拉曼光譜法鑒別分析3種甾體類避孕藥晶型*

周健，楊世穎，張麗，張寶喜，呂揚(yáng)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

口服避孕藥占現(xiàn)代避孕方式的14%。至2019年全世界有超過(guò)1億婦女在服用口服避孕藥。目前絕大多數(shù)口服避孕藥化學(xué)結(jié)構(gòu)為甾體類激素[1]。甾體類避孕藥物通常可以分為3類：①黃體酮類衍生物，如甲地孕酮、甲孕酮等；②雌激素類衍生物，如炔雌醇、炔雌醇環(huán)戊醚等；③睪酮類衍生物，如炔諾酮等。甾體類避孕藥通常存在多晶型現(xiàn)象，不同晶型會(huì)影響藥物溶解性、穩(wěn)定性等理化性質(zhì)，進(jìn)而對(duì)生物利用度產(chǎn)生重要影響，不同藥物晶型在機(jī)體內(nèi)的吸收差異可至數(shù)倍乃至數(shù)十倍[2-4]。因此對(duì)甾體類避孕藥進(jìn)行多晶型研究，對(duì)于提高其質(zhì)量控制水平和更好發(fā)揮治療效果至關(guān)重要。

拉曼光譜是一種基于拉曼散射原理、由分子極化率變化產(chǎn)生、進(jìn)而反映化合物分子結(jié)構(gòu)中基團(tuán)振動(dòng)信息的分子振動(dòng)光譜[5-6]。拉曼光譜由于具有快速、無(wú)損、檢測(cè)樣品無(wú)需復(fù)雜前處理，并且可以和紅外光譜形成有力互補(bǔ)等優(yōu)點(diǎn)，已成為藥物多晶型研究的重要技術(shù)[7]。利用拉曼光譜進(jìn)行多晶型鑒別時(shí)，100 cm-1以下光譜低頻波段常具有一些非常有意義的特征光譜。同時(shí)藥物多晶型拉曼光譜特異性較強(qiáng)，大量實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)拉曼光譜差異細(xì)微的藥物多晶型進(jìn)行定性鑒別時(shí)，2～3 cm-1波數(shù)變化即可用來(lái)判定晶型間差異。筆者利用拉曼光譜技術(shù)對(duì)3種甾體類避孕藥物(米非司酮、炔雌醇、左炔諾孕酮)的多晶型開(kāi)展鑒別分析研究，為利用拉曼光譜技術(shù)對(duì)甾體類避孕藥物的多晶型開(kāi)展鑒別分析，提高該類藥物的質(zhì)量控制水平，提供了科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1儀器 D/max 2550粉末X射線衍射儀(日本Rigaku公司)；Horiba HR evolution高分辨拉曼光譜儀(法國(guó)HORIBA公司)。

1.2試藥 米非司酮原料(華潤(rùn)紫竹藥業(yè)有限公司，含量：100.3%，批號(hào)：20190104)；炔雌醇原料(華潤(rùn)紫竹藥業(yè)有限公司，含量：100.9%，批號(hào)：20190104)；左炔諾孕酮原料(武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，含量：98.0%，批號(hào)：20170329)。

2 方法與結(jié)果

2.13種甾體類避孕藥物多晶型的晶型確證 本實(shí)驗(yàn)采用的3種甾體類避孕藥物多晶型物質(zhì)均來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室前期制備樣品，采用粉末X射線衍射法(powder x-ray diffraction，PXRD)進(jìn)行表征，并與文獻(xiàn)報(bào)道的每種晶型標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)[8-14]，以確證研究對(duì)象晶型種類及是否發(fā)生轉(zhuǎn)晶。PXRD分析條件：CuKα輻射，石墨單色器，管壓40 kV，管流150 mA，2θ掃描范圍3 °～80°，掃描速度8 °·min-1，步長(zhǎng)0.02 °，發(fā)散狹縫DS=1 °，接收狹縫RS=0.15 mm，防散射狹縫SS=1 °。米非司酮、炔雌醇、左炔諾孕酮不同晶型PXRD圖譜見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種甾體類避孕藥物多晶型樣品均為晶型純品，可用于開(kāi)展拉曼分析研究。

2.23種甾體類避孕藥物多晶型拉曼光譜表征 每種樣品取5 mg，用于拉曼光譜測(cè)試。光譜采集范圍：200～4000 cm-1；激光波長(zhǎng)：633 nm；光柵刻線密度：600 gr·mm-1；采集時(shí)間：3 s；累計(jì)次數(shù)：3次。為確保拉曼光譜一致性和穩(wěn)定性，對(duì)同一種晶型樣品平行采集光譜3次。結(jié)果表明本研究中3種甾體類避孕藥物多晶型拉曼光譜具有良好可重復(fù)性。米非司酮、炔雌醇、左炔諾孕酮各自不同晶型拉曼光譜圖見(jiàn)圖2，拉曼位移值見(jiàn)表1。

2.33種甾體類避孕藥物多晶型拉曼光譜鑒別分析 由圖2可知，米非司酮、炔雌醇和左炔諾孕酮拉曼光譜圖差異明顯，每一品種藥物多晶型之間拉曼光譜峰強(qiáng)度、峰位置、峰數(shù)量及峰展寬等均存在差異。

