Treg/Th17細(xì)胞失衡及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平與再生障礙性貧血的關(guān)系分析

王 蕊, 董彩麗, 趙云婷*, 王 艷

(1.河北省第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科, 河北 保 定 0730002.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液內(nèi)科, 河北 石家莊 050000)

再生障礙性貧血(Aplastic anemia，AA)是臨床上常見的血液系統(tǒng)疾病，主要以骨髓增生及全血細(xì)胞減少為特征，表現(xiàn)為出血、貧血及感染傾向[1]。AA發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與免疫系統(tǒng)異常有關(guān)，尤其是CD4+T細(xì)胞功能紊亂在AA發(fā)病中起到重要促進(jìn)作用[2]。Treg細(xì)胞是一種重要的CD4+T細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制作用，可維持機(jī)體自身免疫耐受[3]。Th17細(xì)胞也屬于CD4+T細(xì)胞，具有促炎、誘導(dǎo)自身免疫性疾病等作用，與Treg細(xì)胞相互制約，保持動態(tài)平衡，以維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，AA患者外周血Treg/Th17處于失衡狀態(tài)，認(rèn)為Treg/Th17失衡是AA發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)[4]，但關(guān)于Treg/Th17細(xì)胞失衡及其相關(guān)細(xì)胞因子與AA疾病程度、預(yù)后的關(guān)系研究尚少。鑒于此，本研究選取近2年收治的AA患者為研究對象，觀察其外周血Treg、Th17、Treg/Th17及相關(guān)細(xì)胞因子水平變化，旨在探討外周血Treg、Th17、Treg/Th17水平及相關(guān)細(xì)胞因子與AA疾病程度及預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2016年12月至2018年6月期間合作醫(yī)院收治的AA患者為研究對象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①均為初診再生障礙貧血，結(jié)合臨床表現(xiàn)、血象及骨髓象進(jìn)行診斷，符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[5]中AA診斷要求；②入組前1個(gè)月內(nèi)未接受相關(guān)治療；③患者對本研究充分知情，并自愿簽署病人知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并急性感染或其他自身免疫系統(tǒng)疾病者；②合并惡性腫瘤者；③非初診者；④懷孕或哺乳期女性。納入研究者共94例，根據(jù)Camitta分型標(biāo)準(zhǔn)[6]確定AA嚴(yán)重程度，并將患者分為輕型AA(mild AA，MAA)組和重型AA(severe AA，SAA)組，其中SAA骨髓有核細(xì)胞百分率<0.25，若≥0.25但<0.50，則殘存的造血細(xì)胞應(yīng)<30%；且具備下列3項(xiàng)中至少2項(xiàng)：中性粒細(xì)胞<0.5×109L-1；校正的網(wǎng)織紅細(xì)胞<1%或網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對值<20×109L-1；血小板<20×109L-1。MAA組41例，其中男性24例，女性17例，年齡15～81歲，平均(48.38±10.49)歲，SAA組53例，其中男性28例，女性25例，年齡14～79歲，平均(49.11±10.98)歲。另選取同期體檢健康者50例為對照組，其中男性29例，女性21例，年齡22～69歲，平均(47.71±10.01)歲。各組性別、年齡相似(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2主要試劑:Cy5標(biāo)記的抗人CD3和CD4單克隆抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗CD8和CD25單克隆抗體，PE標(biāo)記的抗人白介素(Interleukin，IL)-17和CD127單克隆抗體均購自美國BD公司；IL-10、IL-6和IL-17酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自美國R&D公司。

1.3外周血Treg、Th17水平檢測:采集受試者外周靜脈血10～12 mL于抗凝管中，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，制備濃度為1×106PBMC細(xì)胞懸液，取1 mL加入24孔板，再加入20 ng/mL佛波酯、1ug/mL離子霉素、2nmol/mL莫能菌素，于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中放置4h。Treg、Th17采用流式細(xì)胞術(shù)檢測，具體操作步驟見文獻(xiàn)[7]。

