丹參酮ⅡA預(yù)防大鼠椎板切除術(shù)后硬膜外疤痕增生的機(jī)制分析

史宗坡 王剛 王彬彬 賈根 劉軍

丹參酮ⅡA是丹參的有效成分,其作為一種心血管藥物,廣泛應(yīng)用于臨床[1]。此外有研究證明,丹參酮ⅡA可誘導(dǎo)疤痕組織中成纖維細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到抑制其增生的作用,但具體機(jī)制尚未闡明[2]。本次研究旨在比較不同濃度丹參酮ⅡA干預(yù)對(duì)SD大鼠椎板切除術(shù)后硬膜外疤痕增生的效果,以期為今后丹參酮ⅡA應(yīng)用于臨床奠定理論依據(jù),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的雄性成年Sprague-Dawley大鼠24只,清潔級(jí),體質(zhì)量250～300 g,自然光照下常規(guī)飼養(yǎng),室溫保持在23 ℃左右。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將其分為Ⅰ～Ⅳ組，每組各6只。實(shí)驗(yàn)大鼠均健康,Ⅰ組平均體質(zhì)量為(232.7±7.6)g,Ⅱ組平均體質(zhì)量為(233.5±7.7)g,Ⅲ組平均體質(zhì)量為(233.0±7.5)g,Ⅳ組平均體質(zhì)量為(231.9±7.4)g,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 (1)Attune NxT流式細(xì)胞儀(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司);(2)Eppendorf 5427 R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(艾本德中國有限公司);(3)奧林巴斯CX23顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社);(4)電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);(5)10%水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司);(6)二甲基亞砜(南京東德化工有限公司);(7)免疫組織化學(xué)SP試劑盒(美國Sigma公司);(8)p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白檢測(cè)試劑盒(北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司);(9)小動(dòng)物高場磁共振成像儀,型號(hào):Biospec 7T/20 USR(德國Bruker公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 L1椎板切除SD大鼠模型制備:大鼠均以10% 水合氯醛(2.5～3.0 mL/kg)腹腔注射麻醉,俯臥位固定。背部脫毛備皮,取鼠脊柱正中切口長約2 cm,顯露L1和L2椎板,切除全L1椎板,顯露硬脊膜,壓迫止血。

1.3.2 丹參酮ⅡA干預(yù)動(dòng)物模型的建立:將丹參酮ⅡA溶解于二甲基亞砜,Ⅰ組按100 mg/kg劑量制成10 mL溶液給予腹腔注射;Ⅱ組按200 mg/kg劑量制成10 mL溶液給予腹腔注射;Ⅲ組按300 mg/kg劑量制成10 mL溶液給予腹腔注射。Ⅳ組腹腔注射10 mL生理鹽水。

1.3.3 瘢痕面積測(cè)量:干預(yù)后1個(gè)月，每組隨機(jī)選取3個(gè)標(biāo)本進(jìn)行MRI掃描(磁場強(qiáng)度:7T,高分辨像,橫切面圖像,序列:15層,層厚0.8 mm,層間距1.3 mm),應(yīng)用REGION OF INTEREST TOOL對(duì)所選MRI圖像硬脊膜后方感興趣區(qū)進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算瘢痕面積。

1.3.4 成纖維細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期G0/G1期比例計(jì)算:于干預(yù)后24 h、72 h和120 h時(shí)精確切取各組大鼠約0.5 g疤痕組織,分別制備細(xì)胞懸液,根據(jù)Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)專用試劑盒的說明書進(jìn)行操作,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)疤痕組織中成纖維細(xì)胞凋亡率。將上述時(shí)間點(diǎn)制備的細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿,經(jīng)乙醇固定、PBS洗滌、孵育、染色后用300目篩網(wǎng)過濾,調(diào)整細(xì)胞濃度至109/mL,由流式細(xì)胞儀檢測(cè),計(jì)算細(xì)胞周期G0/G1比例。

1.3.5 檢測(cè)p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)水平:干預(yù)后120 h取大鼠疤痕組織,制備成纖維細(xì)胞懸液,于4 ℃下裂解20 min,提取總蛋白,測(cè)定蛋白濃度并定量。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜,室溫下用脫脂奶粉封閉2 h,加入1∶500稀釋的一抗后室溫孵育過夜,三乙醇胺緩沖鹽溶液(TBS)洗滌2次,加入1∶500稀釋的二抗,室溫孵育2 h,TBS洗滌2次。通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影檢測(cè),以p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3與內(nèi)參β-actin蛋白的積分光密度(IOD)比值作為上述蛋白的相對(duì)表達(dá)量[3]。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠瘢痕面積比較 術(shù)后所有大鼠傷口愈合良好。干預(yù)后1個(gè)月，4組瘢痕面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),由大到小依次為Ⅳ組、Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組[(2.56±0.12)mm2,(1.92±0.10)mm2,(1.77±0.12)mm2,(1.51±0.09)mm2]。

