1-脫氧野尻霉素對(duì)肥胖小鼠肝細(xì)胞線(xiàn)粒體合成與自噬能力的改善作用

李思遠(yuǎn)，寧俊麗，丁曉雯，黃先智

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.西南大學(xué) 家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716）

肥胖是一種由多種因素導(dǎo)致的全球性慢性疾病，常起因于能量攝入與消耗失衡，給機(jī)體帶來(lái)炎癥、氧化應(yīng)激、線(xiàn)粒體功能障礙等不利影響，同時(shí)也是糖尿病、心血管疾病等的主要風(fēng)險(xiǎn)因素，已被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為影響人類(lèi)健康的五大危險(xiǎn)因素之一[1-4]。

線(xiàn)粒體在能量代謝過(guò)程中發(fā)揮十分重要的作用，可通過(guò)脂肪酸β氧化促進(jìn)機(jī)體脂代謝以維持能量平衡[5]。在正常情況下機(jī)體內(nèi)健康線(xiàn)粒體的數(shù)量通過(guò)新線(xiàn)粒體的合成及衰老、損傷線(xiàn)粒體的自噬作用保持?jǐn)?shù)量上的動(dòng)態(tài)平衡，而在肥胖條件下，這種平衡被打破，線(xiàn)粒體的合成及自噬能力均受到抑制[6-8]，導(dǎo)致新線(xiàn)粒體合成減少，衰老、損傷線(xiàn)粒體增加，脂肪酸氧化能力下降。Flamment等[9]的研究表明，高脂飲食導(dǎo)致小鼠肝臟線(xiàn)粒體生物合成關(guān)鍵調(diào)控因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活劑1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator-1α，

PGC-1α）mRNA表達(dá)下調(diào)，抑制線(xiàn)粒體合成。Ha等[10]發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠肝臟中PGC-1α及其下游基因核呼吸因子1（nuclear respiratory factor 1，Nrf1）mRNA表達(dá)下調(diào)，同時(shí)，線(xiàn)粒體中脂肪酸β氧化關(guān)鍵酶——肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1（carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1）的mRNA表達(dá)也顯著下調(diào)，認(rèn)為肥胖影響機(jī)體對(duì)線(xiàn)粒體的合成能力，同時(shí)降低線(xiàn)粒體對(duì)脂肪酸的代謝能力。此外，肥胖還通過(guò)影響線(xiàn)粒體自噬關(guān)鍵蛋白u(yù)nc-51樣激酶1（unc-51 like kinase 1，ULK1）抑制衰老損傷線(xiàn)粒體的自噬[11]。鑒于線(xiàn)粒體在脂代謝方面的重要作用，提高肥胖個(gè)體的線(xiàn)粒體生物合成與自噬能力對(duì)于肥胖的改善甚至治療具有重要意義。

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是一種主要從植物桑中分離得到的哌啶類(lèi)生物堿，目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其具有降糖、降脂、抗腫瘤、抗病毒等生理活性[12-14]。在脂代謝方面，本團(tuán)隊(duì)前期的研究發(fā)現(xiàn)DNJ降脂機(jī)理主要為調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)酶活性，抑制脂肪酸合成，促進(jìn)脂肪酸β氧化[15]。肝臟在脂代謝過(guò)程中扮演重要角色，線(xiàn)粒體是脂肪酸β氧化的重要場(chǎng)所，本實(shí)驗(yàn)以高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠為實(shí)驗(yàn)材料，研究DNJ對(duì)肥胖小鼠肝臟細(xì)胞線(xiàn)粒體生物合成與自噬的影響，進(jìn)一步探究其減肥機(jī)制，為后續(xù)更深入研究DNJ對(duì)肥胖小鼠線(xiàn)粒體的影響以及DNJ相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

140 只4 周齡清潔級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（渝）2018-003，購(gòu)于重慶恩斯維爾生物科技有限公司。

基礎(chǔ)飼料購(gòu)于重慶恩斯維爾生物科技有限公司；高脂飼料為實(shí)驗(yàn)室自行配制[16-17]，含基礎(chǔ)飼料78.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、豬油10%、蛋黃粉10%、膽固醇1%、膽酸鈉0.2%。

