老年患者分離肺炎克雷伯菌常見高毒力血清型及blaKPC耐藥基因的調(diào)查與分析

趙燕，張婷，史繼敏，李剛

1 復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院檢驗科，上海201508；2 復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院臨床研究中心，上海201508

肺炎克雷伯菌是一類革蘭陰性桿菌，動力陰性，能發(fā)酵乳糖，廣泛存在于各種環(huán)境中，是醫(yī)院獲得性感染常見病原菌之一[1]。肺炎克雷伯菌分為高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella Pneumoniae，hvKP）和經(jīng)典肺炎克雷伯菌（classic Klebsiella Pneumonia，cKP）。hvKP 可引起社區(qū)獲得性肝膿腫，且常常繼發(fā)遠(yuǎn)距離播散引起腦膿腫、肺部感染、眼部感染等，死亡率高。hvKP 最重要的毒力因子是莢膜多糖，與hvKP 關(guān)聯(lián)的莢膜多糖血清型有K1、K2、K5、K54、K57 等[2-5]。cKP 常引起醫(yī)院獲得性感染，其對碳青霉烯耐藥率逐年升高，攜帶blaKPC 是肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯最常見的原因[6]。明確攜帶的耐藥基因?qū)εR床治療藥物的選擇有重要的指導(dǎo)作用。近年來hvKP和cKP 有逐步融合進(jìn)化的趨勢，一方面hvKP 通過水平轉(zhuǎn)移的機制獲得耐藥基因，呈現(xiàn)出高耐藥高毒力的特征[7-8]；另一方面cKP 獲得毒性質(zhì)粒呈現(xiàn)出高耐藥高毒力的特征[9]。這些細(xì)菌都呈現(xiàn)出高毒力高耐藥的特征，感染后患者治療選擇有限，預(yù)后差。因而本研究收集上海某三級綜合醫(yī)院2018年10月—2018年12月老年患者非重復(fù)分離的肺炎克雷伯菌58 株，利用多重PCR 法檢測老年患者感染肺炎克雷伯菌的血清型、毒性質(zhì)粒攜帶的rmpA2 基因及blaKPC 耐藥基因，為臨床治療、感染控制提供支持。

1 材料方法

1.1 菌株6 株陽性對照菌株為本實驗室前期已完成基因組測序肺炎克雷伯菌，分別為ST23 克隆K1 血清型、ST1049 克隆K5 血清型、ST29 克隆K54 血清型、ST592 克隆K57 血清型、ST65 克隆K2 血清型攜帶blaKPC 耐藥基因、ST11 克隆K64 血清型攜帶blaKPC耐藥基因及pLVPK 樣毒性質(zhì)粒，臨床菌株為2018年10月—2018年12月老年患者非重復(fù)分離的肺炎克雷伯菌58 株。

1.2 試劑及儀器多重 PCR 試劑盒（Thermo fisher 公司）,DNA 抽提試劑（生工生物工程上海股份有限公司），PCR 擴增試劑、擴增儀（寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京) 有限公司）、電泳儀器及成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）、引物由蘇州金維智生物有限公司合成（見表1）?？咕幬锇ò⒚卓ㄐ?、慶大霉素、氨芐西林、哌拉西林、頭孢呋辛、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢他啶、亞胺培南、甲氧芐啶/磺胺甲嗯唑、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、美羅培南、哌拉西林一他唑巴坦、舒巴坦、替加環(huán)素、多黏菌素B 購自英國OXOID 公司。

1.3 細(xì)菌鑒定及藥物敏感試驗 所有細(xì)菌均采用全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)鑒定，KB 法檢測藥物敏感性試驗，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.4 藥物拉絲試驗 臨床分離肺炎克雷伯菌種接種到哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，置于37°C 培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日用接種環(huán)挑起一個菌落并輕輕向上拉起，如果拉出的粘液絲長度超過5 mm 時，判斷為拉絲試驗陽性，否則為拉絲試驗陰性。

1.5 基因組DNA 提取 將-80℃凍存的肺炎克雷伯菌臨床分離株轉(zhuǎn)種于血平板上，置于孵箱37℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床200 轉(zhuǎn)/min 過夜培養(yǎng)，取1 mL 菌液用磁珠法細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 多重PCR及電泳根據(jù)生物信息學(xué)及文獻(xiàn)分析的基礎(chǔ)上，針對臨床分離率較高的前5 種血清型、rmpA2基因、及blaKPC 耐藥基因設(shè)計引物，建立多重PCR同時檢測老年患者感染肺炎克雷伯菌的血清型、毒性質(zhì)粒攜帶的rmpA2 基因及BlaKPC 耐藥基因。先將引物稀釋至100mol/L 待用，再稀釋至每條引物終濃度稀釋至0.1mol/L，PCR 擴增條件為95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 秒，60℃退火90 秒，72℃延伸40 秒，30 個循環(huán)后再延伸5min。產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，Gelred 熒光染料染色，凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感試驗結(jié)果 以2017 版CLSI 為判斷標(biāo)準(zhǔn)，58 株肺炎克雷伯菌中對頭孢噻肟或頭孢他啶耐藥20株，占比34.5%；亞胺培南和美羅培南耐藥15 株，占比25.9%。未檢出替加環(huán)素及多黏菌素耐藥菌株，所有碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌均攜帶blaKPC 基因。

