兩種金花茶葉片活性成分動態(tài)積累的分析與評價*

彭健玲，李美玲，柴勝豐，朱成豪，劉志新，鄧家剛

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所，廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室，廣西桂林 541006；2.廣西師范大學生命科學學院，廣西桂林 541006；3.廣西桂人堂金花茶產(chǎn)業(yè)集團股份有限公司，廣西防城港 538021；4.廣西中藥藥效研究重點實驗室，廣西南寧 530200)

0 引言

金花茶組植物(CamelliaSect.ChrysanthaChang)系山茶科山茶屬常綠灌木和小喬木，是世界珍稀瀕危植物，被譽為“茶族皇后”和“植物大熊貓”[1]。主要分布在廣西西南部的防城港、南寧、隆安、扶綏等縣(市)，為喜暖熱植物，對熱量要求較高，受區(qū)域性限制較明顯，屬于熱帶性樹種[2]。金花茶組植物葉片含有茶多酚、總皂苷、總黃酮和總多糖等多種生物活性成分[3]，與其抗氧化活性呈正相關，具有抗氧化、抗凋亡[4]、降血脂[5]、降血糖[6]、抗腫瘤[7]、抗抑郁[8]等優(yōu)良藥理活性。近年來，金花茶(Camellianitidissima)葉片已被開發(fā)成濃縮液、口服液、茶飲料、袋泡茶等一系列營養(yǎng)保健食品，市場前景較好。因此，了解金花茶主要活性成分的動態(tài)積累規(guī)律，確定合理的采收時期，對提高金花茶產(chǎn)品的質量具有重要意義。

目前，有關金花茶活性成分的動態(tài)變化與分析方面的研究較少。黃永林等[9]對不同時期采摘的金花茶葉片的總黃酮進行測定發(fā)現(xiàn)，金花茶葉片中黃酮含量在1—10月份呈波動性上升趨勢。張蕾等[10]對不同發(fā)育時期的金花茶花瓣的總多酚和總黃酮進行分析，結果表明，花瓣的生物活性成分含量排序為盛開期>花蕾期>初謝期>半開期。金花茶和顯脈金花茶(C.euphlebia)均分布在廣西防城港，是用于開花金花茶系列產(chǎn)品的主要種類，其中尤以金花茶應用最為廣泛。本研究利用分光光度法測定不同時期的金花茶和顯脈金花茶葉片茶多酚、總皂苷、總黃酮和總多糖含量，并分析這4種活性成分動態(tài)變化規(guī)律，以期確定兩種金花茶葉片的最佳采摘期。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為金花茶和顯脈金花茶成年植株從抽梢至一年生葉片。從2018年11月起，每月中旬在廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所金花茶種植區(qū)采集樣品一次，直至2019年10月。然后把樣品放在電熱恒溫干燥箱中，105℃下殺青15 min，56℃烘24 h，使用多功能粉碎機將烘干的葉片粉碎，標準分樣篩(60目)過篩，備用。

1.2 方法

1.2.1 茶多酚含量的測定

稱取0.2 g樣品粉末于10 mL離心管中，加入5 mL在70℃預熱過的70%(V∶V)甲醇溶液，充分攪拌均勻；立即移入70℃水浴鍋中水浴浸提10 min，每隔5 min攪拌一次；浸提后，冷卻至室溫，移入離心機，3 500 r/min離心10 min，然后將上清液移至10 mL離心管中；殘渣再用5 mL的70%(V∶V)甲醇溶液提取一次，重復上述操作，合并提取液，再用70%(V∶V)甲醇溶液定容至10 mL，搖勻，作為母液[11]。取1 mL上述母液至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，搖勻作為測試液。分別取1 mL測試液于10 mL的離心管中，以1 mL蒸餾水代替樣液，作為空白對照組，根據(jù)GB/T 8313—2018茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法[11]，在765 nm波長下測定吸光值。制作標準曲線，得到線性回歸方程(1)，線性范圍為0.002—0.024 mg/mL，計算各樣品葉片中茶多酚的含量。

y=0.081x-0.0003 (R2=0.999 9)。

(1)

1.2.2 總皂苷含量的測定

稱取0.2 g樣品粉末于10 mL離心管中，加入9.4 mL蒸餾水(料液質量體積比1∶47)；在70℃、功率為270 W的條件下超聲波提取50 min；冷卻后在8 000 r/min條件下離心10 min，離心后將上清液轉移至100 mL容量瓶中，定容，搖勻，得到金花茶葉總皂苷測試液；取1 mL樣品測試液于10 mL離心管中，以1 mL蒸餾水代替樣液，作為空白組，在475 nm波長處測定吸光值[12]。制作標準曲線，得到線性回歸方程(2)，線性范圍為0.02—0.20 mg/mL，計算各樣品葉片中總皂苷的含量。

y=0.3822x-0.0083 (R2=0.999 9)。

(2)