DNJ（純度≥98%） 南京道斯夫生物技術(shù)有限公司；脂聯(lián)素測(cè)定試劑盒、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21）測(cè)定試劑盒、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）測(cè)定試劑盒廈門(mén)慧嘉生物技術(shù)公司；白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）測(cè)定試劑盒、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）測(cè)定試劑盒、PGC-1α蛋白水平測(cè)定試劑盒、Nrf1蛋白水平測(cè)定試劑盒、ULK1蛋白水平測(cè)定試劑盒、CPT1活性測(cè)定試劑盒 上海優(yōu)選生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸法總蛋白測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒 北京百泰克生物技術(shù)公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）SYBR Green染料試劑盒 上海翊圣生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R型臺(tái)式冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；EPOCH2型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)基因公司；QTOWER 3G qPCR儀 德國(guó)耶拿分析儀器公司；FM200型勻漿機(jī) 上海弗魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 DNJ灌胃液的配制

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果，將DNJ用生理鹽水溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.8 mg/mL的DNJ溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 肥胖小鼠模型的建立

140 只4 周齡昆明種小鼠（雌雄各半），適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)挑選20 只（雌雄各10 只）作為對(duì)照組，繼續(xù)飼喂基礎(chǔ)飼料；其余120 只作為造模組飼喂高脂飼料6 周，根據(jù)下式計(jì)算肥胖度。肥胖度大于20%認(rèn)為造模成功[18]。

1.3.3 動(dòng)物分組及飼養(yǎng)

隨機(jī)選擇造模成功的肥胖小鼠80 只（雌雄各半）分為4 組（每組20 只，雌雄各半），分別為肥胖對(duì)照組（飼喂高脂飼料，灌胃生理鹽水）和DNJ高、中、低劑量組（飼喂高脂飼料，同時(shí)分別以8.0、4.0、2.0 mg/（kgmb·d）劑量灌胃DNJ），以1.3.2節(jié)中的對(duì)照組作為正常對(duì)照組（飼喂基礎(chǔ)飼料，灌胃生理鹽水）。各組每天灌胃1 次，持續(xù)灌胃45 d。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由攝食、飲水，每5 d稱(chēng)1 次體質(zhì)量。控制室溫（22±2）℃，相對(duì)濕度（50±15）%，12 h輪換照明（8∶00～20∶00）。

1.3.4 樣本采集及指標(biāo)測(cè)定

各組小鼠灌胃到第45天，禁食不禁水12 h，稱(chēng)量體質(zhì)量后眼球取血于真空采血管中，室溫放置1 h后，于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離上清液即為血清[19]，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｑ逯?lián)素、FGF21、TNF-α、IL-6、iNOS水平嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟測(cè)定。

取肝臟稱(chēng)質(zhì)量后迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中漂洗去除表面血污，取出，吸干表面水分，稱(chēng)取部分肝臟，按照1∶9（m/V）加入磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）于冰上進(jìn)行勻漿，于4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液，得質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%肝勻漿，-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法測(cè)定肝臟組織總蛋白、PGC-1α、Nrf1、ULK1蛋白水平以及CPT1活力。

1.3.5 肝臟總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

按照試劑盒方法提取肝組織RNA，測(cè)定A260nm/A280nm檢測(cè)其純度，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)察條帶檢測(cè)其質(zhì)量，之后按照試劑盒方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.6 qPCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系按照SYBR Green染料說(shuō)明書(shū)操作配制，擴(kuò)增程序：預(yù)變性95 ℃，5 min；變性95 ℃、10 s，退火55～60 ℃、20 s，延伸72 ℃、20 s，40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后根據(jù)熔解曲線(xiàn)評(píng)估引物特異性，根據(jù)擴(kuò)增Ct值計(jì)算2－ΔΔCt得到mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1?；?正向引物（5’-3’） 反向引物（5’-3’）

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for quantitative real-time polymerase chain reaction

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 DNJ對(duì)肥胖小鼠體質(zhì)量的影響

體質(zhì)量的增加是肥胖的外在體現(xiàn)，機(jī)體攝入的能量過(guò)多時(shí)，多余能量便以脂肪的形式儲(chǔ)存，導(dǎo)致體質(zhì)量的增加，控制體質(zhì)量的增加是防止或者緩解肥胖的重要方式。

表2 DNJ對(duì)肥胖小鼠體質(zhì)量的影響（n＝10）Table 2 Effect of DNJ on body mass in obese mice (n= 10)

