β咔啉類生物堿通過FAK/PI3K/AKT/mTOR通路對人胃癌SGC-7901荷瘤小鼠的影響

樊玉祥， 曾凡業(yè)， 張洪亮

(新疆醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院腫瘤二科， 新疆 烏魯木齊 830000)

胃癌是最常見的消化道腫瘤之一，也是我國第二高發(fā)腫瘤，中國胃癌發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)分別占全球胃癌發(fā)病和死亡的42.6%和45.0%，在全球183個國家中位于發(fā)病率第5位、死亡率第6位，并且胃癌死亡率將持續(xù)上升[1]。傳統(tǒng)胃癌治療手段包括手術、化療和放療，而放、化療過程中會出現(xiàn)不同程度的毒副作用。因此，尋找低毒高效的抗腫瘤藥物是目前熱點的研究方向。β咔啉類生物堿對人胃癌細胞SGC-7901有誘導凋亡的作用，部分體內(nèi)實驗表明β咔啉類生物堿可使人胃癌細胞SGC-7901荷瘤小鼠腫瘤組織瘤重減輕[2,3]，但其機制尚不明確。為了驗證從駱駝蓬提取的β咔啉類生物堿對胃癌的治療作用，采取SGC-7901胃癌細胞建立皮下移植瘤小鼠模型，研究β咔啉類生物堿對荷瘤小鼠的抑瘤作用，并從分子生物學角度探索β咔啉類生物堿抗胃癌的作用機制，為臨床進一步運用β咔啉類生物堿治療胃癌提供研究方向。

1 資料與方法

1.1一般資料:昆明小鼠50只，SPF級飼養(yǎng)，雌雄對半，體重18.0±3.1g，購自新疆醫(yī)科大學動物實驗中心，動物許可證號SCXK(新)2016-0003。SGC-7901細胞購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；β咔啉類生物堿由北京中醫(yī)藥大學劉永剛教授鑒定；人胃癌SGC-7901細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；氟尿嘧啶購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；RPMI 1640細胞培養(yǎng)液及胎牛血清購自Hyclone公司；蘇木精-伊紅染色液購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；BCA定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT、mTOR抗體購買自Cell Signaling公司。

1.2方 法

1.2.1細胞培養(yǎng):按常規(guī)腫瘤細胞培養(yǎng)方法按時還液、傳代。將處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞調(diào)整至備用狀態(tài)。

1.2.2動物模型制備:荷瘤小鼠在SPF環(huán)境飼養(yǎng)一周。按數(shù)字表法隨機分為5組，空白對照組，陽性藥物組(氟尿嘧啶組)，β-咔啉類生物堿低、中、高劑量組，每組10只。各組腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)7d，然后取對數(shù)生長期的細胞使用RPMI 1640細胞培養(yǎng)液調(diào)整至細胞密度為1×107/mL，將0.2mL細胞混懸液接種于小鼠背部。陽性藥物組腹腔注射氟尿嘧啶267mg/kg，連續(xù)2d，空白對照組腹腔注射生理鹽水1mL，連續(xù)14d。β-咔啉類生物堿低、中、高劑量組分別使用2.5mg、5mg、7.5mg/kg口服給藥，連續(xù)14d。接種10d后，使用超聲探查接種處，皮下有不均勻回聲考慮接種成功。給藥過程中對小鼠稱重，并觀察精神狀態(tài)、活動、飲食等一般情況。第21天處死所有小鼠，并按要求留取標本。

1.2.3腫瘤質(zhì)量的測定及抑瘤率計算:實驗第21天使用頸椎脫臼法處死所有小鼠。剝離瘤體，使用電子天平稱取瘤組織重量。使用以下公式計算抑瘤率：抑瘤率=(模型組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量

1.2.4HE染色觀察瘤體組織:將標本用10%多聚甲醛固定包埋脫水處理，做成石蠟切片。依次加入不同濃度二甲苯、乙醇中處理，先使用蘇木素處理，再使用伊紅處理，其后使用無水乙醇、二甲苯中處理，最后使用樹脂封片，上鏡觀察。

1.2.5TUNEL檢測細胞凋亡:將標本使用10%多聚甲醛固定包埋脫水處理，切成5mm切片。加0.01M TBS 1∶200新鮮稀釋Proteinase K 37℃消化，使用TdT和DIG-d-UTP后使用TBS洗片，加封閉液，用抗體稀釋液1：100稀釋生物素化抗地高辛抗體，稀釋SABC后使用DAB顯色，其后使用蘇木素輕度復染后封片。上鏡觀察，細胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細胞。

