響應(yīng)面優(yōu)化華腺萼木總黃酮和總多糖的超聲波輔助提取工藝*

秦惠珍，曹其義，寧莞權(quán)，唐健民,鄒 蓉，朱成豪，韋 霄，熊忠臣**

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541006 ；2.百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西百色 533000)

0 引言

華腺萼木Mycetiasinensis為茜草科多年生小灌木，是中國特有物種，為廣西9種野生甜茶植物之一[1]。華腺萼木具有生津止渴、健身養(yǎng)顏的功效，可以開發(fā)成低能量、無毒、高甜度的天然甜味劑。甜茶類植物的化學(xué)成分研究表明，多糖和黃酮是甜茶類植物的主要有效成分。目前已經(jīng)從其他品種的甜茶植物分離出多種糖類成分和黃酮類化合物，如從廣西甜茶中分離出含有葡萄糖苷的化合物和豐富的黃酮類化合物[2-4]，從多穗柯甜茶中分離鑒定出至少22種黃酮類成分和3種甜味成分[5-8]。許多研究表明，從甜茶類植物中分離出的黃酮類化合物具有抗衰老、抗氧化、降血壓等多種藥理功效[9]，而多糖類化合物具有抗腫瘤、降血糖、降血脂等功效[10-12]。華腺萼木作為甜茶植物，在天然甜味劑開發(fā)和抗氧化藥理功效等方面具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。目前，華腺萼木的相關(guān)研究僅涉及形態(tài)學(xué)和植物組織培養(yǎng)方面[13-14]，其他方面研究尚未展開。因此，本研究對華腺萼木總黃酮和總多糖的提取工藝進(jìn)行研究，為有效開發(fā)華腺萼木這一天然甜茶資源提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：華腺萼木，于2018年10月采自廣西植物研究所喀斯特藥用植物園。取華腺萼木的莖和完整葉片，經(jīng)過烘干、粉碎后過60目篩備用。

溶液：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、蒸餾水、苯酚、濃硫酸、乙醇、5%NaNO2、4%NaOH、10%Al(NO3)3，均為分析純。

1.2 儀器

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計，ESJ200-4A和AE200型電子分析天平，DL-720E智能超聲波清洗器，TGL-10B型高速臺式離心機(jī)，B-260型恒溫水浴鍋。

1.3 方法

1.3.1 華腺萼木總黃酮提取工藝優(yōu)化

1.3.1.1 華腺萼木總黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線

加水將配制好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成濃度為0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mg·mL-1的蘆丁溶液，備用。吸取不同濃度的蘆丁溶液，置于25 mL容量瓶中，標(biāo)記0-6號。加入1 mL的5% NaNO2溶液，搖勻，室溫下放置6 min，加入1 mL 5% Al(NO3)3溶液，搖勻。再放置6 min之后加入10 mL的4% NaOH溶液，用30%乙醇定容，搖勻，靜置15 min。在190-900 nm處進(jìn)行光譜掃描后選用510 nm作為檢測波長[15-16]。以吸光值為縱坐標(biāo)(y)，總黃酮濃度為橫坐標(biāo)(x)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=13.438x+0.0008 (R2=0.990 8)。在510 nm波長下測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光值。

1.3.1.2 華腺萼木總黃酮的提取工藝

稱取華腺萼木粉末0.2 g，加入乙醇，水浴條件下超聲波萃取，萃取結(jié)束后靜置10 min，用高速冷凍離心機(jī)進(jìn)行固液分離，取上清液定容至50 mL后取1 mL移至25 mL容量瓶中二次定容，按照1.3.1.1節(jié)的方法測定吸光值。根據(jù)1.3.1.1節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得樣品的總黃酮含量，再根據(jù)下列方程計算總黃酮得率。公式中C為提取液中總黃酮的含量(mg/mL)，V為提取液體積(mL)，M為樣品粉末質(zhì)量(g)。

總黃酮得率(%)=C×(V/M)×100%。

1.3.1.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計

在超聲波頻率為低頻(53 kHz)狀態(tài)下，分別研究不同因素對華萼腺木總黃銅得率的影響。除提取條件不同外，試驗(yàn)過程均與1.3.1.2節(jié)的提取工藝相同。具體提取條件設(shè)置如下：