2.2 拉絲試驗結(jié)果58 株肺炎克雷伯菌中拉絲試驗陽性共25 株，占43.1%，拉絲試驗陰性33 株，占56.9%。

2.3 多重PCR結(jié)果以本實驗室前期已完成基因組測序的ST23 克隆K1 血清型、ST1049 克隆K5 血清型、ST29 克隆K54 血清型、ST592 克隆K57 血清型、ST65克隆K2 血清型攜帶BlaKPC 耐藥基因、ST11 克隆K64 血清型攜帶BlaKPC 耐藥基因及pLVPK 樣毒性質(zhì)粒為參考菌株來優(yōu)化多重PCR 體系。結(jié)果見圖1，所有目標(biāo)基因擴增條帶均清晰可見。58 株臨床菌株中，以攜帶rmpA2 為判斷標(biāo)準(zhǔn)共檢出24 株hvKP（41.4%），其中K1 血清型hvKP7 株（12.1%）、K2 血清型hvKP4 株（6.9%）、K5 血清型hvKP2 株（3.4%）、K54 血清型hvKP2 株（3.4%），單獨攜帶rmpA2 基因血清型未知hvKP2 株（3.4%），同時攜帶rmpA2 及BlaKPC 基因肺炎克雷伯菌7 株（12.1%）。見圖2及表2。

3 討論

本研究中58 株肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南耐藥的耐藥率為25.9%，而同期CHINET 監(jiān)測網(wǎng)亞胺培南耐藥率為26.1%（http: //chinets.com/），與本研究基本一致。肺炎克雷伯菌耐藥物機制主要有產(chǎn)生各種水解酶、外膜蛋白缺失致滲透性降低、外排泵高表達(dá)、靶位點改變等[10]。本研究中15 株碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌均攜帶blaKPC 耐藥基因，說明攜帶blaKPC 耐藥基因是本研究所收集碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌的主要耐藥機制。blaKPC 耐藥基因通常位于質(zhì)粒上，通過質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移在不同細(xì)菌種屬間廣泛播散，尤其是在炎克雷伯菌中blaKPC 檢出率最高，給臨床治療帶來極大困難[11]。

58 株肺炎克雷伯菌中拉絲試驗陽性共26 株，占44.8%，高粘液表型是hvKP 顯著特征，因而拉絲試驗被發(fā)展用來檢測hvKP，然而近年來研究報道部分低毒力ST11 型肺炎克雷伯菌呈現(xiàn)高粘液表型，有學(xué)者提出高粘液和高毒力是兩種不同的表型[12-13]，限制了拉絲試驗在臨床的廣泛使用。在25 株拉絲試驗陽性肺炎克雷伯菌中15 株為常見的高毒力血清型，另外9 株rmpA2 陽性血清型未知的菌株。rmpA2 編碼莢膜多糖調(diào)節(jié)因子，位于pLVPK樣毒性質(zhì)粒上，pLVPK樣毒性質(zhì)粒通常在170kb 至220kb 大小，是hvKP 的標(biāo)志之一，幾乎存在于所有的hvKP 中，目前只有臺灣曾報道肺炎克雷伯菌1084 不含有此類質(zhì)粒[14]。香港Yang 等報道毒性質(zhì)?？赏ㄟ^接合方式自主轉(zhuǎn)移，從而增加經(jīng)典肺炎克雷伯菌莢膜多糖的產(chǎn)量，提高肺炎克雷伯菌在小鼠及大蠟螟模型上的致病性[15]。浙江大學(xué)Gu D 等報道碳青霉烯耐藥的cKP 中發(fā)現(xiàn)了pLVPK 樣毒性質(zhì)粒，呈現(xiàn)出粘液樣表型，5 例年齡53～73 感染的病人全部死亡[9]。本研究中攜帶rmpA2 血清型未知的高毒力肺炎克雷伯菌9 株，其中攜帶blaKPC 耐藥基因的高毒力碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌7株，碳青霉烯耐藥的hvKP 已在住院老年患者中流行。

綜上所述，本研究中老年患者分離的肺炎克雷伯菌中碳?xì)涿瓜┧幬锬退幝视休^高的檢出率，攜帶bla-KPC 耐藥基因是耐藥的主要原因；高毒力肺炎克雷伯菌的比例高達(dá)41.4%。老年患者身體機能退化、免疫功能降低，且易患糖尿病、高血壓、腎功能損傷等各種基礎(chǔ)疾病，因此老年住院患者更易發(fā)生醫(yī)院獲得性感染。老年患者感染后發(fā)病不典型，早期診斷難度大，容易并發(fā)多器官損傷甚至功能衰竭，治療預(yù)后差。因而醫(yī)院應(yīng)加強對老年患者感染高毒力肺炎克雷類伯菌及碳?xì)涿瓜┠退幏窝卓死最惒谋O(jiān)測，減少感染發(fā)生。