宮頸病變患者陰道菌群種類構成分布及意義*

（綿陽市人民醫(yī)院 婦科，四川 綿陽 621000）

宮頸癌是威脅全球女性健康的最大疾病之一，宮頸癌患者的發(fā)病率與病死率居高不下[1]。宮頸上皮內瘤變是在臨床中并未確診為原位癌的宮頸異常增殖性病變，其長期存在可能發(fā)展為宮頸癌[2-3]。宮頸上皮內瘤變暴露在陰道微環(huán)境內，而陰道微環(huán)境中的菌群具有保護陰道微環(huán)境的作用。目前對陰道菌群在宮頸上皮內瘤變發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用仍有爭論。本研究重點探討宮頸上皮內瘤變患者陰道菌群分布情況，對指導臨床宮頸病變篩查與治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年1月—2019年1月在綿陽市人民醫(yī)院婦科就診的180 例宮頸病變患者，分為宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）I級88 例（CIN I組）和CIN Ⅱ/Ⅲ級92 例（CIN Ⅱ/Ⅲ組）。納入標準：①經宮頸液基細胞學與宮頸活檢病理確診為CIN I級和/或Ⅱ/Ⅲ級；②年齡22 ～60 歲；③性生活≥3年，但近3 d 內無性生活史；④自愿參與本研究，并簽署知情同意書。排除標準：①合并免疫缺陷、全身系統(tǒng)性疾病；②糖尿病、激素治療性疾?。虎墼陆洸灰?guī)律；④近1 周內見異常陰道分泌物及陰道流血；⑤婦科檢查患有細菌性陰道病、毛滴蟲陰道炎及外陰陰道假絲酵母菌病。選取同期本院體檢的健康女性75 例作為對照組。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑及儀器

DNA 試劑盒（德國Qiagen 公司），細菌培養(yǎng)基（廣州市珠海迪爾生物工程有限公司）。ABI-2720 PCR儀（美國ABI 公司），Illumina Miseq 測序平臺（美國MiSeq 公司）。

1.3 方法

1.3.1 標本采集采用無菌棉拭子深入陰道后選取后穹隆位置緩慢轉動10 ～15 s 后，待棉拭子充分吸收分泌物后取出，置入干燥無菌試管中。標本采集后存放于-80℃冰箱，用于細菌基因組DNA 的提取。

1.3.2 細菌基因總DNA 提取參考文獻[4]采用DNA 試劑盒提取樣本中總DNA，按照說明書進行操作，成功提取DNA 后存放于-20℃冰箱中。

1.3.3 16S rRNA V3、V4 區(qū)的PCR 擴增與IlluminaMiseq測序參考文獻[5]引物對照，采用PCR 擴增法（北京線上生物科技有限公司）將基因組DNA 稀釋并進行提取后，進一步使16S rRNA 的V3、V4 區(qū)基因片段系數放大，同時采用雙末端展開序列測試。具體采用的引物片段參考文獻[6]。正向引物：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，長 度338 bp；反向引物：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'，長度806 bp。經PCR 反應后，取得緩沖液5×FastPfu 4μl，構成成分包含dNTPs 2.0μ1，FastPfu 聚合酶0.4μl，正反向引物各0.8μl，模板0.5μl，無菌去離子水11.5μl。反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共計27 個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min，儲存于4℃環(huán)境中，將PCR 產物等量混合后檢測樣本標簽序列，由上海派森諾醫(yī)學檢驗所完成。革蘭染色檢測乳酸桿菌屬、加德納菌屬、奇異菌屬及其他菌屬。采用培養(yǎng)法進行厚壁菌門、放線菌門及其他21 個菌門鑒定。

1.4 觀察指標

觀察各組Alpha 多樣性指數評估（菌種豐度指數Chao、ACE）、菌種多樣性指數（Simpson 指數與Shannon 指數）、微生物群菌落門及微菌群分布情況。

1.5 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q法；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，進一步兩兩比較用χ2分割法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組Alpha 多樣性變化

對照組、CIN I組和CIN Ⅱ/Ⅲ組Simpson 指數、Shannon 指數比較，經方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而Chao、ACE 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），CIN I組較對照組、CIN Ⅱ/Ⅲ組高（P＜0.05），且CIN Ⅱ/Ⅲ組高于對照組（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組菌門結構

本研究總共測出23 個菌門，對照組、CIN I組和CIN Ⅱ/Ⅲ組厚壁菌門、放線菌門及其他21 個菌門構成比比較，經χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=40 176.180，P=0.000）。對照組與CIN I組厚壁菌門、放線菌門及其他21 個菌門構成比比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=15 894.568，P=0.000）；對照組與CIN Ⅱ/Ⅲ組厚壁菌門、放線菌門及其他21 個菌門構成比比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=28 239.622，P=0.000）；CIN I組與CIN Ⅱ/Ⅲ組厚壁菌門、放線菌門及其他21 個菌門構成比比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=25 889.547，P=0.000）。見表2。