(1)不同超聲波功率：60，180，300，420，540 W；提取時間30 min，水浴溫度60℃，料液比1∶70，乙醇濃度40%。(2)不同料液比：1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100 (g∶mL)；提取時間30 min，水浴溫度60℃，乙醇濃度40%，超聲波功率300 W。(3)不同乙醇濃度：20%、40%、60%、80%、100%，提取時間30 min，水浴溫度60℃，料液比1∶70，超聲波功率300 W。(4)不同提取溫度(水浴溫度)：40，50，60，70，80℃，提取時間30 min，料液比1∶70，乙醇濃度40%，超聲波功率300 W。(5)不同提取時間：10，30，50，70，90 min，水浴溫度60℃，料液比1∶70，乙醇濃度40%，超聲波功率300 W。

1.3.1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

參考其他甜茶類植物總黃酮提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計[4,11-12]，結(jié)合華腺萼木總黃酮的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取功率(A)、料液比(B)、乙醇濃度(C)及提取時間(D)為因素，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計，通過Design-Expert 8.0.6軟件分析試驗(yàn)結(jié)果，因素及水平見表1。

表1 總黃酮提取因素水平表

1.3.2 華腺萼木總多糖提取工藝優(yōu)化

1.3.2.1 華腺萼木總多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱量無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g，加蒸餾水定容，配成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再分別取2.5，5.0，10.0，15.0，20.0 mL，置于棕色瓶定容至100 mL，搖勻，即為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。采用苯酚-硫酸法測定吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)(y)，總多糖濃度為橫坐標(biāo)(x)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程y=8.778x-0.0195,R2=0.999 1。

1.3.2.2 華腺萼木總多糖提取工藝及其含量測定

總多糖提取工藝與總黃酮提取工藝相似，包括以下步驟：稱取烘干后的華腺萼木粉末0.2 g，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，然后利用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，得到多糖粗提液，將其用乙醇進(jìn)行沉淀，測定總多糖含量?？偠嗵呛繙y定采用苯酚-硫酸法，步驟如下：取總多糖提取液1 mL于試管中，加入1 mL 5%苯酚溶液，搖勻，快速加入5 mL濃硫酸，振蕩4 min后室溫下放置30 min，然后于490 nm波長下測其吸光值。將吸光值代入1.3.2.1節(jié)的總多糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算得總多糖濃度[17]。再根據(jù)以下方程，計算總多糖得率:

總多糖得率(%)=C×V×(稀釋倍數(shù)/M)×100%，

其中，C為測得的總多糖濃度(mg/mL)，V為提取液體積(mL)，M是原料的干重(g)。

1.3.2.3 總多糖單因素試驗(yàn)設(shè)計

在超聲波頻率為低頻(53 kHz)狀態(tài)下，分別研究不同因素對華萼腺木總多糖得率的影響。(1)不同超聲功率：120，240，360，480，600 W，提取時間30 min，提取溫度60℃；(2)不同提取溫度：40，50，60，70，80℃，超聲波功率240 W，提取時間30 min；(3)不同提取時間：90，120，150，180，210 min，超聲波功率240 W，提取溫度70℃。因?yàn)椴煌弦罕冗M(jìn)行多次試驗(yàn)均呈顯著性差異，所以本研究不對料液比進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.2.4 華腺萼木多糖響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

參考兩種茶總多糖的響應(yīng)面設(shè)計試驗(yàn)[18-19]，結(jié)合本研究的單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Behnken設(shè)計，選擇超聲波功率、提取溫度、提取時間作為響應(yīng)因子，以華腺萼木總多糖提取量為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析。試驗(yàn)因素水平設(shè)計見表2。

表2 總多糖提取因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 華萼腺木總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

超聲波功率對華腺萼木總黃酮提取的影響(圖1a)：當(dāng)超聲波功率小于300 W時，總黃酮得率隨著超聲波功率的增加而逐漸增大，超聲波功率為300 W時達(dá)到最大值2.24%，隨后逐漸降低。原因可能是超聲波功率較小時體系中溶解的總黃酮量較小，加大超聲波功率能使更多的總黃酮溶出，但是當(dāng)總黃酮溶出達(dá)到體系飽和值時，加大超聲波的功率則會使更多雜質(zhì)溶出，從而影響黃酮得率，所以選取超聲波功率為300 W。

