疊鞘石斛葉黃酮類成分的“點(diǎn)-線-面”質(zhì)量分析*

阮沛樺，鄧紅，2，傅詠梅，張蜀，2，郭彩娥，林俊強(qiáng)，李志超

(1.廣東藥科大學(xué)廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)/廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣州 510006；3.國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，佛山 528000；4.廣東省清遠(yuǎn)市中醫(yī)院/廣東省鮮藥和民族醫(yī)藥工程技術(shù)研究中心，清遠(yuǎn) 511500)

疊鞘石斛[DendrobiumaurantiacumRchb.var.Denneanum( Kerr.) Z.H.Tsi.]被收載于2010年版《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[1]，是蘭科植物疊鞘石斛栽培品的新鮮或干燥莖，是四川省著名道地藥材嘉定石斛的主要品種，具地方特色，是我國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品，且在廣東、廣西、貴州、云南等地常作為石斛藥材臨床使用[2-3]。疊鞘石斛臨床上有滋陰除熱、養(yǎng)胃生津之功效，入選國(guó)家石斛林木種質(zhì)資源庫，但其生長(zhǎng)環(huán)境特殊，生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)期長(zhǎng)，繁育系數(shù)低，資源一旦被破壞將難以恢復(fù)[4]。近年來，隨著對(duì)石斛研究的深入，發(fā)現(xiàn)石斛中除多糖外[5]，黃酮類成分也是其另一重要活性部位，主要分布于葉內(nèi)[6]。國(guó)內(nèi)外研究仍主要集中在石斛莖的多糖成分上，葉的研究基礎(chǔ)相對(duì)薄弱。文獻(xiàn)報(bào)道石斛黃酮藥理作用明顯，尤其是其具有突出的抗氧化能力[7-11]。疊鞘石斛葉含黃酮類成分較高，對(duì)其進(jìn)行研究開發(fā)具有廣闊的前景，也有利于中藥資源的綜合利用與整合。筆者在本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)-二極管陣列檢測(cè)器(photo diode array，PDA)法建立10批疊鞘石斛葉指紋圖譜，并進(jìn)行分析比較，同時(shí)測(cè)定葉中芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁、總黃酮含量，由單成分的“點(diǎn)”、多成分的“線”，到指紋圖譜全成分的“面”，以期為疊鞘石斛葉含量控制提供依據(jù)，為黃酮類成分的含量測(cè)定提供新思路。

1 儀器與試藥

1.1儀器 AcQuity UPLC，配置PDA(美國(guó)Waters公司)；BSA224S-CW型電子分析天平(賽多利斯儀器北京有限公司，感量：0.1 mg)、CP2250型電子分析天平(賽多利斯儀器北京有限公司，感量：0.01 mg)；UV-1800紫外-可見分光光度儀(日本島津公司)；HK3300H超聲波清洗儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷對(duì)照品(含量：99.9%，批號(hào)：F0940192)、異夏佛塔苷對(duì)照品(含量：98.7%，批號(hào)：F0930336)均購自中山市成諾生物科技有限公司；蘆丁對(duì)照品(純度：97.5%，批號(hào)：110842-201709)購自中國(guó)食品藥品檢定研究院。疊鞘石斛葉[批次S1～S10(生長(zhǎng)年份)分別為云南181105(一年生)、云南190520(兩年生)、四川19041101(一年生)、四川19041102(一年生)、四川19041103(兩年生)、四川19041104(兩年生)、四川19041105(兩年生)、四川19041106(三年生)、四川19041107(四年生)、四川19041108(四年生)]，均由云南省文山壯族苗族自治州麻栗坡態(tài)合堂野生石斛保育有限公司提供，經(jīng)由廣東藥科大學(xué)/廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心中藥室何偉教授鑒定為正品。乙腈、甲醇、四氫呋喃、磷酸為色譜純。其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1三種單一成分及總黃酮成分含量測(cè)定方法

