不同來源的黃芪多糖產(chǎn)品質(zhì)量比較研究*

蔣小華，林 楠，劉冬敏，李典鵬，盧鳳來**

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541006； 2.桂林華藝生物科技有限公司，廣西桂林 541805)

0 引言

黃芪為豆科植物膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus)或蒙古黃芪(A.membranaceusvar.mongholicus)的干燥根，黃芪多糖為黃芪的主要活性成分，臨床常用作免疫增強(qiáng)劑，抗細(xì)菌、抗病毒藥物[1-2]。隨著集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，畜禽應(yīng)激性增加，免疫力持續(xù)下降，發(fā)病率逐年攀升。自2006 年豬高熱病爆發(fā)以來，黃芪多糖成為“明星藥物”，在市場上供不應(yīng)求，造成目前市場上黃芪多糖產(chǎn)品繁多、價(jià)格各異、質(zhì)量參差不齊，存在摻假和以次充好等現(xiàn)象。

黃芪多糖常用的鑒別方法有物理方法(顏色、手感、味道和溶解情況)和化學(xué)方法[3-4](醇沉淀法、高熱法和高效薄層色譜儀鑒別法)，這些方法只能大致鑒別，不能確定產(chǎn)品的品質(zhì)。目前常用于測定黃芪多糖含量的方法為紫外分光光度法[5-6]。該方法以葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸顯色法測定總多糖含量，因此不能辨別是否含有葡萄糖、麥芽糊精。多糖由各種單糖組成，來自同一植物資源的多糖其單糖組成及構(gòu)成比例在一定范圍內(nèi)波動(dòng)，通過對單糖的檢測可對藥材及產(chǎn)品進(jìn)行鑒別。目前已有學(xué)者采用柱前衍生化高效液相色譜法和乙?；瘹庀嗌V法等[7-11]，對不同來源黃芪多糖的單糖成分進(jìn)行分析。然而這些方法都需要衍生化處理才可以分析，前處理煩瑣，還可能引入雜質(zhì)，干擾測定結(jié)果。

示差折光檢測器是一種高度穩(wěn)定、靈敏的通用型檢測器?，F(xiàn)行測定單糖的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22221—2008 和GB/T 22222—2008 采用的就是高效液相色譜示差折光法[12]。采用該方法檢測黃芪多糖的研究報(bào)道較少，且未見不同廠家黃芪多糖的質(zhì)量評價(jià)。為評價(jià)不同來源黃芪多糖產(chǎn)品的優(yōu)劣，給消費(fèi)者提供科學(xué)評價(jià)方法與依據(jù)，本研究應(yīng)用高效液相色譜示差折光法測定黃芪多糖的組成與構(gòu)成，同時(shí)應(yīng)用紫外分光光度法、物理鑒別對多個(gè)黃芪多糖產(chǎn)品進(jìn)行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

從不同來源獲取9批黃芪多糖產(chǎn)品(A—I)，所有產(chǎn)品均為粉末狀。其中，產(chǎn)品A、B、E來自桂林華藝生物科技有限公司，產(chǎn)品C、D為桂林華藝生物科技有限公司從別的廠家收集得到，產(chǎn)品F-I為從淘寶網(wǎng)上采購(產(chǎn)品H產(chǎn)地為河北石家莊，產(chǎn)品F、G和I均產(chǎn)自河南省)。葡萄糖和阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品為本實(shí)驗(yàn)室自制，純度99.9%；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)用水全部采用超純水。

1.2 儀器設(shè)備

T6型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；日本島津高效液相色譜儀LC-20AT，包括RID-10A示差檢測器、控制器CBM-20A、在線脫氣器DGU-20A5、泵LC-20AT和手動(dòng)進(jìn)樣器7255；柱溫箱(Millipore公司)；Transgenomic Ca2+分析柱(300 mm×6.5 mm)；50 L YXQ-LS-SII立式滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；電子天平(梅特勒AT-200)；臺式離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；B3500S-MT超聲清洗器(上海必能信超聲有限公司)；DDS-11A雷磁電導(dǎo)率儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；超純水儀(Millipore 公司)。