料液比對華腺萼木總黃酮提取的影響(圖1b)：在料液比為1∶90時，總黃酮得率達(dá)到最大值2.52%，但料液比繼續(xù)增大后，總黃酮得率開始下降，原因可能是料液比小于1∶90時，體系內(nèi)少量溶劑無法將華腺萼木粉末完全浸濕導(dǎo)致其中的總黃酮溶出不完全，而當(dāng)料液比達(dá)到1∶90后，體系中的總黃酮溶出完全，之后總黃酮得率降低原因是體系中含有的過量乙醇會導(dǎo)致總黃酮損失，導(dǎo)致總黃酮得率下降，所以選取料液比為1∶90。

提取時間對華腺萼木總黃酮提取的影響(圖1c)：提取時間在10—50 min時，華腺萼木的總黃酮得率隨提取時間增加而增大，在50 min時達(dá)到最大值2.24%，隨后總黃酮得率逐漸降低。原因可能是時間過長超聲波的空化效應(yīng)和熱效應(yīng)[20]破壞了華腺萼木總黃酮結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致總黃酮得率降低，所以選取提取時間為50 min。

乙醇濃度對華腺萼木總黃酮提取率的影響(圖1d)：乙醇濃度為20%-80%時，總黃酮得率隨著乙醇濃度的增加而增大，在乙醇濃度達(dá)到80%時達(dá)到最大值2.23%，隨后總黃酮得率開始降低。原因可能是在60%—80%乙醇濃度條件下，華腺萼木總黃酮已經(jīng)大部分溶出，如果乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，過量乙醇會將華腺萼木中的其他雜質(zhì)成分溶出，導(dǎo)致總黃酮得率下降[21]，所以選取乙醇濃度為70%。

提取溫度對華腺萼木總黃酮提取的影響(圖1e)：在40-60℃時，總黃酮得率隨著提取溫度增加逐漸增大，在60℃時達(dá)到最大值1.97%，隨后溫度升高，總黃酮得率逐漸下降。原因可能是前期隨著溫度升高，分子運(yùn)動加速，細(xì)胞破裂加快有利于總黃酮的溶出，而60℃后繼續(xù)升高溫度，過高溫度會破壞總黃酮的結(jié)構(gòu)[22]，造成提取率下降，所以選取提取溫度為60℃。

圖1 超聲波功率(a)、料液比(b)、提取時間(c)、乙醇濃度(d)和提取溫度(e)對總黃酮得率的影響

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化總黃酮提取工藝

2.1.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及響應(yīng)值

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲波功率、料液比、乙醇濃度和提取時間作為響應(yīng)面設(shè)計的因變量，設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，共計29個試驗(yàn)點(diǎn)(其中有5個零點(diǎn))，計算29個試驗(yàn)點(diǎn)的總黃酮得率(表3)。

表3 總黃酮提取響應(yīng)面設(shè)計及響應(yīng)值

續(xù)表3

2.1.2.2 響應(yīng)面模型的建立及分析

用Design-Expert 8.0.6 軟件擬響應(yīng)面優(yōu)化分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到華萼腺木總黃酮提取物的回歸方程為

Y=2.04-0.0075A+0.065B-0.18C+0.037D-0.1AB-0.04AC+0.05AD-0.015BC+0.0025BD+0.038371CD-0.22A2-0.13B2-0.61C2-0.18D2。

響應(yīng)面回歸方程不同系數(shù)的絕對值代表不同響應(yīng)因子對響應(yīng)值的影響程度[23-24]。對響應(yīng)模型進(jìn)行顯著性分析可知(表4)，回歸模型極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)，矯正系數(shù)R2adj=0.910 9,相關(guān)系數(shù)R2=0.955 5，說明模型擬合效果較好，試驗(yàn)值與擬合值具有高度相關(guān)性，可見該模型可以用于對華腺萼木總黃酮得率的準(zhǔn)確預(yù)測和分析。一次項B、C和二次項A2、B2、C2具有顯著性，交互項不具顯著性。

2.1.2.3 響應(yīng)面交互因素分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件做出相應(yīng)因素之間的交互作用分析圖(圖2-6)。交互作用響應(yīng)曲面圖的坡度反應(yīng)各交互因素對總黃酮得率的影響程度，坡度越大，說明交互作用的影響越大。AB、AC、BC、BD和AD交互項間的等高線均為橢圓形，說明其交互作用不具顯著性，與表4相符。分析圖2-6交互項間的陡峭程度可知，各影響因素的影響程度大小分別為B>A、C>A、C>B、A>D。因此這4個影響因素對總黃酮得率的影響大小分別為C>B>A>D，即乙醇濃度>料液比>超聲波功率>提取時間。