1.4血清相關(guān)細(xì)胞因子檢測:采集所有受試者外周血4～5mL，不進(jìn)行抗凝處理，室外靜置20min后，3000rpm離心10min，小心收集上清，于-80℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清IL-10、IL-6和IL-17表達(dá)水平。

1.5隨訪:對AA患者進(jìn)行8～12個(gè)月的隨訪，隨訪方式為電話或門診，記錄患者預(yù)后不良(急性復(fù)發(fā)或死亡)情況。復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)：①骨髓細(xì)胞增生程度低于正常的1/4；②血小板絕對數(shù)<20×109L-1，網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對數(shù)<20×109L-1，中性粒細(xì)胞絕對值<0.5×109L-1，血象至少具備以上2項(xiàng)。

2 結(jié) 果

2.1各組外周血Treg、Th17及Treg/Th17水平比較:各組外周血Treg、Th17及Treg/Th17水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SAA組Treg細(xì)胞水平、Treg/Th17低于對照組和MAA組，Th17水平高于對照組和MAA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組外周血Treg Th17及Treg/Th17水平比較

2.2各組血清細(xì)胞因子細(xì)胞因子水平比較:各組血清IL-10、IL-6和IL-17水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SAA組IL-10水平低于對照組和MAA組，IL-6和IL-17水平高于對照組和MAA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組血清細(xì)胞因子細(xì)胞因子水平比較

表3 Treg/Th17細(xì)胞失衡及相關(guān)細(xì)胞因子與AA病情嚴(yán)重程度關(guān)系

2.3Treg/Th17細(xì)胞失衡及相關(guān)細(xì)胞因子與AA病情嚴(yán)重程度關(guān)系:Treg、Treg/Th17及IL-10水平與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，Th17、IL-6和IL-17與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(P<0.05)，見表3。

2.4Treg/Th17細(xì)胞失衡及相關(guān)細(xì)胞因子與AA預(yù)后的關(guān)系:94例再生障礙貧血患者隨訪期間24例死亡，急性復(fù)發(fā)17例，以病情程度(MAA=0、SAA=1)、Treg、Th17、Treg/Th17、IL-10、IL-6及IL-17(連續(xù)變量不賦值，按實(shí)際值分析)為自變量，以預(yù)后情況為因變量(未出現(xiàn)急性復(fù)發(fā)或死亡=0，急性復(fù)發(fā)或死亡=1)，采用多元Logitic回歸模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，除病情程度以外，Treg和Treg/Th17是不良預(yù)后(急性復(fù)發(fā)或死亡)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表4。

表4 Treg/Th17細(xì)胞失衡及相關(guān)細(xì)胞因子與AA預(yù)后的關(guān)系

3 討 論

AA是一種由多種原因(物理、化學(xué)、生物)引起的血液系統(tǒng)疾病，包括遺傳性AA和獲得性AA，發(fā)病機(jī)制可能與免疫功能紊亂、造血干細(xì)胞缺陷、造血微環(huán)境異常等有關(guān)。近期越來越多研究認(rèn)為，AA在某種程度上可看做一種自身免疫性疾病，靶抗原為造血系統(tǒng)，且采用免疫抑制治療取得一定療效，也說明AA發(fā)病與免疫功能紊亂密切相關(guān)[8]。但免疫功能紊亂是如何導(dǎo)致AA發(fā)病以及如何影響疾病進(jìn)展尚未完全明確。