1.3 方法

1.3.1 紫外分光光度法(UV)[5-6]

1.3.1.1 對照溶液的制備

準(zhǔn)確稱取在105℃干燥至恒重的無水葡萄糖500 mg，置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 mL葡萄糖溶液置于100 mL量瓶中，加水至刻度，即得。

1.3.1.2 供試品溶液制備

準(zhǔn)確稱取黃芪多糖粉末1.000 g置于250 mL量瓶中，加20 mL水溶解，再加入30%硫酸鋅溶液5 mL，水浴加熱5 min 后，在振搖下加入亞鐵氰化鉀試液5 mL，冷卻后加水至刻度，搖勻，濾過，棄初濾液，取續(xù)濾液5 mL置于200 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

1.3.1.3 含量測定

準(zhǔn)確量取對照品溶液與供試品溶液各2 mL，分別置于10 mL 量瓶中，各加入2%苯酚溶液0.5 mL，硫酸5 mL，搖勻，水浴加熱30 min，冷卻，加水稀釋至刻度，搖勻，采用紫外分光光度法在490 nm 處分別測定吸收值，以葡萄糖濃度為x軸，吸光值為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線進(jìn)行回歸分析，計(jì)算樣品含量。

1.3.1.4 精密度、回收率和穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密度：取同一濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1 d內(nèi)重復(fù)測定6次，計(jì)算葡萄糖日內(nèi)RSD。

回收率：將不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品加入6份樣品中，測定平均回收率，計(jì)算RSD。

穩(wěn)定性：取3種不同濃度的無水葡萄糖溶液，分別水浴加熱0，5，10，20，30 min，在490 nm 處分別測定吸收值。

1.3.2 黃芪多糖的物理鑒別法

分別稱取9批黃芪多糖供試品1.0 g，置于100 mL玻璃三角瓶中，觀察它們的顏色和粒度，看是否有白色顆粒；放置30 min后，搖晃三角瓶觀察是否有掛壁現(xiàn)象；加入25 mL 18 g/L稀硫酸溶液溶解，觀察溶解情況，搖晃三角瓶，觀察是否有泡沫產(chǎn)生。水解后搖勻，取1.5 mL水解液10 000 r/min離心5 min，觀察沉淀量。

1.3.3 高效液相色譜(HPLC)法

1.3.3.1 黃芪多糖的水解

參照文獻(xiàn)[13]的方法并適當(dāng)改進(jìn)，精密稱取黃芪多糖產(chǎn)品粉末1.0 g置于100 mL三角瓶中，加入25 mL 18 g/L H2SO4溶液，于超聲清洗器中均勻分散，蓋上橡膠塞，置于立式滅菌鍋內(nèi)121℃水解90 min。放冷，水解結(jié)束后補(bǔ)足蒸發(fā)的水分。過濾除去溶液中的不溶物，取0.5 mL水解液，先加入4 mL水稀釋，再加1.5 mL 左右0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH為中性，最后定容至10 mL；加入混合樹脂1.2 g (m陰離子樹脂∶m陽離子樹脂=2∶1)和少量活性炭，放搖床上，脫鹽后電導(dǎo)儀檢測電導(dǎo)降至5 μs/cm 以下時(shí)，用0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.3.3.2 HPLC測定條件

島津高效液相色譜儀器、LC solution色譜工作站、色譜柱Transgenomic Ca2+、RID-10A示差檢測器，流動(dòng)相為超純水，流速0.5 mL/min，柱溫85℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取6個(gè)不同濃度的葡萄糖和阿拉伯糖混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照HPLC條件進(jìn)行測定，以加入標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)x，以相應(yīng)單糖峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)信噪比確定檢出限(RSN=3)和定量限(RSN=10)。