1.2.3 總黃酮含量的測定

取0.5 g金花茶粉末放入50 mL離心管中，加入30 mL 70%(V∶V)乙醇(料液質量體積比1∶60)，放置于超聲波震蕩儀中，在功率360 W下提取35 min，其間震蕩兩次[13]。將提取液過濾到50 mL的容量瓶中，用70%(V∶V)乙醇定容至刻度，混勻，作為測試液。分別取1 mL樣品測試液至25 mL容量瓶中，以1 mL 70%(V∶V)乙醇代替樣液，作為空白組，在510 nm波長處測定各樣品的吸光值[14]。制作標準曲線，得到線性回歸方程(3)，線性范圍為0.002—0.040 mg/mL，計算各樣品葉片中的總黃酮含量。

y=0.0813x+0.0004 (R2=0.999 9)。

(3)

1.2.4 總多糖含量的測定

稱取0.2 g金花茶粉末放入50 mL離心管中，加入10 mL蒸餾水(料液質量體積比1∶50)，放置于超聲波震蕩儀中，在功率300 W、溫度70℃下提取1 h，冷卻后轉入離心機，8 000 r/min離心15 min，過濾，取上清液，上清液即金花茶總多糖粗提液；向粗提液加入3倍體積的95%(V∶V)乙醇，沉淀金花茶總多糖成分；然后8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，得到總多糖沉淀[15]。用蒸餾水溶解所得的沉淀并定容至100 mL，得到測試液。分別量取1 mL樣品測試液于試管中，以1 mL蒸餾水代替樣液，作為空白組，在490 nm波長處測各樣品的吸光值[16-17]。制作標準曲線，得到線性回歸方程(4)，線性范圍為0.01—0.09 mg/mL，計算樣品的總多糖含量。

y=0.1178x+ 0.002 (R2=0.999 3)。

(4)

1.2.5 綜合評價

本研究采用層次分析法(AHP)計算各個指標的權重，然后利用功效系數(shù)法對所獲得的數(shù)據(jù)進行無量綱化處理，計算出金花茶單項指標功效系數(shù)值(di)，再根據(jù)各指標的權重值計算出總功效系數(shù)值，最后按照總功效系數(shù)值的大小進行綜合評價，綜合評分值越大，證明該金花茶的活性成分越高，價值越大。單項指標評估分di(分)的公式為

(5)

綜合功效系數(shù)的公式[18]為

(6)

式(5-6)中xhi、xsi分別是各指標的最大值和最小值，xi為金花茶各指標的測定值，D為綜合評價的得分值，wi代表各指標的權重值。

2 結果與分析

2.1 活性成分含量變化

2.1.1 茶多酚含量變化

從11月到翌年10月，顯脈金花茶葉片茶多酚含量的變化幅度較大，為1.956%—7.815%。其中11月份含量最高(7.815%)，12月份驟減，隨著葉片的成熟，茶多酚含量越來越低，10月份達到最低值(1.956%)。金花茶茶多酚含量也是在11月最高，為1.929%，11月至翌年1月稍有下降，12月份含量最低，為1.200%，隨后逐漸升高，6月以后趨于穩(wěn)定(圖1)。

圖1 兩種金花茶葉不同時期的茶多酚含量變化

2.1.2 總皂苷含量變化

顯脈金花茶總皂苷變化幅度為4.563%—8.382%，從11月至翌年2月，總皂苷含量呈上升趨勢，2月份達到峰值(8.382%)，隨后總體呈降低趨勢，10月份達到最小值(4.563%)。金花茶總皂苷在12月略微下降，1月驟增，達到峰值(4.382%)，然后逐漸降低，5月份總皂苷含量最低(2.585%)，隨后再次升高，8月以后達到穩(wěn)定狀態(tài)(圖2)。

2.1.3 總黃酮含量變化

顯脈金花茶的總黃酮含量變化趨勢與總皂苷的變化趨勢較相似，從11月份到翌年2月份，總黃酮含量整體呈上升趨勢，2月份達到峰值，為3.779%，3-7月呈降低趨勢，8月、9月有所回升，10月份再次下降?？傮w上，金花茶總黃酮含量變化呈現(xiàn)上升趨勢，在11月份最低，為0.811%，隨后逐漸升高，直至7月達到峰值(2.021%)，并趨于穩(wěn)定(圖3)。

圖2 兩種金花茶葉不同時期的總皂苷含量變化

圖3 兩種金花茶葉不同時期的總黃酮含量變化

2.1.4 總多糖含量變化

顯脈金花茶總多糖的變化幅度為0.907%—4.403%，從11月至翌年4月份，總多糖含量呈逐漸升高趨勢，4月份達到峰值(4.403%)，隨后逐漸降低，8月以后趨于穩(wěn)定。金花茶總多糖含量在11月最低，為1.201%，然后逐漸升高，至4月份達到峰值，為3.793%，隨后逐漸下降并稍有波動(圖4)。