表4 總黃酮回歸模型顯著性分析

圖2 交互作用AB對總黃酮得率的影響

圖4 交互作用AD對總黃酮得率的影響

圖5 交互作用BC對總黃酮得率的影響

圖6 交互作用CD對總黃酮得率的影響

2.1.2.4 優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為獲得最佳的提取工藝，繼續(xù)采用Design-Expert 8.0.6對上述模型進(jìn)行進(jìn)一步分析，得到華腺萼木總黃酮提取工藝條件為超聲功率291.6 W，料液比1∶95.6，乙醇濃度77%，提取時間51.2 min，預(yù)測黃酮提取率為2.48%。根據(jù)實(shí)際操作的可行性將工藝條件調(diào)整為超聲波功率為300 W，料液比1∶95，乙醇濃度75%，提取時間50 min，在該工藝條件下進(jìn)行5次重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)，得到修改后工藝的總黃酮得率為2.36%，可見，響應(yīng)面擬合模型預(yù)測結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果較為接近，說明華腺萼木總黃酮提取工藝可以通過響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 華腺萼木總多糖提取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

超聲波功率、提取溫度和提取時間對華腺萼木總多糖提取的影響如圖7所示。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，華腺萼木總多糖得率隨超聲波功率增大呈現(xiàn)先升高-降低-升高的趨勢，在超聲波功率為240 W時，總多糖得率達(dá)到最大值71.19%，隨后降低(圖7a)。先升后降的原因可能是超聲波功率增大有利于總多糖從溶液中溶出，但超聲波功率過大時會導(dǎo)致其他的物質(zhì)溶出，從而影響體系中的總多糖含量。

華腺萼木總多糖得率在提取溫度試驗(yàn)范圍內(nèi)呈現(xiàn)降低-升高-降低的趨勢(圖7b)，提取溫度為70℃時總多糖得率達(dá)到最大值56.77%。在溫度為40—50℃時，總多糖得率降低，原因可能是一開始體系中能溶解出較多的總多糖類物質(zhì)，其他物質(zhì)溶解得較少，當(dāng)溫度升高到50℃時其他物質(zhì)溶解量增加，導(dǎo)致總多糖含量減少。隨后溫度上升，總多糖溶解增加，體系中總多糖含量增加。提取溫度大于70℃后，溫度過高導(dǎo)致體系中的多糖分子結(jié)構(gòu)受損，總多糖含量降低。

華腺萼木總多糖得率在提取時間試驗(yàn)范圍內(nèi)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(圖7c)，在提取時間為180 min時達(dá)到最大值78.03%，隨后降低。原因可能是隨著浸提時間增長，多糖分子被破壞和水解，同時也使一些水溶性雜質(zhì)溶出，致使總多糖含量降低。

綜上，選取超聲功率240 W、提取溫度70℃、提取時間180 min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖7 超聲波功率(a)、提取溫度(b)和提取時間(c)對總多糖得率的影響

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化華腺萼木總多糖提取工藝

2.2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計及響應(yīng)值

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取時間、超聲波功率和提取溫度為自變量、華萼腺木總多糖提取率為響應(yīng)值，通過Box-Benhnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化華萼腺木總多糖提取工藝。利用Design-Expert 8.0.6 軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表5)。

表5 總多糖響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及響應(yīng)值

續(xù)表5

2.2.2.2 響應(yīng)面模型的建立及分析

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用 Design-Expert 8.0.6 軟件擬合得到華萼腺木總多糖提取物的回歸方程為Y=81.43+0.54A+2.15B+1.09C+0.11AB-0.28AC+0.35BC-10.33A2-9.68B2+0.43C2。

對響應(yīng)模型進(jìn)行顯著性分析(表6)，模型具極顯著性(P<0.01)，說明模型具有意義，失擬項不顯著(P>0.05)，說明模型理論值與試驗(yàn)值差異較?。籖2adj=0.912 3，說明模型能解釋91.23%的響應(yīng)值的變化；相關(guān)系數(shù)R2=0.961 6，說明模型擬合效果較好，可以用方程代替試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測和分析。一次項A達(dá)到顯著水平，二次項A2和B2達(dá)到極顯著水平，交互項未達(dá)到顯著水平。