1.3.3.4 精密度、回收率和穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密度：取同一濃度葡萄糖和阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品1 d內(nèi)重復(fù)測定6次，分別計(jì)算其日內(nèi)RSD。

回收率：分別取葡萄糖、阿拉伯糖加水配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，再分別加入6份黃芪多糖樣品中，測定平均回收率，計(jì)算RSD。

穩(wěn)定性：取同一批黃芪多糖樣品，分別水解0，1，2，4，8，24 h后，測定葡萄糖和阿拉伯糖的濃度，計(jì)算RSD。

1.3.3.5 樣品測定

分別適量取7家企業(yè)生產(chǎn)的9批黃芪多糖產(chǎn)品，按1.3.3.1節(jié)的方法水解后處理制成供試品溶液，按照HPLC條件進(jìn)行含量測定，與單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對，分析樣品水解產(chǎn)物，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃芪多糖樣品水解后葡萄糖和阿拉伯糖的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪多糖產(chǎn)品總多糖含量

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、回收率和穩(wěn)定性試驗(yàn)

研究結(jié)果顯示，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線為y=

0.2122x-0.00612，R2=0.998 0，濃度區(qū)間為0.05—1.50 g/L，表明線性關(guān)系較好。葡萄糖日內(nèi)RSD為0.72% (n=6) ，說明該方法的精密度良好；平均回收率為99.20%，RSD為0.55%，表明該方法的回收率符合要求；顯色反應(yīng)時(shí)間在30 min內(nèi)時(shí)，溶液吸收度無明顯變化，穩(wěn)定性較好。

2.1.2 樣品含量測定

對9批產(chǎn)品中黃芪總多糖進(jìn)行含量測定，結(jié)果如表1所示，9批黃芪多糖產(chǎn)品的總多糖含量差別均比較大，有5批產(chǎn)品總多糖含量達(dá)到0.600 0 g/g以上，其中產(chǎn)品C、H的總多糖含量超過0.900 0 g/g，而另外4個(gè)產(chǎn)品總多糖含量較低，為0.100 0—0.300 0 g/g。

表1 9批黃芪多糖產(chǎn)品總多糖含量

2.2 黃芪多糖的性狀

圖1中(a)為9批黃芪多糖產(chǎn)品粉末外觀，(b)為9批產(chǎn)品溶解在稀硫酸中的產(chǎn)泡情況，(c)為9批產(chǎn)品水解離心后的情況。由圖1及表2可以看出，9批黃芪多糖產(chǎn)品顏色差別比較大，顏色較淺的有產(chǎn)品A、B、E，產(chǎn)品F和G的顏色最深，為紅褐色。各產(chǎn)品搖晃后，大部分有掛壁現(xiàn)象，只有產(chǎn)品D和I沒有。從溶解情況來看，產(chǎn)品C溶解速度最快，溶解最好，溶液透亮，離心后沒有沉淀；產(chǎn)品D最難溶，有大量的不溶物，離心后沉淀量也最多。從產(chǎn)泡情況來看各產(chǎn)品也有很大的差別，有的產(chǎn)品搖晃后無泡，如產(chǎn)品C和H；有的有少量泡沫，如產(chǎn)品D—G、I；產(chǎn)泡沫量最大的是產(chǎn)品A和B。

圖1 9批黃芪多糖產(chǎn)品的外觀、溶解后產(chǎn)泡及水解液情況

表2 9批黃芪多糖產(chǎn)品性狀

2.3 黃芪多糖單糖組成

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限測定結(jié)果

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y= 273649x+377.87，R2=1，濃度區(qū)間為0—2.0 g/L；葡萄糖的檢出限為0.003 1 g/g，定量限為0.009 3 g/g。阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=303410x-15.929，R2=1，濃度區(qū)間為0.0—0.5 g/L，檢出限為0.002 1 g/g，定量限為0.006 3 g/g。

2.3.2 精密度、回收率、穩(wěn)定性試驗(yàn)

