液相色譜儀（包括四元泵溶劑系統(tǒng)、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器，Agilent 公司）；MS105Du 十萬分之一天平（METTLER TOLEDO 公司）；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；103B 型高速中藥粉碎機(jī)（浙江省瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9101-2SA（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料 對(duì)照品鞣花酸（純度：89.3%，批號(hào)：111959-201602）、山柰酚-3-0- 蕓香糖苷（純度：90.8%，批號(hào)：112007-201602）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，甲醇、乙腈為色譜純（美國(guó)Tedia 公司），磷酸、無水乙醇為分析純，水為純凈水。覆盆子新鮮藥材于2019 年4 月采自江西天之海藥業(yè)股份有限公司德興覆盆子種植基地，經(jīng)江西省中醫(yī)藥研究院虞金寶研究員鑒定為薔薇科植物掌葉覆盆子（R.chingii）的未成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品加工干燥 直接烘干法：稱取摘除果柄的覆盆子果實(shí)200 g，于65℃烘箱中干燥48 h；蒸法：稱取摘除果柄的覆盆子果實(shí)200 g，單層平鋪于蒸鍋中，待水沸騰后上鍋蒸制5 min，再于65℃烘箱中干燥48 h；煮法：稱取摘除果柄的覆盆子果實(shí)200 g，于5 倍量沸水中煮1 min 后，撈出，在65℃烘箱中干燥48 h。

2.2 供試品溶液的制備 分別取上述三種加工樣品粉末（過四號(hào)篩）約1 g，精密加入70%甲醇50 ml，精密稱重，加熱回流60 min，放冷，再次精密稱重，以70%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鞣花酸、山柰酚-3-0-蕓香糖苷對(duì)照品適量，用甲醇溶解并定容，制成濃度分別為鞣花酸0.019 9 mg/ml、山柰酚-3-0-蕓香糖苷0.011 3 mg/ml 的對(duì)照品溶液。

2.4 色譜條件 色譜柱：Welchrom C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）；按表1 的條件進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：鞣花酸在254 nm 有最大吸收，山柰酚-3-0-蕓香糖苷在344 nm 有最大吸收；柱溫：25℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl。對(duì)照品和供試品高效液相色譜（HPLC）圖見圖1～圖2。

表1 梯度洗脫條件

圖1 波長(zhǎng)254 nm 下覆盆子對(duì)照品（A）與供試品（B）HPLC 圖

圖2 波長(zhǎng)344 nm 下覆盆子對(duì)照品（C）與供試品（D）HPLC 圖

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取鞣花酸、山柰酚-3-0-蕓香糖苷對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、30、50 μl，注入液相色譜儀，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行操作。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：鞣花酸y=446.77x+934.96（r=0.999 6）、山柰酚-3-0-蕓香糖苷y=27.252x+105.14（r=0.999 2），結(jié)果表明鞣花酸及山柰酚-3-0- 蕓香糖苷分別在0.019 9～0.597 0 μg、0.011 3～0.565 0 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次10 μl，測(cè)定峰面積，分別計(jì)算鞣花酸及山柰酚-3-0-蕓香糖苷的峰面積RSD 為0.76%、2.17%。測(cè)定結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取覆盆子供試品粉末（直接烘干法）6 份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算鞣花酸和山柰酚-3-0-蕓香糖苷的含量，RSD 分別為0.55%、0.67%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取覆盆子供試品溶液（直接烘干法），按“2.4”項(xiàng)下的色譜條件，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得到鞣花酸及山柰酚-3-0- 蕓香糖苷峰面積RSD 分別為0.54%、0.67%，表明該供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 樣品測(cè)定 取覆盆子各種加工方法的樣品各2份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果蒸法所得覆盆子藥材中鞣花酸及山柰酚-3-0-蕓香糖苷含量分別為0.085%、0.058%，煮法為0.090%、0.044%，直接烘干法為0.113%、0.058%。色譜圖見圖3～圖4。

圖3 波長(zhǎng)254 nm 下不同加工方法所得覆盆子樣品HPLC 圖

圖4 波長(zhǎng)344 nm 下不同加工方法所得覆盆子樣品HPLC 圖

3 討論

研究結(jié)果表明，不同加工方法對(duì)覆盆子中的鞣花酸及山柰酚-3-0-蕓香糖苷兩種活性成分含量略有影響，其中鞣花酸含量在直接烘干法樣品中最高，煮法次之，蒸法最低。由于鞣花酸常與葡萄糖、阿拉伯糖等縮合形成糖苷，或以鞣質(zhì)的形式存在[8]，這種含量的改變可能與糖苷或鞣質(zhì)的水解和鞣質(zhì)在加熱后凝固有關(guān)，從而影響了鞣花酸的提取量。而山柰酚-3-0-蕓香糖苷在直接烘干法和蒸法中含量相近，煮法中含量最低，這可能與苷類的水解和加工過程中的有效成分溶出有關(guān)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，通過改變覆盆子加工干燥方法，可以改變藥材中各活性成分的含量，但這種含量的變化，對(duì)藥材藥效的影響還不明確。本研究只是通過測(cè)定藥典中的兩個(gè)活性指標(biāo)的含量變化，從而初步探究了加工方法對(duì)含量的影響，但加工方法對(duì)活性成分含量的影響機(jī)制還需后期進(jìn)行系統(tǒng)性的研究，以期探明覆盆子各化學(xué)成分之間的轉(zhuǎn)化規(guī)律，以及含量變化后藥理作用的變化。本研究為今后確定覆盆子活性成分，優(yōu)化覆盆子加工工藝奠定了基礎(chǔ)。