防己配方顆粒質(zhì)量標準研究

張彩虹，胡昌江，班朝旭，黃美華，張開元，張 晨，陳 蓉

(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司 國家中醫(yī)藥管理局“中藥配方顆粒質(zhì)量與療效評價”重點實驗室，四川 成都 611900)

防己為防己科植物粉防己StephaniatetrandraS.Moore的干燥根，具有祛風止痛、利水消腫的功效，主要用于治療風濕痹痛、水腫腳氣、小便不利、濕疹瘡毒等證[1]。防己配方顆粒是用符合炮制規(guī)范的傳統(tǒng)防己飲片作為原料，經(jīng)現(xiàn)代制藥技術(shù)提取、濃縮、分離、干燥、制粒、包裝精制而成的純中藥顆粒劑，具有不用煎煮、容易調(diào)配、方便攜帶、一沖即服的特點，臨床要求其要具有與中藥飲片相同的功效[2-3]。將中藥飲片制成中藥配方顆粒后失去了原飲片的性狀鑒別特征[4]，為了控制中藥配方顆粒質(zhì)量，本研究采用薄層色譜法和高效液相色譜法建立了以對照藥材為隨行對照的特征圖譜和薄層鑒別，對防己配方顆粒進行了多成分、全面的定性鑒別，為健全防己配方顆粒質(zhì)量控制評價體系提供技術(shù)支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀：島津LC-2040C型高效液相色譜儀、島津LC-20AT型高效液相色譜儀、Agilent1260型高效液相色譜儀；電子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多儀器有限公司)；超純水機：細胞型1810A(上海摩勒科學儀器有限公司)；超聲波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋：DZKW-4型(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

色譜柱：Kromasil 100-5-C18(4.6 mm×250 mm)、Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm)、Inertsustain C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)。半自動薄層點樣儀：CAMAG Lionmat-5；薄層成像系統(tǒng)：CAMAG TLC Visualizer。

1.2 試劑及材料

乙腈、甲醇、磷酸、三乙胺為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。粉防己堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110711-201609，純度99.2%)；防己諾林堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110793-201606，純度98.8%)；防己對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：121279-201502)；防己配方顆粒(批號：SY1803001、SY1803002、SY1804001，四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.2 方法學考察 (1)專屬性考察。按照擬定的薄層鑒別方法，制備空白溶液，取空白溶液、對照品溶液、對照藥材溶液、供試品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，展開，取出，晾干，置紫外燈下(254 nm)檢視。結(jié)果見圖1。

注：從左至右依次為：空白對照；粉防己堿、防己諾林堿混合對照品；防己對照藥材；防己配方顆粒(SY1803001)；防己配方顆粒(SY1803001)；防己配方顆粒(SY1803001)。

(2)點樣量考察。按照擬定的薄層鑒別方法，取對照品溶液10 μL、對照藥材溶液10 μL，供試品溶液2 μL、5 μL、8 μL、10 μL、12 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，展開，取出，晾干，置紫外燈下(254 nm)檢視。結(jié)果見圖2。

注：從左至右依次為粉防己堿、防己諾林堿混合對照品；防己對照藥材；2 μL防己配方顆粒(SY1803001)；5 μL防己配方顆粒(SY1803001)；8 μL防己配方顆粒(SY1803001)；10 μL防己配方顆粒(SY1803001)。

由供試品溶液不同點樣量的薄層色譜可知，點樣10 μL時主斑點較清晰，且分離度較好，故確定本品供試品溶液的點樣量為10 μL。

(3)耐用性的考察。不同薄層板比較：選取青島海洋化工廠分廠預(yù)制硅膠GF254板、天津思利達科技有限公司可剪裁型薄層層析板(硅膠GF254板)，分別按擬定的試驗方法試驗。結(jié)果見圖3、圖4。

分析比較不同薄層板展開的薄層色譜，結(jié)果表明在已選定的薄層色譜條件下，不同薄層板均能達到鑒別目的。

不同溫度的比較：取點樣后的薄層板，分別在低溫4 ℃和常溫25 ℃的溫度環(huán)境下展開。結(jié)果見圖5、圖6。結(jié)果表明，在4 ℃和25 ℃環(huán)境中展開的薄層色譜圖各主斑點清晰，且分離度較好，均可達到鑒別目的，故該薄層鑒別方法在4～25 ℃耐用性良好。

不同濕度的比較：取點樣后的薄層板，分別在32%和75%的濕度環(huán)境下展開。結(jié)果表明該方法對不同濕度的適應(yīng)性較好。見圖7、圖8。

5）本工程裙房縱向長度為52.60m，為減小溫度變化和混凝士收縮對結(jié)構(gòu)的影響，在結(jié)構(gòu)平面縱向中部增設(shè)混凝土膨脹加強帶，膨脹加強帶中混凝土強度等級與兩側(cè)相同，摻加適量的膨脹劑，與兩側(cè)混凝土同時澆筑[2]。