3種甾體類避孕藥物具有相似的甾環(huán)主體結(jié)構(gòu)，D環(huán)上均具有炔基取代基，因此3種避孕藥物拉曼光譜在特定波數(shù)區(qū)段體現(xiàn)出一定程度相似性，如在2750～3250 cm-1之間CH振動(dòng)高波數(shù)區(qū)間，具有連續(xù)多重峰；在1500～2500 cm-1之間C≡C伸縮振動(dòng)區(qū)域，通常具有主強(qiáng)峰，上述特征可作為利用拉曼光譜對(duì)甾體類避孕藥物進(jìn)行鑒別分析的重要信息。

3種甾體類避孕藥物除由于相似化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致部分拉曼光譜特征相似之外，各自還有特異性較強(qiáng)光譜特征，如炔雌醇A環(huán)連接一個(gè)羥基，局部結(jié)構(gòu)與苯酚相似，故炔雌醇拉曼光譜在3290 cm-1附近弱散射峰可歸屬為酚羥基伸縮振動(dòng)；米非司酮E環(huán)連接-N(CH3)2基團(tuán)，故米非司酮拉曼光譜在1382 cm-1處具有獨(dú)立散射峰，可歸屬為E環(huán)上C-N伸縮振動(dòng)。3種甾體類避孕藥物拉曼光譜主要差異見(jiàn)表2。

由表2可知，拉曼光譜可以作為3種甾體類避孕藥物的有效鑒別分析手段。在此基礎(chǔ)之上，拉曼光譜亦可對(duì)每種甾體類避孕藥物多晶型實(shí)現(xiàn)較好定性鑒別分析。

A.米非司酮；B.炔雌醇；C.左炔諾孕酮。

A.米非司酮；B.炔雌醇；C.左炔諾孕酮。

2.3.1米非司酮3種晶型的拉曼光譜鑒別分析 米非司酮是孕激素受體拮抗劑，體內(nèi)可產(chǎn)生抗孕激素作用[15]。米非司酮常見(jiàn)晶型為晶M型、晶N型和晶W型，其中晶M型、晶N型為不含結(jié)晶溶劑的晶態(tài)物質(zhì)，晶W型為無(wú)定型物。

3種晶型拉曼光譜圖主要區(qū)別在于：①晶M型在482 cm-1處為單峰，晶N型在此波數(shù)附近則裂分為雙峰。拉曼光譜低波數(shù)振動(dòng)主要來(lái)自于化合物骨架變形振動(dòng)，差異產(chǎn)生的可能原因在于單鍵旋轉(zhuǎn)導(dǎo)致苯環(huán)及其取代基發(fā)生轉(zhuǎn)動(dòng)進(jìn)而導(dǎo)致2種晶型分子構(gòu)象不同。②晶N型在1280和1306 cm-1處為相鄰雙峰，晶M型在該波數(shù)附近則顯示為多重峰，2種晶型分子在構(gòu)象上存在差異，A環(huán)平面不能重合，基團(tuán)所處環(huán)境不同，進(jìn)而振動(dòng)發(fā)生變化[16]。③晶W型為無(wú)定型，其峰相對(duì)強(qiáng)度更弱，峰展寬相較于2種晶態(tài)物質(zhì)更寬、更鈍，圖譜熒光干擾背景也更大。晶W型通過(guò)球磨制備得到，微觀結(jié)構(gòu)中不存在晶格排列，為無(wú)定型態(tài)，入射激光引起分子振動(dòng)能力也隨之改變。

2.3.2炔雌醇2種晶型的拉曼光譜鑒別分析 炔雌醇是雌激素類衍生物，是常用復(fù)方口服避孕藥中使用的雌激素種類[17]。炔雌醇可藥用晶型有2種，即晶A型與晶B型。其中晶A型為無(wú)溶劑晶型，晶B型為炔雌醇半水合物，2種晶型分屬于正交晶系與單斜晶系。