2.1.1色譜條件 AcQuity UPLC HSS T3 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；體積流量：0.3 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：337 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；流動(dòng)相A為四氫呋喃-乙腈-甲醇(10：22：5)；流動(dòng)相B為0.05%磷酸溶液，梯度洗脫(0～9 min，9%→10%A；9～10 min，10%→11%A；10～12 min，11%→11.5%A；12～13 min，11.5%→14.5%A；13～20 min，14.5%→15%A；20～25 min，15%A；25～60 min，15%→30%A；60～65 min，30%→9%A)。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備

2.1.2.1芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱取芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷10.00 mg，置10 mL量瓶，加甲醇制成每毫升含對(duì)照品1.000 mg的溶液。

2.1.2.2異夏佛塔苷對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱取異夏佛塔苷9.94 mg，置20 mL量瓶，加甲醇制成每毫升含對(duì)照品0.497 mg溶液。

2.1.2.3蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱取蘆丁9.96 mg，置20 mL量瓶，加甲醇制成每毫升含對(duì)照品0.498 mg溶液。

2.1.2.4混合對(duì)照品溶液 取芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇制成每毫升約含各對(duì)照品100 μg的溶液。

2.1.3供試品溶液的制備 精密稱取疊鞘石斛葉粉末0.1 g[過三號(hào)篩，篩孔內(nèi)徑(355±13) μm)]，置25 mL具塞錐形瓶，精密加入70%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min(頻率53 kHz，功率350 W)，放冷，70%甲醇補(bǔ)足損失質(zhì)量，濾過，即得。

所有患者術(shù)后72 h行顱腦增強(qiáng)MRI檢查腫瘤切除情況，根據(jù)Simpson分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到Ⅰ級(jí) 58例，Ⅱ級(jí)13例，Ⅲ級(jí)9例。術(shù)后送病理檢查均診斷為腦膜瘤，Ⅰ級(jí)良性腦膜瘤59例，Ⅱ級(jí)非典型性腦膜瘤21例。術(shù)后即時(shí)發(fā)現(xiàn)，8例多飲多尿者中6例癥狀緩解，2例無明顯改善；5例并發(fā)一過性尿崩；4例嗅覺減退；4例顱內(nèi)感染；1例腦脊液漏；1例出現(xiàn)高熱、血糖升高等嚴(yán)重下丘腦反應(yīng)而死亡；1例大量出血形成腦疝而死亡。隨訪2～7.5年，平均(5.4±1.4)年，56例視力不同程度的改善，21例無明顯變化，3例視力減退。11例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為13.8%，再次行手術(shù)治療。

2.1.4疊鞘石斛葉指紋圖譜的建立及黃酮色譜峰的確定 精密吸取各批次疊鞘石斛葉供試品溶液2 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，將圖譜導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2012A版)，見圖1，發(fā)現(xiàn)四川產(chǎn)地樣品成分較云南產(chǎn)地樣品成分多。以S1樣品的色譜圖作為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗口設(shè)置為0.1，進(jìn)行多點(diǎn)校正，采用平均數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，共標(biāo)定出29個(gè)峰，除峰2，19，21，22，23，28之外，其余23個(gè)峰為共有峰。8批四川產(chǎn)樣品相似度為0.968～0.995，2批云南產(chǎn)樣品相似度為0.982，10批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度為0.497～0.987。說明不同產(chǎn)地、生長(zhǎng)年份等因素都是造成疊鞘石斛葉成分、含量之間差異性的因素。經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器對(duì)全部色譜峰的光譜掃描分析(220～380 nm)，除峰1，2，4，11外，其他25個(gè)色譜峰所代表的成分可定性為黃酮類物質(zhì)，結(jié)果見表1。采用對(duì)照品保留時(shí)間定位結(jié)合紫外光譜信息，鑒別出2個(gè)黃酮碳苷峰(峰5為芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷，峰9為異夏佛塔苷)和1個(gè)黃酮醇峰(峰16為蘆丁)。