2.2.2.3 響應(yīng)面交互因素分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件做出總多糖相應(yīng)因素之間的交互作用分析圖(圖8-10)。由圖8可知，當(dāng)提取溫度為70℃時，總多糖得率隨提取時間和超聲波功率的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢，從曲面的陡峭度來看，提取時間對總多糖得率的影響大于超聲波功率。由圖9可知，當(dāng)超聲波功率為240 W時，總多糖得率隨提取時間和提取溫度增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢，但坡度較小，從曲面陡峭度來看，提取時間的曲面稍微比提取溫度陡峭一點(diǎn)，可見提取時間對總多糖得率的影響稍大于提取溫度。由圖10可知，當(dāng)提取時間為180 min時，總多糖得率隨超聲波功率和提取溫度呈現(xiàn)先增后減的趨勢，但坡度較小，從曲面陡峭度來看，提取溫度對總多糖得率的影響大于超聲波功率。因此，各因素對華腺萼木總多糖得率的影響強(qiáng)弱順序?yàn)樘崛r間>超聲波功率>提取時間。

表6 總多糖回歸模型顯著性分析

圖8 交互作用AB對總多糖得率的影響

圖9 交互作用AC對總多糖得率的影響

圖10 交互作用BC對總多糖得率的影響

2.2.2.4 優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為獲得最佳的總多糖提取工藝，繼續(xù)采用Design-Expert 8.0.6對上述模型進(jìn)行進(jìn)一步分析，得到華腺萼木總多糖提取工藝條件為時間180.1 min，功率261.1 W，溫度80℃，此時華腺萼木總多糖提取率的理論值為83.18%。根據(jù)實(shí)際操作的可行性將工藝條件修改為提取時間180 min，功率250 W，溫度80℃，此工藝條件下重復(fù)試驗(yàn)5次，結(jié)果平均提取率為82.77%。試驗(yàn)表明，通過響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳工藝的華腺萼木總多糖提取率，與最佳工藝條件下的理論值相差較小，說明響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝適用于華腺萼木總多糖提取。

3 結(jié)論

水提法、醇提法、酶解法和超聲波法等提取方法對不同植物的總黃酮和總多糖提取效果具有顯著性差異。不同種植物采用相同的提取工藝也會產(chǎn)生顯著性差異，同種植物的總黃酮和總多糖的提取采用相同的方法進(jìn)行提取，不同因素間的作用也不同。本研究采用單因素試驗(yàn)分析不同因素對華腺萼木總黃酮和總多糖提取的影響，發(fā)現(xiàn)兩種物質(zhì)所需要的條件不同，總黃酮提取的最佳單因素為超聲波功率300 W，料液比1∶90，乙醇濃度70%，提取時間50 min，提取溫度60℃；總多糖提取的最佳單因素為超聲波功率240 W，溫度70℃，時間180 min?？偠嗵翘崛”赛S酮提取工藝需要花費(fèi)更長的時間，總多糖溶解所需的溫度高于總黃酮，但超聲波功率低于總黃酮。根據(jù)最佳因素設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化總黃酮提取和總多糖提取工藝，總黃酮提取工藝各因素間的影響力大小依次為乙醇濃度>料液比>超聲波功率>提取時間，總多糖提取工藝各因素間的影響力大小依次為提取時間>超聲波功率>提取溫度，同種因素如提取時間對總黃酮提取的影響較小，而對總多糖提取的影響較大。通過單因素和響應(yīng)面分析及操作的可行性最終確定總黃酮提取的最佳工藝為超聲波功率300 W，料液比1∶95，乙醇濃度75%，提取時間50 min，此時總黃酮得率為2.36%(理論值為2.48%)；總多糖提取的最佳工藝為提取時間180 min，功率250 W，溫度80℃，此時總多糖得率為82.77%(理論值為83.18%)。由此可見用響應(yīng)面法優(yōu)化華腺萼木總黃酮和總多糖的提取工藝，結(jié)果與理論值相差較小，表明利用響應(yīng)面優(yōu)化華腺萼木總黃酮和總多糖提取工藝的方法是可行的，可以為華腺萼木總黃酮和總多糖的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)，為華腺萼木資源的開發(fā)提供技術(shù)支撐。