圖4 兩種金花茶葉不同時期的總多糖含量變化

2.2 各指標權重占比

由表1可知，兩個判斷矩陣的CR值均小于0.1，說明矩陣通過一致性檢驗，并且建立的判斷矩陣合理。對比各指標的權重值(Wi)，顯脈金花茶總皂苷的權重最大，為45.821%，茶多酚次之，總多糖最小。金花茶總皂苷的權重值最大，為40.159%，總多糖次之，總黃酮最小。說明總皂苷在兩種金花茶的綜合評價中均為最重要的指標。

表1 各指標權重占比與一致性值

2.3 顯脈金花茶綜合評價得分

從表2可以看出，顯脈金花茶綜合得分值在12月份有所降低，隨后的1—7月份呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在8—10月階段則出現(xiàn)波動變化。1月和2月的綜合得分均在86分以上，其中2月份達到最大值，為89.84分;10月份得分最低，為61.06分。所以，顯脈金花茶葉片在2月份生理活性成分含量最高，為最佳采摘期，1—2月為適宜采摘期。

表2 顯脈金花茶的各成分含量及綜合評價得分值

續(xù)表2

2.4 金花茶綜合評價得分

金花茶的綜合得分值的變化規(guī)律與顯脈金花茶大有不同，12月份的綜合得分比11月低，隨后整體呈升高-降低-升高趨勢，在8—10月的得分均大于85.00分，生理活性成分含量均較高，其中9月份最高，為86.15分(表3)。因此在9月采摘的金花茶葉片將獲得最高的活性成分，8—10月可作為適宜采摘期。

表3 金花茶的測定值及綜合評價分值

3 討論

本研究通過測定顯脈金花茶和金花茶在不同時期主要活性成分變化，初步確定兩種金花茶主要活性成分的變化規(guī)律。結果顯示，同一種活性成分在不同種類中的變化規(guī)律不盡相同，這些差異可能與其內源因素和環(huán)境條件的變化有關。兩種金花茶的總皂苷和總多糖含量的變化趨勢相似，而總黃酮和茶多酚含量的變化趨勢則不同。

顯脈金花茶在11月抽梢，葉子鮮嫩，因此茶多酚含量最高，隨后隨著葉子的老化，茶多酚含量逐漸減少[19]。而金花茶嫩葉的茶多酚含量只是稍高于成熟葉，這可能與其自身的生物學特性有關。夏季的光照強度比秋季強，并且夏季溫度高，物質代謝加速，更有利于茶多酚的積累，因此兩種金花茶的茶多酚含量夏季高于秋季[20]。

兩種金花茶的總皂苷含量在1月或2月最高，季節(jié)性變化明顯，推測其是受到溫度、土壤相對濕度、光照因子的多重影響，但影響總皂苷積累的主要因素還有待進一步研究[21]。

較低的溫度更有利于總黃酮的積累，這也許就是造成顯脈金花茶的總黃酮含量在冬季和春季較高的原因之一；除此之外,黃酮類化合物也受到植物生長調節(jié)劑的影響，吲哚乙酸(IAA)可抑制黃酮類化合物的積累，脫落酸(ABA)則利于總黃酮的積累[22]。因此，顯脈金花茶和金花茶的總黃酮含量在不同時期隨著內源激素IAA/ABA的比值而呈現(xiàn)不同的變化[23-25]。在抽梢期(11—12月)，金花茶葉的內源ABA含量相對較低，而IAA的含量相對較高，因此此時總黃酮的積累較少。顯脈金花茶在1—2月時IAA/ABA的比值較低，有利于總黃酮的積累，因此顯脈金花茶的總黃酮含量在1—2月保持較高水平。

王坤等[26]的研究表明，與顯脈金花茶相比，金花茶光合作用能力和光化學轉化效率稍大，呼吸消耗速率較低，在相同的環(huán)境條件下能積累更多的光合產(chǎn)物，這與本研究中金花茶的總多糖含量比顯脈金花茶稍高的結果相符合。兩種金花茶的總多糖含量在秋冬季節(jié)較低，推測是干旱脅迫抑制其光合作用，從而總多糖的累積減少[27]。

4 結論

從上述數(shù)據(jù)可以看出，顯脈金花茶的總黃酮、茶多酚和總皂苷均比金花茶高，而其總多糖成分則略低于金花茶，推測顯脈金花茶具有更大的藥用價值，適用于研發(fā)有益于人體的多種功能性保健品。綜合評價結果表明，顯脈金花茶在1—2月得分在86分以上，其中2月得分最高，為89.84分，適宜采摘期在1—2月，最佳采摘期在2月；金花茶在8—10月得分值在85分以上，其中9月最高，為86.15分，適宜采摘期在8—10月，最佳采摘期在9月。

由于不同種類的金花茶的活性成分變化規(guī)律不同，因此需要對其他金花茶進行測定，獲得更加全面的數(shù)據(jù)，以促進對該類群的管理和開發(fā)利用。目前，金花茶中占主體地位的活性成分尚不明確，所以，有必要深入探索金花茶的有效成分，這不僅能夠提高綜合評價的合理性，而且將為金花茶系列產(chǎn)品的開發(fā)提供更為科學的理論依據(jù)。