由表2可知，DNJ各劑量組雌、雄鼠初始體質(zhì)量與肥胖對(duì)照組雌、雄鼠初始體質(zhì)量之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），且均高出正常對(duì)照組體質(zhì)量20%（P＜0.05）以上，表明肥胖模型造模成功。灌胃結(jié)束后，肥胖對(duì)照組雌、雄鼠體質(zhì)量顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），而經(jīng)過(guò)低、中、高劑量DNJ干預(yù)的雌、雄鼠體質(zhì)量雖然仍顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），但同時(shí)分別低于肥胖對(duì)照組體質(zhì)量9.27%、9.08%、10.99%（P＜0.05）和7.20%、6.34%、10.19%（P＜0.05）。表明在實(shí)驗(yàn)劑量范圍的DNJ能夠緩解高脂飲食引起的肥胖小鼠體質(zhì)量增加，維持體質(zhì)量穩(wěn)定，但在實(shí)驗(yàn)的時(shí)間范圍內(nèi)并不能使之恢復(fù)到正常水平。

2.2 DNJ對(duì)肥胖小鼠血清脂聯(lián)素及FGF21的影響

脂聯(lián)素是一種由脂肪組織分泌的細(xì)胞因子，具有促進(jìn)線(xiàn)粒體合成、改善脂代謝的功能[20-21]；FGF21主要在肝臟表達(dá)，其主要作用是促進(jìn)糖、脂分解代謝，維持能量平衡，同時(shí)還有研究發(fā)現(xiàn)其能通過(guò)調(diào)節(jié)PGC-1α促進(jìn)線(xiàn)粒體合成[22-23]。

表3 DNJ對(duì)肥胖小鼠脂聯(lián)素及FGF21質(zhì)量濃度的影響（n＝10）Table 3 Effect of DNJ on adiponectin and FGF21 level in obese mice (n= 10)

如表3所示，與正常對(duì)照組比較，肥胖對(duì)照組雌、雄小鼠脂聯(lián)素水平分別下降33.01%、32.35%（P＜0.01），表明肥胖導(dǎo)致脂聯(lián)素分泌下降，影響機(jī)體脂代謝。與肥胖對(duì)照組相比，中、高劑量DNJ的干預(yù)分別使雌鼠脂聯(lián)素水平上升22.58%、43.19%（P＜0.01），具有明顯的量效關(guān)系且高劑量組脂聯(lián)素水平恢復(fù)到正常水平（P＞0.05）；中、高劑量組雄鼠脂聯(lián)素水平分別上升25.87%、29.58%（P＜0.01），均未恢復(fù)至正常水平（P＜0.05）；低劑量DNJ對(duì)雌、雄鼠脂聯(lián)素水平均無(wú)顯著影響。

與正常對(duì)照組比較，肥胖對(duì)照組雌鼠的FGF21水平下降35.02%（P＜0.01），表明肥胖同樣導(dǎo)致雌鼠FGF21的分泌下降。與肥胖對(duì)照組比較，低、中、高劑量DNJ干預(yù)使雌鼠FGF21水平分別上升16.04%（P＜0.05）、26.28%（P＜0.01）、37.03%（P＜0.01），均未恢復(fù)至正常水平（P＜0.05）；與此不同的是，雄鼠肥胖對(duì)照組的FGF21水平相比正常對(duì)照組上升32.98%（P＜0.01），可能發(fā)生FGF21抵抗現(xiàn)象，與肥胖對(duì)照組相比，中、高劑量DNJ干預(yù)使雄鼠FGF21水平分別下降10.94%（P＜0.05）、21.07%（P＜0.01），且高劑量組恢復(fù)至正常水平（P＞0.05），而低劑量DNJ對(duì)雄鼠FGF21的影響不顯著（P＞0.05）。

2.3 DNJ對(duì)肥胖小鼠血清TNF-α、IL-6、iNOS的影響

肥胖通常會(huì)導(dǎo)致TNF-α、IL-6、iNOS等炎性因子水平升高，使機(jī)體處于慢性低度炎癥狀態(tài)，進(jìn)一步引發(fā)糖尿病、心血管疾病甚至癌癥[24-26]；另有研究表明，炎性因子水平的升高能夠抑制線(xiàn)粒體的生物合成[27-28]。

圖1 DNJ對(duì)肥胖小鼠血清炎性因子質(zhì)量濃度的影響Fig. 1 Effects of DNJ on serum inflammatory factors level in obese mice