由圖7、圖8可知，該薄層展開在相對濕度32%和75%環(huán)境中主斑點清晰，分離度好，故該法在相對濕度32%～75%環(huán)境中耐用性良好。

2.1.3 方法驗證 按上述方法分別對多批防己配方顆粒樣品進行薄層鑒別，實驗結(jié)果見圖9。

注：從左往右依次為：混合對照品(粉防己堿(上)、防己諾林堿(下)；防己對照藥材；防己配方顆粒SY1803001；防己配方顆粒SY1803002；防己配方顆粒SY1804001。

結(jié)果表明上述薄層鑒別方法能夠?qū)Ψ兰号浞筋w粒成品進行有效鑒別，耐用性良好，可用于防己配方顆粒質(zhì)量標準研究。

2.2 特征圖譜

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(柱長為250 mm，內(nèi)徑為4.6 mm，粒度為5 μm)；以0.2%磷酸溶液(含0.4%三乙胺)為流動相A，以乙腈為流動相B，按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長為282 nm。理論板數(shù)按防己諾林堿計算應(yīng)不低于4 000。

表1 流動相梯度

2.2.2 參照物溶液的制備 取防己對照藥材2.5 g，置具塞錐形瓶中，加水25 mL，密塞，超聲處理(功率600 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為對照藥材參照物溶液。另取粉防己堿對照品、防己諾林堿對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含粉防己堿0.1 mg、防己諾林堿0.05 mg的混合溶液，作為對照品參照物溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取防己配方顆粒約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率600 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 方法學考察 色譜峰指認。供試品溶液的制備：按以上擬定的實驗條件，制備防己配方顆粒供試品溶液。

對照品參照物溶液的制備：取粉防己堿對照品、防己諾林堿對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含粉防己堿0.1 mg、防己諾林堿0.05 mg的混合溶液，即得。

陰性對照溶液的制備：按以上擬定的實驗條件，制備缺防己配方顆粒陰性對照溶液。

對防己配方顆粒特征圖譜峰進行定位。見圖10。結(jié)果表明，峰3為防己諾林堿，峰4為粉防己堿。在以下方法學考察中，對樣品圖譜中的4個峰進行考察。

精密度試驗：取防己配方顆粒(批號：SY1803001)約0.5 g，精密稱定1份，按擬定實驗方法進行制備及測定，連續(xù)進樣6次，每次10 μL，進行測定。結(jié)果見表2、表3。

表2 精密度試驗-特征峰相對保留時間

圖10 防己配方顆粒特征圖譜色譜峰指認

表3 精密度試驗-特征峰相對峰面積

結(jié)果表明，各特征峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.12%，各特征峰相對峰面積的RSD為0.09%～1.19%，該儀器的精密度良好。

重復(fù)性考察。取防己配方顆粒(批號：SY1803001)約0.5 g，精密稱定6份，按擬定實驗方法進行制備及測定。見表4、表5。

表4 重復(fù)性考察—特征峰相對保留時間比值

表5 重復(fù)性考察—特征峰相對峰面積比值

結(jié)果表明，各特征峰相對保留時間的RSD為0.43%～1.18%，各特征峰相對峰面積的RSD為2.03%～8.89%，該方法重復(fù)性好。

中間精密度考察：不同制備人員和不同制備時間考察：在以上擬定的實驗條件基礎(chǔ)上，分別在不同人員(A、B)和不同時間(T1 、T2)條件下精密稱取防己配方顆粒(批號：SY1803001)約0.5 g，按擬定實驗方法進行制備及測定。結(jié)果見表6、表7。

表6 不同人員與時間考察—特征峰相對保留時間比值

表7 不同人員與時間考察—特征峰相對峰面積比值

結(jié)果表明，不同制備人員和不同制備時間條件下，各特征峰相對保留時間的RSD在0.55%～2.22%，各特征峰相對峰面積的RSD在0.29%～1.46%。

不同儀器考察：在以上擬定的實驗條件基礎(chǔ)上，精密稱取防己配方顆粒(批號：SY1803001)約0.5 g，制備供試品，分別在安捷倫1290、島津LC-2040C、島津LC-30AD型高效液相色譜儀上進行測定(色譜柱均為Eclipse Plus C185 μm，250 mm×4.6 mm)，計算所得結(jié)果，見圖11和表8、表9。

表8 不同儀器考察—特征峰相對保留時間比值

圖11 不同儀器考察

表9 不同儀器考察—特征峰相對峰面積比值

結(jié)果表明，用上述3種儀器對供試品進行檢測時，各特征峰相對保留時間的RSD在0.58%～1.55%，各特征峰相對峰面積的RSD在0.46%～0.99%。

耐用性考察：色譜柱耐用性考察：在以上擬定的實驗條件基礎(chǔ)上，分別對色譜柱為Eclipse Plus C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)、Kromasil 100-5-C18(250 mm×4.6 mm)、Inertsustain C18(5 μm，4.6 mm×250 mm時進行考察。見圖12和表10、表11。