葡萄糖和阿拉伯糖日內(nèi)RSD分別為0.67%(n=6)、0.93%(n=6)，表明儀器精密度良好；葡萄糖和阿拉伯糖的平均回收率分別為99.28%、99.10%，RSD均小于1.00%，表明該方法的回收率符合要求；葡萄糖和阿拉伯糖峰面積RSD分別為1.86%、1.95%，說明樣品溶液在24 h穩(wěn)定。

2.3.3 9批黃芪多糖樣品中葡萄糖和阿拉伯糖的含量

通過與單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對，可確定黃芪多糖水解后主要含有葡萄糖和阿拉伯糖(圖2)。從表3可以看出，黃芪多糖水解后各單糖含量有很大差別。產(chǎn)品A、B、E水解后的葡萄糖含量為0.36—0.40 g/g，產(chǎn)品C和H葡萄糖含量大于0.60 g/g；其他產(chǎn)品的葡萄糖含量很低，小于0.1 g/g。這個(gè)結(jié)果與紫外分光光度檢測結(jié)果相吻合：總多糖含量高的，則水解后葡萄糖單糖含量也相應(yīng)地高。同時(shí)，樣品中葡萄糖和阿拉伯糖含量比例有很大的差別。產(chǎn)品A、B、E的峰面積比分別為5.70∶1，5.28∶1，5.71∶1；在產(chǎn)品C和H中，水解后的葡萄糖與阿拉伯糖的峰高相差較大，葡萄糖含量很高，而阿拉伯糖含量相對較少，兩者的峰面積比在15∶1左右；在產(chǎn)品D、F、G和I中，檢測到葡萄糖和阿拉伯糖的峰都很小，所含葡萄糖的量很少，兩者的峰面積比為(3.34—1.75)∶1。

1:葡萄糖Glucose 2:阿拉伯糖Arabinose

表3 9批黃芪多糖產(chǎn)品水解后各單糖含量，葡萄糖與阿拉伯糖峰面積比

3 討論

3.1 黃芪多糖產(chǎn)品外觀性狀的比較

李桂菊[3]和杜繼紅等[4]認(rèn)為：黃芪多糖外觀一般為淺黃色和淺棕色，純度較高的呈淡黃白色；具有吸濕性和掛壁現(xiàn)象，可溶解于水中，但溶解速度較慢，溶解后會產(chǎn)生泡沫。而質(zhì)量差的黃芪多糖顏色較深，溶解性不好，有很多沉淀，產(chǎn)泡較少。此外，黃芪多糖產(chǎn)品如果加入葡萄糖復(fù)合物、麥芽糖糊精復(fù)合物等會出現(xiàn)溶解速度加快的現(xiàn)象[3]。本實(shí)驗(yàn)通過對黃芪多糖產(chǎn)品外觀性狀的比較發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)品A、B為淡黃色，產(chǎn)品E為類白色，具有吸濕性和掛壁現(xiàn)象，溶解后產(chǎn)生氣泡，沉淀較少。產(chǎn)品C為黃褐色，最容易溶解且無氣泡產(chǎn)生。產(chǎn)品D、F、G和I則呈顏色較深、難溶解、沉淀多、氣泡少的特點(diǎn)。僅從外觀判斷，產(chǎn)品A、B、E這3個(gè)批次質(zhì)量較好，其余批次質(zhì)量較差。此方法簡便，但無法判斷產(chǎn)品的純度。