2.2 各組大鼠成纖維細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期G0/G1期比例比較 4組干預(yù)后24 h、72 h及120 h,不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.663,P<0.001);4組間成纖維細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.223,P<0.001),其中Ⅲ組成纖維細(xì)胞凋亡率較高;4組的成纖維細(xì)胞凋亡率變化趨勢(shì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.004,P<0.001)。4組不同時(shí)間點(diǎn)的G0/G1期比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.884,P<0.001),4組間比較,差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.661,P<0.001),其中Ⅲ組G0/G1期比例較高;4組的G0/G1期比例變化趨勢(shì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.337,P<0.001)。見表2。

表2 各組大鼠成纖維細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期G0/G1期比例比較

2.3 各組大鼠瘢痕組織p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)水平比較 干預(yù)后120 h 4組瘢痕組織中p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),p53、Caspase-3和Bax表達(dá)水平由高到低依次為Ⅲ組、Ⅱ組、Ⅰ組和Ⅳ組,survivin和Bcl-2表達(dá)水平由高到低依次為Ⅳ組、Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組。見表3。

表3 各組大鼠瘢痕組織p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)水平比較

3 討論

椎板切除術(shù)是脊柱外科中最常用的椎管減壓手術(shù)術(shù)式之一,但術(shù)后椎板切除區(qū)域常出現(xiàn)成纖維細(xì)胞大量增殖和細(xì)胞外基質(zhì)代謝異常,導(dǎo)致硬膜外瘢痕粘連,并牽拉鄰近區(qū)域硬膜和神經(jīng)根,引起一系列相應(yīng)癥狀,嚴(yán)重影響手術(shù)療效,這也正是下腰椎術(shù)后失敗綜合征發(fā)生的主要原因[4]。盡管硬膜外瘢痕粘連可以通過二期手術(shù)得以松解,但粘連常在術(shù)后2～4周后再次發(fā)生,甚至?xí)a(chǎn)生更多瘢痕,需要再次手術(shù)，使醫(yī)源性神經(jīng)根損傷和硬膜撕裂的危險(xiǎn)大大增加[5]。因此,預(yù)防或減少椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕形成,一直是骨科領(lǐng)域備受重視的課題,其對(duì)提高椎板切除術(shù)療效具有重要意義[6]。中醫(yī)藥在治療增生性瘢痕方面歷史悠久,隨著中藥有效成分提煉技術(shù)的不斷改進(jìn),其療效不斷增加[7-8]。丹參酮ⅡA是由丹參根部提取的有效脂溶性成分之一。研究發(fā)現(xiàn)參酮ⅡA具有誘導(dǎo)疤痕組織中成纖維細(xì)胞凋亡、抑制其增生的作用,而椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕主要是由于硬膜后方的成纖維細(xì)胞增殖而形成的[9-10]。若丹參酮ⅡA可以有效地誘導(dǎo)SD大鼠椎板切除術(shù)后瘢痕組織中成纖維細(xì)胞的凋亡,將為抑制硬膜外瘢痕組織增生提供一種新的給藥選擇[11-12]。

從本次研究的結(jié)果來看,術(shù)后所有大鼠傷口愈合良好,干預(yù)后1個(gè)月，4組瘢痕面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),由大到小依次為Ⅳ組、Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組,一方面證實(shí)丹參酮ⅡA具有抑制疤痕增生的作用,另一方面這種抑制作用隨丹參酮ⅡA濃度的增加而提高。4組干預(yù)后24 h、72 h及120 h的成纖維細(xì)胞凋亡率和G0/G1期比例比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),其中Ⅲ組成纖維細(xì)胞凋亡率和G0/G1期比例較高,4組成纖維細(xì)胞凋亡率和G0/G1期比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與陳剛等[13]研究結(jié)果一致,提示丹參酮ⅡA抑制疤痕增生是通過誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期完成的。p53為經(jīng)典抑癌基因,Caspase-3是Caspase家族的促凋亡蛋白,Bcl-2和Bax分別為Bcl-2家族的抑凋亡和促凋亡蛋白,而survivin是凋亡抑制蛋白家族中的成員,上述5種細(xì)胞因子均在細(xì)胞增生和凋亡的平衡中發(fā)揮重要作用[14]。本研究顯示,干預(yù)后120 h,4組瘢痕組織中p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明丹參酮ⅡA發(fā)揮抑制成纖維細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)凋亡的作用可能與上調(diào)p53、Caspase-3和Bax蛋白表達(dá),下調(diào)survivin和Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。本次研究的主要不足在于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的局限性,動(dòng)物與人體組織結(jié)構(gòu)尚存在一定差距,丹參酮ⅡA應(yīng)用于人體是否仍然有效有待進(jìn)一步探究。同時(shí),丹參酮ⅡA的最佳給藥劑量、對(duì)其他組織細(xì)胞有無毒性作用仍是需解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。

綜上所述,丹參酮ⅡA具有抑制成纖維細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用,其效果存在濃度依賴性,機(jī)制可能與多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)有關(guān)。