圖1 10批疊鞘石斛葉指紋圖譜

2.1.5測(cè)定法 建立UPLC-PDA法同時(shí)測(cè)定黃酮類成分的含量，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁3種成分含量；將定性為黃酮類化合物的色譜峰峰面積加和，代入芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷質(zhì)量-峰面積線性回歸方程，計(jì)算總黃酮含量。

2.1.6方法學(xué)考察

2.1.6.1專屬性考察 精密吸取“2.1.2.4”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液與“2.1.3”項(xiàng)供試品溶液各2 μL，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見圖2。峰5為芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷，峰9為異夏佛塔苷，峰16為蘆丁。

2.1.6.2線性關(guān)系考察 取芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，稀釋成芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷濃度為5.000，10.00，20.00，25.00，50.00，100.0，300.0 μg·mL-1、異夏佛塔苷濃度為4.970，7.455,9.940，11.93，14.91，24.85，49.70 μg·mL-1、蘆丁濃度為4.980，9.960，14.94，19.92，24.90，29.88，49.80 μg·mL-1對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積(μV·S)為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 黃酮類成分吸收峰

A.混合對(duì)照品；B.供試品；5.芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷；9.異夏佛塔苷；16.蘆丁。

表2 各成分線性關(guān)系

2.1.6.3精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取疊鞘石斛葉(批號(hào)：181105)供試品溶液2 μL，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得6份樣品中芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁、總黃酮峰面積RSD分別為0.45%，0.80%，1.87%，0.38%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.1.6.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取疊鞘石斛葉(批號(hào)：181105)供試品溶液2 μL，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件分別在0，1，2，3，4，6 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁、總黃酮峰面積RSD分別為1.25%，0.32%，1.03%，0.59%(n=6)，表明供試品溶液在室溫下6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6.6加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁適量，70%甲醇稀釋成芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷濃度為5.500 μg·mL-1、異夏佛塔苷濃度為3.625 μg·mL-1、蘆丁濃度為6.520 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。精密稱取已知含量的疊鞘石斛葉(批號(hào)：181105)粉末0.05 g，加入混合對(duì)照品溶液10 mL，其余步驟按“2.1.3”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，并按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算3種單一成分回收率；精密稱取已知含量的疊鞘石斛葉(批號(hào)：181105)粉末0.05 g，加入芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷對(duì)照品溶液(0.1308 mg·mL-1)10 mL，按“2.1.3”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，并按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算總黃酮成分回收率。芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁、總黃酮的平均回收率分別為99.15%，101.43%，96.42%，101.68%，RSD分別為2.48%，1.86%，2.29%，2.17%，結(jié)果見表3。

2.1.7樣品含量測(cè)定 取樣品10批，按“2.1.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，計(jì)算芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁、總黃酮含量(以芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷計(jì))，結(jié)果見表4，可見產(chǎn)地四川的疊鞘石斛葉中蘆丁和總黃酮的含量較高，產(chǎn)地云南的疊鞘石斛葉中芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷較高。