圖12 防己配方顆粒色譜柱耐用性考察

表10 色譜柱耐用性考察—特征峰相對保留時間

表11 色譜柱耐用性考察—特征峰相對峰面積比值

結(jié)果表明，用上述3種色譜柱對樣品進行檢測，各特征峰相對保留時間的RSD為0.35%～3.26%，各特征峰相對峰面積的RSD為0.02%～0.10%。

24 h穩(wěn)定性考察：在以上擬定的實驗條件基礎(chǔ)上，取同一供試品溶液，分別于0 h、2.5 h、5 h、7.5 h、15 h、18 h、24 h時測定。見表12、表13。

結(jié)果表明，各特征峰保留時間的RSD在0.34%～1.97%，各特征峰峰面積的RSD為0.56%～6.43%。

2.2.5 測定 采用擬定的方法分別對3批防己配方顆粒進行測定，計算相對保留時間和相對峰面積。見圖13和表14、表15。

表12 24 h穩(wěn)定性考察—特征峰保留時間

表13 24 h穩(wěn)定性考察—特征峰峰面積比值

注：各圖譜代表批次為S1：SY1803001；S2：SY1803002；S3：SY1804001。

表14 3批防己配方顆粒相對保留時間

表15 3批防己配方顆粒相對峰面積

結(jié)果表明，3批次防己配方顆粒特征峰相對峰面積的RSD差異雖然不大，但方法學考察過程中相對峰面積RSD在0.09%～8.89%之間，較不穩(wěn)定，因此不納入質(zhì)量標準。3批次防己配方顆粒4個特征峰相對保留時間RSD基本為0，且方法學考察過程中相對保留時間RSD均小于4.0%，故將保留時間納入質(zhì)量標準中。最終規(guī)定：供試品特征圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)4個特征峰，其中與防己諾林堿參照物相應(yīng)的峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，其相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)。規(guī)定值為：0.432(峰1)、0.695(峰2)、1.000(峰3S)、1.179(峰4)。

本研究采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)對3批次防己配方顆粒進行合成，建立了防己配方顆粒特征圖譜的對照圖譜。見圖14。

注：峰3(S)：防己諾林堿；峰4：粉防己堿。

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別方法

現(xiàn)代研究表明防己活性成分主要為粉防己堿(C38H42N2O6)和防己諾林堿(C37H40N2O6)[5]。《中國藥典》2015年版一部“防己”項下針對此兩種活性成分對防己藥材進行了薄層色譜鑒別，薄層色譜顯示鑒別斑點僅有粉防己堿和防己諾林堿兩個，薄層色譜信息相對較少，專屬性低，容易出現(xiàn)用對照品替代樣品點樣的假陽性結(jié)果，且防己中防己諾林堿的含量較低，薄層色譜條件進行鑒別時，斑點拖尾嚴重而分散，從而低于稀碘化鉍鉀的顯色最低限度，造成防己樣品薄層色譜中的防己諾林堿斑點觀察不到而出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而展開劑中濃氨試液易揮發(fā)，展開劑飽和時間過短或過長均會產(chǎn)生嚴重邊緣效應(yīng)，影響鑒別效果。本研究在《中國藥典》2015年版防己薄層鑒別方法基礎(chǔ)上進行改進，對展開劑、顯色劑、供試品制備方法作了考察，最終優(yōu)選的防己配方顆粒薄層鑒別方法，具有直觀、承載信息量大、專屬性強、快速、經(jīng)濟、操作簡便等優(yōu)點，除了可以作為防己配方顆粒鑒別方法，還可以用于鑒別防己藥材、飲片及標準湯劑，可以避免現(xiàn)有檢測方法存在的不足，具有良好的應(yīng)用前景。

3.2 特征圖譜方法的建立

在質(zhì)量控制評價方面，現(xiàn)行的中藥配方顆粒質(zhì)量標準多采用對某有效成分進行含量測定，而中藥是多成分的整體作用，且由于中藥配方顆粒是經(jīng)過多工序加工而成，失去原有飲片的形態(tài)，在質(zhì)量控制上缺少飲片性狀等重要指標，僅靠某有效成分的含量測定無法全面反映配方顆粒質(zhì)量效果，因此在質(zhì)量控制標準制定中必須加強專屬性鑒別和整體性質(zhì)量控制[6-7]。本研究采用HPLC建立了防己配方顆粒特征圖譜方法，該方法操作簡便，穩(wěn)定性及重現(xiàn)性良好，能較全面地反映防己配方顆粒的化學成分系統(tǒng)，為防己配方顆粒的整體質(zhì)量評價提供了技術(shù)支撐。