3.2 紫外分光光度法分析黃芪多糖產(chǎn)品

李桂菊[3]認(rèn)為，黃芪多糖以葡萄糖計(jì)，口服液級應(yīng)不低于65%，針用級應(yīng)不低于70%。而杜繼紅等[4]認(rèn)為，就目前最佳技術(shù)條件而言，動(dòng)物保健品行業(yè)中唯一取得黃芪多糖新藥證書的產(chǎn)品——黃芪多糖粉中多糖含量不超過70%，市場上出現(xiàn)的含量80%—98%的黃芪多糖產(chǎn)品基本是在黃芪多糖里面加葡萄糖的假冒偽劣產(chǎn)品。本研究通過紫外分光光度法檢測總多糖含量，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品A、B、C、E和H的總多糖含量大于60%，其中產(chǎn)品C和H的總多糖含量大于90%，其余產(chǎn)品的總多糖含量為14%—29%。紫外分光光度法是以葡萄糖為對照品進(jìn)行含量測定，可以判斷質(zhì)量較差的產(chǎn)品(如產(chǎn)品D、F、G和I總多糖含量低于30%)，但是無法對摻假(加入葡萄糖和麥芽糖)的產(chǎn)品進(jìn)行鑒別。因此，僅僅從外觀性狀和紫外分光光度法測總多糖含量鑒別黃芪產(chǎn)品的質(zhì)量顯然不夠全面。

3.3 HPLC示差法測定黃芪多糖產(chǎn)品

黃芪多糖是從黃芪中提取出來的，由于黃芪品種、產(chǎn)地不同，黃芪多糖的單糖組成和比例都有差別。陳虎虎等[11]用柱前衍生化-高效液相色譜法測定蒙古黃芪多糖中單糖的組成，發(fā)現(xiàn)其水解后主要有阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖，含量比分別為1∶0.94∶5.56。王趙等[14]對注射用黃芪多糖單糖組分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其單糖主要由阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖組成，峰面積比為1∶0.429∶8.430。HPLC示差法不需要衍生化，水解處理后就可以分析單糖的組成。本研究通過測定發(fā)現(xiàn)黃芪多糖的單糖主要組成是阿拉伯糖和葡萄糖，其中產(chǎn)品A、B和E中，阿拉伯糖和葡萄糖的峰面積比接近1∶5，這些產(chǎn)品的單糖組成與文獻(xiàn)結(jié)果[11,14]相近。姚丹等[7]用氣相色譜分析黃芪多糖單糖組分，測定阿拉伯糖-果糖-葡萄糖-甘露糖的摩爾構(gòu)成比例為1.00∶10.30∶24.60∶0.46，本研究產(chǎn)品C和H的測定結(jié)果接近這個(gè)比值。而產(chǎn)品D、F、G和I的阿拉伯糖和葡萄糖峰面積比為1∶(1.75—3.34)，與文獻(xiàn)[7,11,14]報(bào)道的結(jié)果相差較遠(yuǎn)。

4 結(jié)論

本研究采用紫外分光光度法測定各批次黃芪多糖總多糖含量，用物理方法觀察黃芪外觀性狀，用高效液相色譜示差折光法分析黃芪多糖的單糖組成及含量，同時(shí)對黃芪多糖產(chǎn)品進(jìn)行鑒定，能客觀準(zhǔn)確地反映出產(chǎn)品的質(zhì)量。通過對9批黃芪多糖產(chǎn)品的檢測后認(rèn)為：黃芪多糖產(chǎn)品中，顏色較淺、溶解速度慢、可產(chǎn)大量的泡沫、總多糖含量為0.60—0.75 g/g、單糖的主要成分是葡萄糖和阿拉伯糖、峰面積比為(4—7)∶1的產(chǎn)品，是質(zhì)量比較優(yōu)的產(chǎn)品，如產(chǎn)品A、B和E。總多糖含量很高(大于0.90 g/g)、溶解速度很快、產(chǎn)泡不多、葡萄糖與阿拉伯糖的峰面積比偏大(15∶1)的產(chǎn)品，則摻入了葡萄糖復(fù)合物等其他東西，產(chǎn)品質(zhì)量不太好，如C和H產(chǎn)品。對于那些顏色深、起泡少、總多糖和單糖含量都很低的產(chǎn)品，其質(zhì)量很差，如產(chǎn)品D、F、G和I。本方法簡便、快速，且更全面地評價(jià)了各黃芪多糖產(chǎn)品的質(zhì)量，可為鑒別黃芪多糖產(chǎn)品品質(zhì)提供參考。