如圖1 A 所示，相比正常對(duì)照組，肥胖對(duì)照組雌、雄鼠血清TNF-α水平分別上升53.03%、79.79%（P＜0.01）；相比肥胖對(duì)照組，低、中、高劑量DNJ使雌鼠TNF-α水平下降18.73%、18.29%（P＜0.05）和29.06%（P＜0.01），其中高劑量組恢復(fù)至正常水平（P＞0.05），各劑量之間量效關(guān)系不顯著；低、中、高劑量DNJ使雄鼠TNF-α水平下降17.90%、16.32%、30.84%（P＜0.01），其中高劑量DNJ效果較好。

如圖1 B 所示，與正常對(duì)照組相比，肥胖對(duì)照組雌、雄鼠血清IL-6水平分別上升40.87%、38.29%（P＜0.01）；與肥胖對(duì)照組相比，低、中、高劑量的DNJ使雌鼠IL-6水平分別下降11.50%、18.12%、25.72%（P＜0.01），高劑量組恢復(fù)至正常組水平（P＞0.05）；中、高劑量DNJ使雄鼠中IL-6水平分別下降16.80%（P＜0.05）、37.80%（P＜0.01），具有明顯的量效關(guān)系，且均恢復(fù)至正常組水平（P＞0.05），但低劑量DNJ對(duì)雄鼠IL-6無(wú)顯著影響。

如圖1C所示，與正常對(duì)照組比較，肥胖對(duì)照組雌、雄鼠血清iNos質(zhì)量濃度分別上升71.49%、61.44%（P＜0.01）；與肥胖對(duì)照組相比，中、高劑量DNJ使雌鼠iNOS水平分別下降21.10%、28.32%（P＜0.01）；低、中、高劑量D N J 能使雄鼠i N O S 水平分別下降16.08%、21.59%、29.01%（P＜0.01），但均未恢復(fù)至正常水平（P＜0.05）。

以上結(jié)果表明，肥胖可使機(jī)體處于炎癥狀態(tài)，而一定劑量DNJ的干預(yù)可以改善肥胖所導(dǎo)致的炎癥程度。

2.4 DNJ對(duì)肥胖小鼠肝細(xì)胞線(xiàn)粒體合成與自噬能力的影響

肝臟脂代謝的異常涉及諸多疾病，如肥胖、非酒精性脂肪肝及糖尿病等，線(xiàn)粒體是重要的能量代謝場(chǎng)所，對(duì)于脂肪酸的代謝至關(guān)重要[29]，因此，維持肝臟健康線(xiàn)粒體的數(shù)目對(duì)于肥胖及其并發(fā)癥的改善具有重要意義。

2.4.1 DNJ對(duì)肥胖小鼠肝細(xì)胞線(xiàn)粒體生物合成的影響

PGC-1α是一種重要的線(xiàn)粒體生物合成調(diào)控因子，可促進(jìn)另一種轉(zhuǎn)錄因子Nrf1的表達(dá)，調(diào)控線(xiàn)粒體DNA復(fù)制，促進(jìn)線(xiàn)粒體生物合成[30]。

圖2 DNJ對(duì)肥胖小鼠肝臟PGC-1α mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig. 2 Effects of DNJ on peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator-1α mRNA and protein expression levels in liver of obese mice

如圖2A、B所示，與正常對(duì)照組相比，肥胖對(duì)照組雌、雄鼠PGC-1α mRNA相對(duì)表達(dá)分別下調(diào)30.97%、41.16%（P＜0.01），蛋白水平分別下降31.71%、28.77%（P＜0.01）。相比肥胖對(duì)照組，中、高劑量的DNJ能夠使雌鼠PGC-1α mRNA相對(duì)表達(dá)上調(diào)24.07%（P＜0.05）、33.37%（P＜0.01），PGC-1α蛋白水平上升24.82%、28.27%（P＜0.01），低劑量組的PGC-1α mRNA相對(duì)表達(dá)及蛋白水平無(wú)顯著變化；低、中、高劑量DNJ使雄鼠的PGC-1α mRNA相對(duì)表達(dá)分別上調(diào)71.95%、78.54%、108.76%（P＜0.01），其中低、中劑量恢復(fù)至正常（P＞0.05），高劑量組高于正常對(duì)照組（P＜0.05），蛋白水平分別上升18.02%、19.80%（P＜0.05）和43.99%（P＜0.01），高劑量組PGC-1α蛋白水平恢復(fù)至正常水平。DNJ對(duì)雌雄小鼠血清PGC-1α mRNA相對(duì)表達(dá)與蛋白水平的變化趨勢(shì)具有一致性。