1.2.6免疫組化染色技術檢測瘤體組織BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR的表達:將標本使用10%多聚甲醛固定包埋脫水處理，處理成5mm切片。使用相應抗體孵育并洗滌、DAB顯色后上鏡觀察。每個切片隨機選取10個視野，細胞漿顯示棕黃色的細胞為陽性細胞。

1.2.7RT-PCR檢測腫瘤組織中BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR的mRNA的表達:收集經(jīng)β-咔啉類生物堿處理24h的SGC-7901腫瘤瘤體組織，按RT-PCR試劑盒要求進行逆轉錄，合成cDNA，然后再進行擴增。BCL-2的擴增條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30個循環(huán)；Bax的擴增條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，28個循環(huán)；FAK的擴增條件：95℃預變性2min，94℃變性40s，46℃退火40s，72℃延伸1min，28個循環(huán)；PI3K的擴增條件：95℃預變性5min，94℃變性1min，55℃退火50s，72℃延伸40s，30個循環(huán)；AKT的擴增條件：95℃預變性3min，94℃變性40s，59℃退火30s，72℃延伸1min，28個循環(huán)；mTOR的擴增條件：94℃預變性5min，94℃變性1min，46℃退火40s，72℃延伸2min，30個循環(huán)；β-actin的擴增：94℃預變性4min，94℃變性1min，58℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物4μL于質(zhì)量濃度為1.5%的瓊脂凝膠進行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)進行分析，以β-actin為內(nèi)參基因，使用2-△△CT法計算基因表達的相對變化值，實驗中所用引物序列，見表1。

表1 檢測引物序列

1.2.8Western blot技術檢測腫瘤組織中BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR蛋白的表達:β咔啉類生物堿處理24h的SGC-7901腫瘤組織，經(jīng)液氮研磨之后，收集上清液后測定蛋白含量，電泳，轉膜，分別加入BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR一抗(BCL-2、Bax為1：600，F(xiàn)AK為1：400，PI3K、AKT、mTOR為1：800)，室溫孵育，二抗孵育，封閉，TBST反復漂洗，顯色后用ChemiScope mini化學發(fā)光儀檢測并拍照用，β-actin為內(nèi)參蛋白，進行相對定量表達檢測。

2 結 果

2.1小鼠一般情況:本實驗成功復制免疫缺陷動物模型。除β咔啉類生物堿高劑量組有一只死亡外，其余組均無死亡。各組實驗動物在實驗過程中無明顯拒食、腹瀉等現(xiàn)象。

表2 各組瘤體重量與成瘤率的比較

2.2瘤重及抑瘤率:β咔啉類生物堿高劑量組的瘤重明顯低于空白對照組(t=4.539，P=0.000)，高劑量組的瘤重明顯低于低劑量組(t=2.163，P=0.025)，高劑量組與中劑量組的瘤重無顯著差異(t=0.356，P=0.756)；高劑量組與陽性對照組的瘤重也無顯著差異(t=0.418，P=0.613)；β咔啉類生物堿中劑量組的瘤重明顯低于空白對照組(t=3.398，P=0.003)，中劑量組的瘤重又顯著低于低劑量組(t=2.057，P=0.037)；β咔啉類生物堿低劑量組與空白對照組的瘤重無顯著差異(t=0.243，P=0.836)；陽性對照組的瘤重明顯低于空白對照組(t=4.472，P=0.002)，陽性對照組的瘤重明顯低于低劑量組(t=2.163，P=0.021)；以上結果說明與空白對照組相比，β咔啉類生物堿中劑量組、高劑量組和陽性對照組的瘤重均減小(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義，見表2。

2.3β咔啉類生物堿對胃癌組織病理變化的影響：空白對照組瘤細胞體積大小不一，密度大、深染，異型性明顯，浸潤性生長，周邊部瘤細胞生長活躍；陽性對照組瘤細胞彌漫排列，異型性明顯，淋巴細胞浸潤較明顯，部分瘤細胞退變、壞死，染色較深；低劑量組瘤細胞排列整齊，僅有少量的癌細胞壞死，染色較淺；中劑量組瘤細胞排列呈巢團狀，淋巴細胞浸潤較輕，瘤細胞部分異型性明顯，部分壞死；高劑量組瘤細胞排列呈巢團狀，淋巴細胞聚集浸潤，瘤細胞異型性明顯，大量退變、壞死。這些結果表明β咔啉類生物堿具有很強的抑瘤作用，見圖1。