CD4+T細(xì)胞是機(jī)體免疫功能調(diào)控中心，CD4+T細(xì)胞水平升高，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例向CD4+T細(xì)胞免疫偏移，造血微環(huán)境中相關(guān)細(xì)胞因子分泌異常，最終引起造血功能衰竭[9]。Treg細(xì)胞可抑制CD4+T細(xì)胞增殖，是調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞平衡的關(guān)鍵因素，從而維持自身免疫耐受，并發(fā)揮抗炎作用[10]。有研究以SAA模型小鼠為研究對象，采用雷帕霉素干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可通過抑制Treg細(xì)胞凋亡，恢復(fù)小鼠骨髓造血功能，提示上調(diào)Treg細(xì)胞有助于改善骨髓造血功能[11]。本研究中，SAA組Treg細(xì)胞水平明顯低于對照組和MAA組，且Treg細(xì)胞水平與AA嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，即Treg細(xì)胞水平越低，AA病情越嚴(yán)重。由此可見，AA患者外周血Treg細(xì)胞水平明顯下調(diào)，且通過監(jiān)測Treg細(xì)胞水平可判斷病情嚴(yán)重程度。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AA患者IL-10水平明顯降低，提示患者Treg細(xì)胞免疫功能受到抑制，分析原因可能在于IL-10是Treg細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，IL-10具有抗炎作用，并可抑制γ-干擾素、TNF-α生成，進(jìn)而調(diào)控自身免疫性疾病，但具體機(jī)制仍需深入探究。

Th17細(xì)胞是一種新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，其主要通過分泌IL-6、IL-17等細(xì)胞因子使更多炎癥細(xì)胞聚集于靶區(qū)，對造血干細(xì)胞造成損傷，誘導(dǎo)其凋亡，或通過分泌細(xì)胞毒性物質(zhì)直接損傷造血干細(xì)胞[12]。因此我們認(rèn)為Th17、IL-6、IL-17可能與AA患者免疫功能紊亂有關(guān)，分析發(fā)現(xiàn)，SAA組Th17、IL-6、IL-17水平均明顯高于對照組和MAA組，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，證實(shí)SAA患者Th17及其相關(guān)細(xì)胞因子水平明顯上調(diào)，推測與Th17細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，使機(jī)體出現(xiàn)免疫亢進(jìn)有關(guān)。相關(guān)薈萃研究顯示，當(dāng)Th17分泌大量IL-6后，IL-6可進(jìn)一步促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞分化為Th17，同時(shí)通過抑制Foxp3表達(dá)影響Treg細(xì)胞功能，所以Treg/Th17細(xì)胞失衡可能是由細(xì)胞因子水平失調(diào)造成[13]。郝慧琴[14]等研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者Th17水平明顯高于健康者，Treg細(xì)胞水平明顯低于健康者，認(rèn)為T17/Treg比值是系統(tǒng)性紅斑狼瘡病情評估的重要參考指標(biāo)。由此認(rèn)為，Treg/Th17失衡可引起自身免疫疾病發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，SAA組Treg/Th17低于對照組和MAA組，且與國外學(xué)者Li[15]等研究結(jié)果相似，均表明Treg/Th17失衡與AA尤其是SAA有緊密關(guān)聯(lián)?；谝陨戏治?，本研究通過進(jìn)一步Logitic回歸模型分析Treg/Th17與AA預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)除病情程度以外，Treg和Treg/Th17是急性復(fù)發(fā)或死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，主要原因在于Treg/Th17失衡程度與病情程度相關(guān)，因此認(rèn)為監(jiān)測Treg/Th17水平對于預(yù)測疾病嚴(yán)重程度和疾病預(yù)后具有重要參考價(jià)值。但本研究樣本量有限，影響AA的預(yù)后因素可能還與臨床治療及患者的個(gè)體差異有關(guān)，相關(guān)論點(diǎn)仍有待進(jìn)一步論證。

綜上所述，Treg/Th17細(xì)胞失衡在AA疾病發(fā)生機(jī)制中起到重要作用，在AA患者機(jī)體中，Treg細(xì)胞免疫應(yīng)答減弱，Th17細(xì)胞免疫應(yīng)答增強(qiáng)，Treg/Th17向Th17細(xì)胞免疫應(yīng)答偏移，且Treg/Th17失衡越嚴(yán)重，AA病情越嚴(yán)重，預(yù)后越差，可能為臨床監(jiān)測、診治提供新的途徑。