圖3 DNJ對(duì)肥胖小鼠肝臟Nrf1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig. 3 Effects of DNJ on Nrf1 mRNA and protein expression levels in liver of obese mice

如圖3A、B所示，與正常對(duì)照組相比，肥胖對(duì)照組雌、雄鼠Nrf1 mRNA相對(duì)表達(dá)分別下調(diào)43.70%、50.18%（P＜0.01），蛋白水平下降41.78%、29.49%（P＜0.01）。相比肥胖對(duì)照組，低、中、高劑量DNJ使雌鼠Nrf1 mRNA相對(duì)表達(dá)分別上調(diào)45.55%、45.21%、70.00%（P＜0.01），高劑量組mRNA相對(duì)表達(dá)恢復(fù)至正常水平，Nrf1蛋白水平分別上升27.42%、36.15%、50.25%（P＜0.01），均未恢復(fù)至正常；中、高劑量DNJ使雄鼠Nrf1 mRNA相對(duì)表達(dá)分別上調(diào)54.13%、67.91%（P＜0.01），Nrf1蛋白水平分別上升20.31%（P＜0.05）、40.26%（P＜0.01），低劑量組mRNA相對(duì)表達(dá)及蛋白水平均無(wú)顯著變化，高劑量組Nrf1蛋白水平恢復(fù)到正常水平。DNJ對(duì)雌雄小鼠肝細(xì)胞Nrf1的mRNA相對(duì)表達(dá)與蛋白水平變化的影響具有一致性。以上結(jié)果表明，肥胖可使線(xiàn)粒體生物合成關(guān)鍵蛋白的表達(dá)下降，DNJ的干預(yù)可改善這一不利影響，促進(jìn)線(xiàn)粒體合成，甚至可恢復(fù)到正常的合成水平。

2.4.2 DNJ對(duì)肥胖小鼠肝細(xì)胞線(xiàn)粒體自噬能力的影響

線(xiàn)粒體自噬是對(duì)衰老損傷線(xiàn)粒體的選擇性清除，對(duì)維持正常的能量代謝、防止細(xì)胞損傷至關(guān)重要[31]。

圖4 DNJ對(duì)肥胖小鼠肝臟ULK1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig. 4 Effects of DNJ on unc-51 like kinase 1 mRNA and protein expression levels in liver of obese mice

如圖4所示，與正常對(duì)照組相比，肥胖對(duì)照組雌、雄鼠ULK1的mRNA相對(duì)表達(dá)分別下調(diào)35.16%、49.29%（P＜0.01），蛋白水平下降26.78%、30.92%（P＜0.01），表明肥胖抑制了小鼠線(xiàn)粒體的自噬。相比肥胖對(duì)照組，高劑量DNJ能使雌鼠ULK1 mRNA相對(duì)表達(dá)上調(diào)27.71%（P＜0.05），蛋白水平上升19.24%（P＜0.05），低、中劑量的DNJ對(duì)雌鼠ULK1的mRNA相對(duì)表達(dá)及蛋白水平均無(wú)顯著影響；高劑量DNJ能使雄鼠mRNA相對(duì)表達(dá)上調(diào)47.59%（P＜0.01），蛋白水平上升22.76%（P＜0.05），同樣，低、中劑量的DNJ對(duì)雄鼠ULK1的mRNA相對(duì)表達(dá)及蛋白水平均無(wú)顯著影響。表明較高劑量的DNJ干預(yù)對(duì)肝細(xì)胞線(xiàn)粒體的自噬能力有一定的恢復(fù)作用，但不能使之恢復(fù)到正常水平。

2.4.3 DNJ對(duì)肥胖小鼠肝細(xì)胞AMPK mRNA表達(dá)的影響

腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）是細(xì)胞內(nèi)重要的能量傳感器，涉及糖、脂代謝等諸多方面，對(duì)線(xiàn)粒體生物合成與自噬均具有調(diào)控作用[32]，其由3 種亞基組成，其中α亞基具有兩種亞型（AMPKα1與AMPKα2），起催化作用[33]。