圖1 β咔啉類生物堿對胃癌組織病理學變化的影響

2.4β咔啉類生物堿對胃癌細胞凋亡的影響:棕黃色為凋亡細胞，藍色為陰性細胞。從圖中可以看出，空白對照組腫瘤細胞凋亡最少；陽性組和低劑量組有部分凋亡細胞；中劑量和高劑量處理后，腫瘤凋亡細胞的數(shù)量明顯增多，凋亡細胞數(shù)量高于空白對照組和陽性組。結果表明β咔啉類生物堿中劑量和高劑量可以通過誘導腫瘤細胞凋亡而發(fā)揮抑瘤作用，見圖2。

圖2 β咔啉類生物堿對胃癌細胞凋亡的影響

2.5β咔啉類生物堿對凋亡相關蛋白表達的影響:陽性細胞為棕色顆粒。與空白組相比，β咔啉類生物堿低劑量組中BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR無顯著差異；與空白組相比，陽性組、中劑量組和高劑量組的BCL-2、FAK、PI3K、AKT及mTOR表達顯著下降，Bax蛋白顯著上升，陽性細胞明顯增多；與低劑量組相比，陽性對照組、中劑量組和高劑量的BCL-2、FAK、PI3K、AKT及mTOR表達進一步下降，Bax蛋白進一步上升，見圖3。

圖3 β咔啉類生物堿對凋亡相關蛋白表達的影響

2.6Western blot分析:如表3和圖4所示，與空白對照組相比，β咔啉類生物堿低劑量組中BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR表達水平無顯著差異；與空白對照組相比，陽性組、中劑量組和高劑量組中Bax蛋白表達顯著提高，差異具有統(tǒng)計學意義(t=14.219、12.579、15.173，均P<0.01)，BCL-2(t=10.613、9.345、11.527)、FAK(t=11.287、10.982、13.664)、PI3K(t=18.241、16.793、19.217)、AKT(t=13.358、10.284、13.962)及mTOR(t=8.218、6.612、9.054)蛋白表達顯著下降(均P<0.01)；與低劑量組相比，陽性組、中劑量組和高劑量組的Bax蛋白表達進一步上升(t=4.213、3.216、2.614，均P<0.05)，BCL-2(t=5.129、3.256、4.218)、FAK(t=3.276、4.123、5.016)、PI3K(t=3.205、6.651、3.254)、AKT(t=4.164、3.217、5.027)及mTOR(t=4.327、3.275、4.761)蛋白表達進一步下降(均P<0.05)。這些結果都與免疫組化分析結果一致，見表3、圖4。

圖4 β咔啉類生物堿對胃瘤組織中相關蛋白表達的影響

表3 β咔啉類生物堿對胃瘤組織中相關蛋白表達的影響

2.7β咔啉類生物堿對腫瘤組織相關基因表達的影響:與空白組相比，β咔啉類生物堿低劑量組中BCL-2、Bax、FAK、PI3K、AKT及mTOR的的mRNA表達水平無顯著差異；與空白對照組相比，陽性組、中劑量組和高劑量組中Bax蛋白的mRNA表達顯著上升(t=15.163、13.218、17.895，均P<0.01)，BCL-2(t=20.916、11.785、22.164)、FAK(12.183、10.126、15.871)PI3K(t=16.927、13.252、14.913)、AKT(t=12.123、10.942、14.428)、及mTOR(t=16.927、13.252、14.913)蛋白的mRNA表達顯著下降(均P<0.01)，差異均具有統(tǒng)計學意義；與低劑量組相比，陽性組、中劑量組和高劑量組的Bax蛋白的mRNA表達進一步升高(t=3.125、3.421、4.013，均P<0.05)，BCL-2(t=6.342、5.345、4.165)、FAK(t=4.328、5.329、6.021)、PI3K(t=4.327、5.321、3.828)、AKT(t=4.326、6.327、3.421)及mTOR(t=4.327、5.424、5.189)蛋白的mRNA表達進一步降低(均P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計學意義。該趨勢與上述蛋白結果一致，見表4。