2.3 各組菌群類型

對照組、CIN I組和CIN Ⅱ/Ⅲ組陰道乳酸桿菌屬、加德納菌屬、奇異菌屬及其他菌屬構成比比較，經χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=79 286.753，P=0.000）。對照組與CIN I組陰道乳酸桿菌屬、加德納菌屬、奇異菌屬及其他菌屬構成比比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=188 665.755，P=0.000）；對照組與CIN Ⅱ/Ⅲ組陰道乳酸桿菌屬、加德納菌屬、奇異菌屬及其他菌屬構成比比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=14 952.312，P=0.000）；CIN I組與CIN Ⅱ/Ⅲ組陰道乳酸桿菌屬、加德納菌屬、奇異菌屬及其他菌屬構成比比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=28 097.984，P=0.000）。見表3。

表1 各組Alpha 多樣性變化比較 （±s）

表1 各組Alpha 多樣性變化比較 （±s）

注：?與對照組比較，P＜0.05。

組別 n Chao ACE Simpson 指數 Shannon 指數對照組 75 47.54±23.14 53.02±24.17 0.69±0.18 0.70±0.58 CIN I組 88 65.02±24.51? 84.14±27.01? 0.55±0.22 1.02±0.71 CIN Ⅱ/Ⅲ組 92 60.02±29.27? 71.02±28.02? 0.78±0.21 0.69±0.68 F 值 10.290 27.790 1.630 0.101 P 值 0.001 0.001 0.105 0.920

表2 各組菌門結構比較

表3 各組菌群類型比較

3 討論

宮頸癌是現階段病因明確的惡性婦科腫瘤，與高危型人乳頭瘤病毒持續(xù)感染有一定關系，但其進展為宮頸癌的潛伏期長，所以在潛伏期臨床及早發(fā)現可以逆轉。目前，臨床對宮頸病變進展的因素尚未統(tǒng)一，但有研究發(fā)現，陰道菌群結構改變與宮頸病變相關[7]。

國內外相關報道發(fā)現，女性陰道微環(huán)境菌群構成具有一定的規(guī)律性，但其不穩(wěn)定的變化發(fā)展與宮頸病變表現出相關性[8-9]。臨床研究發(fā)現，健康女性的陰道菌群絕大多數為厚壁菌門，乳酸桿菌屬同樣占比較高，而加德納菌、奇異菌屬等豐度不高[10]。陰道微環(huán)境處于平衡狀態(tài)時為菌群提供寄居，常見為革蘭陽性需氧菌、兼性厭氧菌及革蘭陰性需氧菌等，該類菌群主要聚集于陰道側壁黏膜皺褶與穹隆中，極少部分在宮頸位置聚集。既往研究在女性陰道分泌物中分離出50 多種不同的菌群，而健康女性陰道中以乳酸桿菌為主[11]。女性陰道微環(huán)境菌群構成處于平衡狀態(tài)時，具有預防病原體侵襲的功能，而確保陰道菌群環(huán)境平衡的pH值是由乳酸桿菌、雌激素來調節(jié)[12]。乳酸桿菌可調控陰道微環(huán)境的平衡，同時還可以分泌大量乳酸桿菌預防致病菌群侵襲，提高陰道局部抵御感染、腫瘤等疾病。研究還發(fā)現，乳酸桿菌可活化為細胞外糖類包裹病原菌侵襲宮頸上皮細胞形成生物膜，避免病原菌進一步發(fā)展[13]。本研究結果發(fā)現，CIN I組乳酸桿菌菌屬（53.50%）低于對照組（62.76%）和CIN Ⅱ/Ⅲ組（72.01%），從而反映陰道微生物菌群環(huán)境均衡性發(fā)生變化，可能會造成CIN 進展，而CIN Ⅱ/Ⅲ組乳酸桿菌高于對照組（72.01% VS 62.76%）。本研究中，CIN I組乳酸桿菌屬含量下降，通常陰道菌群中的乳酸桿菌具有維持陰道微環(huán)境平衡、抑制病原菌生長，提高陰道局部抵御感染的作用。乳酸桿菌可形成空間性占位從而保護宮頸上皮細胞，避免病原菌黏附，減少病原菌黏附與感染。CIN I組乳酸桿菌屬含量降低提示陰道菌群平衡紊亂導致陰道微環(huán)境發(fā)生變化，宮頸上皮感染高危型人乳頭瘤病毒的易感性風險較高[14]。本研究結果與既往研究結果趨于一致，CIN I組加德納菌屬（19.16%）高于對照組（14.11%）和CIN Ⅱ/Ⅲ組（12.16%）；同時CIN I組奇異菌屬豐度同樣高于對照組和CIN Ⅱ/Ⅲ組。加德納菌屬可作用于CD59 調節(jié)分子活化炎癥信號通路，大量釋放細胞溶解素，造成陰道上皮細胞凋亡從而減少乳酸桿菌定植，陰道微環(huán)境失衡的風險升高。本研究說明宮頸病變與奇異菌豐度關系密切。COOREVITS 等[15]研究基于3D 培養(yǎng)條件，分析陰道上皮細胞模型同樣證實了奇異菌可增強炎癥反應，改變陰道微環(huán)境；同時還發(fā)現奇異菌的豐度升高可能預示著其影響宮頸上皮內細胞。

綜上所述，從女性陰道菌群的構成發(fā)現不同宮頸上皮內瘤變患者陰道菌群豐度變化與宮頸病變具有一定的關聯。