如圖5所示，與正常對(duì)照組相比，肥胖導(dǎo)致雌、雄鼠AMPKα1 mRNA表達(dá)分別下調(diào)48.79%、49.88%（P＜0.01），AMPKα2 mRNA表達(dá)分別下調(diào)48.69%、48.23（P＜0.01）；相比肥胖對(duì)照組，中、高劑量的DNJ能使雌鼠AMPKα1 mRNA表達(dá)分別上調(diào)37.04%、60.33%（P＜0.01），使雄鼠AMPKα1 mRNA分別上調(diào)49.04%、50.68%（P＜0.01）；但各劑量DNJ均未對(duì)雌、雄鼠AMPKα2 mRNA表達(dá)產(chǎn)生顯著影響。

圖5 DNJ對(duì)肥胖小鼠肝臟AMPKα1及AMPKα2 mRNA表達(dá)的影響Fig. 5 Effects of DNJ on AMPKα1 and AMPKα2 mRNA expression in liver of obese mice

2.5 DNJ對(duì)肥胖小鼠肝細(xì)胞CPT1活性的影響

CPT1是脂肪酸β氧化過(guò)程中的限速酶，位于線(xiàn)粒體外膜，其主要作用是轉(zhuǎn)運(yùn)脂酰CoA進(jìn)入線(xiàn)粒體[34]。

圖6 DNJ對(duì)肥胖小鼠肝臟CPT1活力的影響Fig. 6 Effect of DNJ on carnitine palmitoyltransferase 1 activity in liver of obese mice

如圖6所示，與正常對(duì)照組相比，肥胖對(duì)照組雌、雄鼠CPT1活力分別下降44.76%、35.52%（P＜0.01），表明肥胖個(gè)體脂肪酸分解代謝下降。相比肥胖對(duì)照組，中、高劑量的DNJ使雌鼠CPT1活力分別上升49.77%、58.05%（P＜0.01），使雄鼠的CPT1活力上升21.39%（P＜0.05）、49.60%（P＜0.01），其中高劑量組雄鼠CPT1活力恢復(fù)至正常水平（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，一定劑量的DNJ干預(yù)能夠促進(jìn)肥胖小鼠脂肪酸分解，達(dá)到降脂的目的。

3 討 論

肥胖是一種能量失衡導(dǎo)致的慢性疾病，同時(shí)也是心血管疾病、2型糖尿病、癌癥等疾病的主要風(fēng)險(xiǎn)因素[35]。已有大量研究證實(shí)了DNJ在促進(jìn)脂代謝、緩解肥胖方面的作用，如李有貴等[36]以50 mg/kg mb劑量桑葉DNJ灌胃高脂血癥模型小鼠90 d，結(jié)果表明小鼠血清TC、TG水平逐漸恢復(fù)至正常水平。Tsuduki等[37]以高脂飼料飼喂大鼠，同時(shí)以1 mg/kg mb劑量灌胃DNJ 4 周，結(jié)果表明DNJ能夠通過(guò)激活脂肪酸β氧化促進(jìn)脂代謝，降低機(jī)體脂肪積蓄。在后續(xù)的研究中，Tsuduki等[38]通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DNJ通過(guò)改善肥胖小鼠脂聯(lián)素水平達(dá)到促進(jìn)脂代謝的目的。本研究同樣顯示DNJ對(duì)肥胖小鼠脂聯(lián)素具有改善作用，考慮到FGF21-脂聯(lián)素軸在脂代謝中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)GF21能夠促進(jìn)脂聯(lián)素合成及分泌[39]，因此對(duì)FGF21水平進(jìn)行測(cè)定但在不同性別小鼠中觀(guān)察到不同的結(jié)果，在雌性肥胖對(duì)照組小鼠中表現(xiàn)為FGF21水平下降，可能是合成及分泌不足導(dǎo)致，而在雄性肥胖對(duì)照組小鼠中則表現(xiàn)為FGF21水平顯著升高，這與Chukijrungroat等[40]研究結(jié)果相一致，推測(cè)為FGF21抵抗現(xiàn)象，DNJ干預(yù)后，雌鼠FGF21合成分泌增加，雄鼠FGF21抵抗現(xiàn)象得到改善，造成這種性別差異的具體原因有待進(jìn)一步研究。AMPK是體內(nèi)重要的能量傳感器，對(duì)能量代謝的平衡至關(guān)重要，F(xiàn)GF21與脂聯(lián)素均可通過(guò)AMPK途徑調(diào)控PGC-1α表達(dá)，促進(jìn)線(xiàn)粒體合成[41-42]。肥胖個(gè)體線(xiàn)粒體通過(guò)能量代謝產(chǎn)生大量的ROS會(huì)對(duì)線(xiàn)粒體本身造成損傷，導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能紊亂，對(duì)這些損傷線(xiàn)粒體的清除是十分有必要的，AMPK除促進(jìn)線(xiàn)粒體合成外，還可通過(guò)磷酸化激活ULK1，促進(jìn)損傷線(xiàn)粒體自噬，維持健康線(xiàn)粒體數(shù)量[43-44]。在本研究中，肥胖對(duì)照組PGC-1α、Nrf1以及ULK1表達(dá)顯著下降，45 d的DNJ干預(yù)可以改善這一狀況同時(shí)上調(diào)AMPKα1表達(dá)，表明DNJ可能通過(guò)改善FGF21與脂聯(lián)素水平調(diào)節(jié)AMPK，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)肥胖小鼠線(xiàn)粒體生物合成與自噬的改善作用，但DNJ對(duì)AMPKα2的表達(dá)卻未有顯著影響。AMPK可磷酸化脂肪酸合成限速酶乙酰輔酶A羧化酶1（acetyl-CoA carboxylase 1，ACC1），使之活性下降，抑制脂肪酸合成，同時(shí)還可通過(guò)磷酸化ACC2提高CPT1活性，促進(jìn)脂肪酸氧化[45]，本研究的結(jié)果表明，肥胖小鼠經(jīng)DNJ灌胃后，CPT1活性上升，可能與DNJ上調(diào)AMPKα1表達(dá)有關(guān)。