表3 4種成分加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 4種成分含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1總黃酮含量測(cè)定方法選擇 從指紋圖譜可知，黃酮類成分峰較多，但單個(gè)成分含量較低，因此有必要測(cè)定總黃酮的含量，更全方面評(píng)價(jià)石斛藥材的質(zhì)量。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)可知，在中藥材的黃酮含量測(cè)定方法中，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法和AlCl3比色法最常見。有研究者統(tǒng)計(jì)過，前者使用頻率高達(dá)70%，而且多以蘆丁為對(duì)照[12]。但大部分文獻(xiàn)中黃酮含量測(cè)定方法在未進(jìn)行專屬性考察的情況下，直接應(yīng)用上述兩法進(jìn)行測(cè)定，可能導(dǎo)致含量測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。有研究者發(fā)現(xiàn)一些常見黃酮類成分(槲皮素、黃芩苷等)顯色后無吸收或吸收弱，而一些非黃酮成分(阿魏酸、綠原酸)在顯色后可產(chǎn)生最大吸收或強(qiáng)吸收，造成黃酮假陰性或非黃酮假陽性的錯(cuò)誤判斷[13-15]。筆者前期研究使用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法對(duì)石斛黃酮進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，蘆丁對(duì)照品最大吸收在510 nm附近，但供試液最大吸收波長(zhǎng)在390 nm附近，傳統(tǒng)比色-蘆丁法無法滿足專屬性要求。后使用石斛黃酮的代表成分芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷作為對(duì)照，供試液與對(duì)照液在390 nm處均有最大吸收，但陰性溶液在該波長(zhǎng)處也有吸收，干擾測(cè)定。故使用UPLC-PDA法對(duì)石斛黃酮含量測(cè)定，將定性為黃酮類化合物的色譜峰峰面積加和，計(jì)算總黃酮含量，這為建立專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的大類成分含量測(cè)定方法提供了新思路。

3.2黃酮類成分的確定 黃酮類化合物的吸收特征由桂皮酰系統(tǒng)引起的峰帶Ⅰ(300～400 nm)及苯甲酰系統(tǒng)引起的帶Ⅱ(220～280 nm)組成[16]，本研究通過比較PDA采集的各色譜峰光譜圖是否符合黃酮類物質(zhì)特征，以判斷該色譜峰所代表物質(zhì)是否為黃酮類物質(zhì)。該法較傳統(tǒng)紫外-蘆丁比色法專屬性更強(qiáng)，準(zhǔn)確度更高。石斛中的黃酮類成分主要是以芹菜素為苷元的多種黃酮碳苷類，最大吸收波長(zhǎng)相近，故以芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷作為對(duì)照計(jì)算總黃酮含量。

3.3疊鞘石斛葉選擇及總黃酮的測(cè)定 石斛中黃酮類成分主要集中在葉內(nèi)，實(shí)驗(yàn)前期采用UPLC-PAD法對(duì)不同基源石斛葉(鐵皮、疊鞘、金釵石斛葉)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)疊鞘石斛葉分離出來的黃酮類成分最多，含量最豐富，故選取疊鞘石斛基源的葉展開黃酮類成分研究。

3.4供試品制備方法的考察 筆者在本研究分別使用回流提取法和超聲提取法對(duì)樣品進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)二者提取效果相當(dāng)，故選擇操作更為簡(jiǎn)便的后者。再對(duì)提取溶劑(60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、甲醇)、提取時(shí)間(15，30，45，60 min)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)70%甲醇對(duì)待測(cè)成分的親和力最高，提取45 min后芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷及總黃酮含量不再增加。故提取方法選擇70%甲醇超聲45 min。

3.5總黃酮抗氧化活性 本研究還對(duì)10批樣品的DPPH自由基抗氧化活性進(jìn)行初步探究，發(fā)現(xiàn)總黃酮含量最高的樣品S5的DPPH自由基清除率最高，抗氧化活性最強(qiáng)，表明疊鞘石斛葉抗氧化能力與一定濃度范圍的總黃酮呈正相關(guān)。疊鞘石斛葉中各成分與抗氧化活性的關(guān)聯(lián)度及其構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步探究。

筆者在本實(shí)驗(yàn)建立的“點(diǎn)-線-面”質(zhì)量分析方法，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，符合中醫(yī)傳統(tǒng)理念的整體觀，為疊鞘石斛葉及其他中藥材黃酮類成分定量測(cè)定提供了參考。隨著與石斛藥材相關(guān)產(chǎn)品的進(jìn)一步研究開發(fā)，以黃酮作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，將有利于更加全面地評(píng)價(jià)石斛藥材質(zhì)量。