HPLC法同時測定赤芍中五種化學(xué)成分的含量*

★ 張嘉嘉 黃曉萱 馬馳 楊漪 張勛*（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 福州 350122）

赤芍為毛茛科芍藥（Paeonia lactifloraPall）或川赤芍（P.veitchiiLynch）的干燥根，具有清熱涼血、散瘀止痛的功效［1］。赤芍主要含有兩大類化學(xué)成分，即苷類和沒食子酸及其衍生物，苷類主要活性成分有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷等［2］。其中，芍藥苷含量最高，《中國藥典》中也是以芍藥苷作為藥材質(zhì)量檢測的目標成分。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷具有擴張血管、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗炎、抗?jié)兊淖饔茫?-4］；芍藥內(nèi)酯苷具有鎮(zhèn)痛、抗炎、補血、抗抑郁等功效［5］；沒食子酰葡萄糖具有抗癌、抗糖尿病等生物學(xué)活性［6-7］；沒食子酸具有明顯的抗氧化、抗炎等作用［8］。《中國藥典》2015版一部主要以芍藥苷的含量控制赤芍藥材的質(zhì)量，但是單一的成分控制無法從整體水平控制赤芍的質(zhì)量。建立快捷、方便、可靠的同時測定多種赤芍活性成分檢測方法對赤芍藥材的質(zhì)量控制具有重要意義。故本實驗選擇芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖以及沒食子酸5種成分作為質(zhì)量控制指標，分別測定了20個不同產(chǎn)地的赤芍中5種成分的含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DF-15臺式連續(xù)投料粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；AR224CN型電子分析天平（常州奧豪斯儀器有限公司）；KQ-500DE型醫(yī)院數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；安捷倫1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；MILLI-Q Direct16 一體化超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 材料 赤芍對照藥材（批號：120915-201109，中國食品藥品質(zhì)量檢定研究院）；沒食子酸（批號：B20851，上海源葉生物科技有限公司）；氧化芍藥苷（批號：YY90574，上海源葉生物科技有限公司）；芍藥內(nèi)酯苷（批號：YY90477，上海源葉生物科技有限公司）；芍藥苷（批號：B21148，上海源葉生物科技有限公司）；β-五沒食子酰葡萄糖（批號：P816672，上海麥克林生化科技有限公司）；甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純（默克化工技術(shù)有限公司）；實驗用水皆為實驗室自制二次蒸餾水。20批赤芍飲片中Cs2015121401—Cs2015121419為赤芍飲片，Cs2015121420為赤芍對照藥材，均經(jīng)過福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪老師鑒定）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 Welch Ultimate?XBC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫，0～10 min，5%～10%A；10～30 min，10%～15%A ；30～45 min，15%～30%A。流速1 mL/min；檢測波長230 nm；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。5個對照品分離度良好，各峰的分離度均大于1.5。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取5種活性成分對照品沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖適量，加甲醇超聲溶解制 成 346.8、319.6、198.0、366.8、353.6 μg/mL 的沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖對照品儲備液。分別精密吸取對照品儲備液適量，用甲醇稀釋得每1 mL含173.4、159.8、99.01、183.4 和 88.4 μg上述 5 種成分的混合對照品溶液，即得，4 ℃下保存于冰箱中。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末過80目篩，精密稱取0.25 g，置25 mL具塞三角燒瓶中，精密加入80%甲醇超聲處理（功率240 W，溫度60 ℃）30 min，放冷，補足失重。過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標準曲線 精密吸取“2.2”項下的混合對照品儲備液于20 mL量瓶中，依次對半稀釋得不同濃度的對照品混合液。按“2.1”項測定，以對照品的濃度（C，μg/mL）為橫坐標（X），峰面積（A，mAU）為縱坐標（Y），分別繪制5個對照品的標準曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 5種化合物的線性回歸方程

2.4.2 精密度 取對照品混合液5 μL，按“2.1”項進行測定。一天內(nèi)連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖峰面積的RSD分別為0.57%、0.68%、0.11%、0.33%、1.2%，5種成分峰面積的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性 精密稱取同一份赤芍樣品（批號：Cs20151216-18），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫環(huán)境下分別在0、2、4、8和12 h時進樣5 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定。結(jié)果沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖峰面積的RSD分別為2.57%、2.68%、2.37%、1.23%、2.41%，表明赤芍供試品溶液中各成分在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性 精密稱取同一份赤芍樣品（批號：Cs20151216-18），平行6份，按“2.3”項制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定各成分的峰面積。結(jié)果沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖峰面積的RSD分別為2.52%、2.31%、1.95%、1.07%、1.23%，5種成分峰面積的RSD均小于3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率 精密稱取已知含量的赤芍樣品粉末6份，分別加入樣品含量50%的對照品溶液，按“2.3”項方法制備供試品溶液，并按“2.1”項色譜條件進樣，記錄峰面積，計算平均加樣回收率，結(jié)果沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖的平均加樣回收率分別為100.21%、99.83%、100.22%、101.94%、100.79%，RSD分別為2.04%、2.21%、2.56%、1.01%、2.35%。

2.5 樣品測定 分別取赤芍樣品粉末約0.25 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，采用標準曲線法計算沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖的含量，結(jié)果如表2所示。

表2 20批赤芍樣品5種成分含量 %

（續(xù)表）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 將混合對照品溶液進行190 nm～400 nm紫外可見光全波長掃描，分別在250 nm和230 nm附近出現(xiàn)兩個吸收峰，沒食子酸、氧化芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖的最大吸收峰并不在230 nm，但方法學(xué)考察結(jié)果表明它們在230 nm有著很好的線性關(guān)系，可以用來定量檢測，且發(fā)現(xiàn)在230 nm下各色譜峰的數(shù)目、分離度、豐度較好，故本研究選擇230 nm作為檢測波長。

3.2 色譜條件考察 為尋求最佳色譜條件，本實驗先后考察了不同提取溶劑、不同提取方式、不同提取時間、不同柱溫、不同流速、不同流動相體系，結(jié)果表明，色譜條件選擇Welch Ultimate?XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相乙腈和0.1%甲酸，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，80%甲醇處理30 min，各色譜峰的峰形、分離度較好。

4 結(jié)論

本文建立HPLC法，測定赤芍中沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖的含量。2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，赤芍飲片含芍藥苷不得少于1.5 %，20批藥材全部合格，但與對照藥材相比，部分產(chǎn)地芍藥內(nèi)酯苷的含量過高，是對照藥材的6～100倍，此外，各個產(chǎn)地的β-五沒食子酰葡萄糖含量均高于對照藥材，因此，僅僅用芍藥苷作為赤芍的指標性成分，專屬性不強，不足以反映白芍的總體質(zhì)量。故本實驗通過對赤芍沒食子酸等5種成分含量的研究，初步對赤芍的質(zhì)量進行了考察，方法簡單，結(jié)果可靠，重復(fù)性好，為赤芍整體質(zhì)量控制評價體系的建立提供了科學(xué)實驗基礎(chǔ)。