肥胖通常伴隨著TNF-α、IL-6、iNOS等炎性因子水平顯著升高，使機(jī)體處于慢性低度炎癥狀態(tài)，慢性低度炎癥與胰島素抵抗、糖尿病、心血管疾病的發(fā)展密切相關(guān)[46]，還有研究發(fā)現(xiàn)這些炎性因子不僅會(huì)下調(diào)PGC-1α表達(dá)，抑制線(xiàn)粒體合成[27-28]，還會(huì)導(dǎo)致FGF21活性功能下降，抑制脂聯(lián)素分泌[47-48]，在本研究中，肥胖對(duì)照組血清TNF-α、IL-6、iNOS水平顯著升高，經(jīng)過(guò)DNJ干預(yù)后，炎性因子水平均得到不同程度改善，與Zheng Junping等[49]研究結(jié)果相一致，表明DNJ具有抗炎作用。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀(guān)察到DNJ對(duì)不同性別肥胖小鼠的改善作用具有性別差異。對(duì)于線(xiàn)粒體生物合成的轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α和Nrf1，經(jīng)高劑量DNJ灌胃45 d后，雄鼠PGC-1α和Nrf1蛋白水平均已恢復(fù)至正常水平，同劑量灌胃的雌鼠卻仍與正常對(duì)照組存在顯著差異，暗示DNJ對(duì)雄性肥胖小鼠線(xiàn)粒體合成的促進(jìn)作用優(yōu)于雌鼠；在對(duì)肥胖小鼠炎癥的改善作用中，中劑量的DNJ便使雄鼠IL-6恢復(fù)至正常水平，雌鼠則需要高劑量，另一方面，高劑量DNJ使雌鼠TNF-α水平恢復(fù)至正常，而雄鼠則仍顯著高于正常對(duì)照組。造成這些差異的原因有待進(jìn)一步研究，這些差異也暗示了當(dāng)使用DNJ時(shí)，應(yīng)考慮性別差異予以劑量上的調(diào)整。此外，DNJ對(duì)線(xiàn)粒體合成與自噬的其他影響途徑還需要更深入的研究。

DNJ可能通過(guò)降低肥胖小鼠炎癥程度，改善FGF21與脂聯(lián)素水平，進(jìn)一步上調(diào)AMPKα1表達(dá)，促進(jìn)肥胖小鼠肝臟線(xiàn)粒體生物合成與自噬，同時(shí)使線(xiàn)粒體脂肪酸氧化限速酶CPT1活性上升，促進(jìn)脂肪酸分解，達(dá)到降脂的目的。