2種晶型拉曼光譜圖差異較大，主要區(qū)別在于：①部分拉曼特征峰相對(duì)強(qiáng)度存在差異，晶A型與晶B型均在716 cm-1與2109 cm-1波數(shù)附近具有兩個(gè)吸收強(qiáng)峰。晶A型在717 cm-1處峰強(qiáng)度為152個(gè)強(qiáng)度計(jì)數(shù)、2109 cm-1處峰強(qiáng)度為230個(gè)強(qiáng)度計(jì)數(shù)；晶B型主強(qiáng)峰位于715 cm-1，強(qiáng)度為174個(gè)強(qiáng)度計(jì)數(shù)，次強(qiáng)峰位于2108 cm-1，強(qiáng)度為150個(gè)強(qiáng)度計(jì)數(shù)。據(jù)此可以發(fā)現(xiàn)2種晶型主強(qiáng)峰與次強(qiáng)峰的相對(duì)位置發(fā)生變化，強(qiáng)度大小也存在差異。分析原因可能在于2種晶型所屬不同晶系，具有不同分子對(duì)稱規(guī)律，進(jìn)而導(dǎo)致基團(tuán)振動(dòng)強(qiáng)度發(fā)生變化。②炔雌醇2種晶型在2800～3100 cm-1高波數(shù)區(qū)間差異明顯，該區(qū)間內(nèi)峰相對(duì)強(qiáng)度、峰數(shù)量以及峰幾何拓?fù)涞却嬖诓町?。晶A型在2847 cm-1處為單一強(qiáng)峰，晶B型在2846與2860 cm-1處裂分為雙峰；晶A型在2861～2918 cm-1之間具有多個(gè)尖銳小峰，晶B型在2920與2939 cm-1處具有較強(qiáng)雙峰。拉曼光譜高波數(shù)區(qū)間為CH振動(dòng)特征區(qū)域，引起差異的原因在于晶B型是炔雌醇水合物，水分子作為結(jié)晶溶劑介入炔雌醇主體分子空間結(jié)構(gòu)排列，并與炔雌醇分子之間產(chǎn)生氫鍵作用，引起拉曼振動(dòng)變化。拉曼光譜變化可以反映水分子作為結(jié)晶溶劑對(duì)于炔雌醇分子空間排列產(chǎn)生影響，而不是以“隧道溶劑”形式鑲嵌于主體分子之間空穴內(nèi)。

表1 3種甾體類避孕藥物拉曼位移值

表2 3種甾體類避孕藥物拉曼光譜差異

2.3.2左炔諾孕酮2種晶型的拉曼光譜鑒別分析 左炔諾孕酮是一種強(qiáng)效孕激素，常見(jiàn)晶型有晶α型與晶β型，2種晶型均不含結(jié)晶溶劑[18-19]。左炔諾孕酮2種晶型的拉曼光譜圖除強(qiáng)度外差異細(xì)微，主要體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面：①晶α型在283與310 cm-1處為相鄰雙峰，晶β型在287 cm-1處為較顯著單峰，287 cm-1處拉曼散射峰可歸屬為乙基取代基骨架變形，乙基支鏈轉(zhuǎn)動(dòng)導(dǎo)致基團(tuán)振動(dòng)變化。②晶α型在1659 cm-1處散射峰強(qiáng)度為100個(gè)強(qiáng)度計(jì)數(shù)，晶β型在1659 cm-1處散射峰強(qiáng)度為310個(gè)強(qiáng)度計(jì)數(shù)。由于2種晶型構(gòu)象存在差異，導(dǎo)致碳骨架振動(dòng)強(qiáng)度發(fā)生改變。左炔諾孕酮晶α型與晶β型的拉曼光譜差異細(xì)微，故可選擇拉曼光譜作為該品種藥物多晶型鑒別分析的輔助檢測(cè)手段。

3 討論

通過(guò)拉曼光譜技術(shù)對(duì)米非司酮、炔雌醇、左炔諾孕酮的多晶型進(jìn)行表征，研究發(fā)現(xiàn)采用拉曼光譜可以對(duì)上述3種藥物的多晶型實(shí)現(xiàn)定性鑒別分析。

3種甾體類避孕藥物由于具有相似甾環(huán)主體結(jié)構(gòu)和炔基取代，其拉曼光譜在特定的波段具有相似的散射峰，這些特征光譜信息可用于該類藥物的結(jié)構(gòu)鑒別。由于每種藥物結(jié)構(gòu)不同，每種藥物亦具有特異性的光譜特征，故可以選擇拉曼光譜作為甾體類避孕藥物的鑒別分析手段。

在此基礎(chǔ)上，拉曼光譜獲得與甾體類避孕藥物多晶型成因相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息，拉曼光譜可作為甾體類避孕藥物多晶型的鑒別分析方法。甾體類避孕藥物分子由于排列方式和對(duì)稱規(guī)律不同，會(huì)對(duì)峰的裂分和峰的位置等特征信息產(chǎn)生影響；物理方式對(duì)晶格造成的破壞因素，如晶態(tài)和無(wú)定型態(tài)會(huì)對(duì)不同晶型的拉曼光譜相對(duì)峰強(qiáng)度產(chǎn)生影響；結(jié)晶溶劑的介入，反映在拉曼光譜中也可以表現(xiàn)為拉曼散射峰數(shù)量、峰位置等光譜信息變化，據(jù)此可以判斷溶劑分子的結(jié)合方式是隧道溶劑還是結(jié)晶溶劑。

拉曼光譜用于甾體類避孕藥物多晶型鑒別時(shí)具有一定局限性，如左炔諾孕酮2種晶型的拉曼光譜差異較細(xì)微，這種情況需聯(lián)合運(yùn)用PXRD、紅外光譜、熱分析等技術(shù)方法完成多晶型的鑒別確證[20-22]。拉曼光譜技術(shù)可對(duì)甾體類避孕藥物的多晶型開(kāi)展定性鑒別，對(duì)甾體類避孕藥物的多晶型進(jìn)行定量研究，從定量的角度提高其質(zhì)量控制水平也是需進(jìn)一步研究的問(wèn)題。