表4 β咔啉類生物堿對胃瘤組織中相關基因表達的影響

3 討 論

駱駝蓬喜生于路旁、平原、戈壁等干旱處，具有助陽化氣、祛濕散寒之功效。研究結果表明，其有效成分去氫駱駝蓬堿對腫瘤細胞有明顯抑制作用[4]。通過前期的細胞實驗得知，β咔啉類生物堿有一定抗腫瘤作用，主要表現(xiàn)在誘導凋亡、影響細胞增殖等方面[5]。而腫瘤的發(fā)生發(fā)展與“血管再生理論”密切相關[6]。β咔啉類生物堿對血管再生相關FAK/PI3K/AKT/mTOR信號通路有何影響報道較少。本研究從細胞、動物實驗層面，運用分子生物學手段，研究β咔啉類生物堿對FAK/PI3K/AKT/mTOM通路的影響，闡明β咔啉類生物堿抗胃癌的作用機制。

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)β咔啉類生物堿中劑量和高劑量治療后，小鼠瘤體重量顯著降低，提示β咔啉類生物堿可以通過抑制瘤體的生長，從而發(fā)揮抗胃癌作用，其效果明顯優(yōu)于β咔啉類生物堿低劑量組。HE和TUNEL染色是評價胃癌病變組織和凋亡的重要指標，結果表明，β咔啉類生物堿中劑量組和高劑量組能破壞胃癌細胞組織，誘導胃癌細胞的凋亡，其效果隨著β咔啉類生物堿劑量的增大而增強，進一步說明β咔啉類生物堿抗胃癌機制可能與破壞胃癌細胞組織，誘導胃癌細胞的凋亡有關。

細胞凋亡在腫瘤發(fā)生、轉移及粘附過程中發(fā)揮著重要的作用。其中促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2，是凋亡的關鍵調(diào)節(jié)因子，在腫瘤細胞中，Bcl-2過表達與Bax形成異二聚體，發(fā)揮抑制凋亡作用。本研究中采用免疫組化、Western blot和RT-PCR研究結果表明，β咔啉類生物堿中劑量和高劑量組干預后瘤體內(nèi)中Bax蛋白有較高的表達，而Bcl-2表達顯著降低，效果優(yōu)于β咔啉類生物堿低劑量組。結果表明，β咔啉類生物堿通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達，促進Bax蛋白形成同源二聚體，從而誘導胃癌細胞發(fā)生凋亡。這可能是β咔啉類生物堿抗胃癌的作用機制之一。

粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是一種細胞質(zhì)酪氨酸激酶，高水平的FAK誘導腫瘤細胞轉移，并且與胃癌的不良反應相關[7]。研究結果表明，F(xiàn)AK的高表達可以抑制胃癌細胞的粘附和遷移能力。磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B( phosphoinositide 3 kinase / protein kinase B，PI3K/AKT)信號通路主要參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖和凋亡等細胞轉導過程[8]。PI3K是一種磷脂酰肌醇蛋白激酶，與AKT蛋白的Ser308位點發(fā)生磷酸化，從而導致AKT蛋白的激活。活化后的AKT磷酸化激活下游蛋白mTOR[9]。mTOR主要參與調(diào)控腫瘤細胞周期、增殖和凋亡的過程，在腫瘤細胞生長和死亡之間發(fā)揮著重要的作用[10]。本研究結果表明，β咔啉類生物堿中劑量組和高劑量組處理后，腫瘤細胞內(nèi)FAK和BCL-2蛋白表達顯著地下降，而Bax蛋白表達升高，其效果優(yōu)于β咔啉類生物堿低劑量組。表明FAK主要參與誘導細胞凋亡過程。同時PI3K和AKT作為FAK的下游蛋白，PI3K和AKT蛋白的表達也顯著下降。結果表明，β咔啉類生物堿通過激活FAK/PI3K/AKT/mTOR信號通路來抑制胃癌細胞生長。

綜上所述，β咔啉類生物堿能顯著抑制移植瘤體生長，誘導胃癌細胞的凋亡，其作用機制可通過提高Bax蛋白表達，降低FAK、PI3K、AKT、mTOR、BCL-2、和Bax蛋白表達有關。此次實驗與血管新生的相關MAPK/ERK通路及VEGF相關蛋白尚未研究，本課題組將在今后的實驗中做進一步深入研究，探討β咔啉類生物堿抗腫瘤血管再生的分子機制。