金黃色葡萄球菌的耐藥現(xiàn)狀和耐藥基因的分析

程 聰，李春英，趙淑芳，祝力騁

（1.麗水學(xué)院職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江麗水323000；2.麗水學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院，浙江麗水323000）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是革蘭陽性菌的代表，是臨床上常見的病原菌，可引起嚴(yán)重感染，廣泛分布于人體皮膚、黏膜及醫(yī)院環(huán)境中。近年來隨著各種開創(chuàng)性操作的迅猛開展及抗菌藥物廣泛應(yīng)用，使該菌耐藥率不斷上升[1]，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的出現(xiàn)，須引起臨床高度重視[2]。為此，筆者對麗水學(xué)院附屬第一醫(yī)院2018年6月—2018年12月及2015年1月—2015年12月分離得到的金黃色葡萄球菌的耐藥現(xiàn)狀和耐藥基因的流行分布情況進(jìn)行分析研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2018年6月—2018年12月及2015年1月—2015年12月麗水學(xué)院附屬第一醫(yī)院各科室送檢的感染性標(biāo)本共212株，其主要來源于痰液、分泌物、尿液、血液、引流物等。細(xì)菌的分離鑒定參照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行，并經(jīng)法國生物梅里埃公司（bioMerieux）Vitek60細(xì)菌鑒定儀鑒定。質(zhì)檢菌株金黃色葡萄球菌［ATCC29213］為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 儀器與試劑

Mueller－Hinton Agar瓊脂（Oxoid公司），藥物紙片（杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品），PCR試劑（購于寶生物工程（大連）有限公司）；Vitek60型全自動細(xì)菌分析儀（法國生物梅里埃公司），PCR擴(kuò)增儀（美國伯樂公司），凝膠成像儀（美國伯樂公司）。

1.3 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用K-B法和瓊脂稀釋法，嚴(yán)格按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀藥敏結(jié)果，并采用標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌［ATCC29213］實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制。

1.4 細(xì)菌DNA提取

采取經(jīng)典堿裂解法提取樣本DNA，將各臨床分離菌株及質(zhì)控菌株接種于普通瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，取單菌落置入1.5 mL的Eppendorf離心管內(nèi)（內(nèi)預(yù)置生理鹽水200 μL），混勻，12 000 r/min離心5 min；棄上清，加入裂解液，混勻，100℃，10 min；10 000 r/min離心1 min；上清液為 DNA模板，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 耐藥基因檢測

根據(jù)PCR儀和試劑盒說明書進(jìn)行操作，PCR反應(yīng)參數(shù)：ermA、tetM：94℃預(yù)變性5 min，93℃變性40 s，50 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 40 s；ermB、tetK：94 ℃預(yù)變性 5 min，93 ℃變性 40 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸40 s；ermC：94 ℃預(yù)變性 5 min，93 ℃變性 40 s，50 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 40 s；aac（6'）：95 ℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 40 s，58℃退火 45 s，72℃延伸 40 s；mecA：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 40 s，58℃退火 45 s，72℃延伸40 s；qacA：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，60℃退火45 s，72℃延伸40 s。循環(huán)30次，72℃延伸10 min，10℃10min，結(jié)束。PCR擴(kuò)增引物[3-4]由上海桑尼生物科技有限公司合成，基因引物見表1。

表1 耐藥基因擴(kuò)增引物

2 結(jié)果

2.1 212株金黃色葡萄球菌標(biāo)本來源分布

金黃色葡萄球菌標(biāo)本來源主要為痰液，詳見表2。

表2 212株金黃色葡萄球菌標(biāo)本來源構(gòu)成比

2.2 212株金黃色葡萄球菌標(biāo)本臨床科室來源構(gòu)成比

金黃色葡萄球菌醫(yī)院感染主要集中在外科、兒科和骨科等科室，詳見表3。

表3 212株金黃色葡萄球菌標(biāo)本臨床科室來源構(gòu)成比

2.3 212株金黃色葡萄球菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

藥物敏感試驗(yàn)顯示金黃色葡萄球菌對青霉素耐藥率最高，其次為苯唑西林；對呋喃妥因的耐藥率最低，稍高的為奎奴普丁/達(dá)福普汀。與2015年相比，2018年金黃色葡萄球菌對大多數(shù)抗菌藥物的耐藥率有不同程度的下降，詳見表4。

表4 212株金黃色葡萄球菌藥敏率

2.4 耐藥基因

本研究顯示，金黃色葡萄球菌耐藥基因以mecA為主（76/212），檢出率為35.85%，其次為ermA（41/212），檢出率為19.34%，只攜帶一種耐藥基因的有93株菌，攜帶兩種耐藥基因的有27株菌，且以mecA/ermA組合最常見（21/27），攜帶3個耐藥基因的有4株菌，都攜帶mecA、ermA和ermC基因，詳見表5。

表5 金黃色葡萄球菌耐藥基因及檢出率

3 討論

金黃色葡萄球菌是目前臨床感染性疾病的主要致病菌之一，可引起全身性感染，甚至可發(fā)生敗血癥，危及生命。本研究結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌主要分離自痰液（2015年40.5%、2018年37.4%）和分泌物（2015年24.0%、2018年19.8%），說明金黃色葡萄球菌是呼吸道和外傷等感染性疾病的主要致病菌，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]。金黃色葡萄球菌感染主要集中在新生兒科、外科和骨科等科室，三者約占50%。

藥物敏感試驗(yàn)顯示：金黃色葡萄球菌對青霉素耐藥率最高，達(dá)96.69%/93.41%（2015年/2018年），其次為苯唑西林，耐藥率為76.86%/67.03%（2015年/2018年）；對呋喃妥因的耐藥率最低，為1.65%/1.10%（2015年/2018年），稍高的為奎奴普丁/達(dá)福普汀，耐藥率為2.48%/2.19%（2015年/2018年）。與2015年相比，2018年金黃色葡萄球菌對大多數(shù)抗菌藥物的耐藥率有不同程度的下降，說明近兩年在耐藥性控制方面取得了一定的成效。相關(guān)報(bào)道顯示MRSA的檢出率不盡相同，其原因可能與地區(qū)及樣本來源不同有關(guān)[6]。2016年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測結(jié)果顯示全國MRSA的檢出率達(dá)35.8%，浙江省MRSA的檢出率達(dá)37.8%，本研究MRSA的檢出率為27.27%，低于全國和全省水平，說明本地區(qū)在控制MRSA流行傳播方面做得比較好。

本研究結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌耐藥基因以mecA為主（76/212），檢出率為35.85%，mecA基因主要由MRSA菌株所攜帶，33株MRSA菌株均攜帶mecA基因，且100%耐青霉素G。此結(jié)果與相關(guān)報(bào)道一致[7]。金黃色葡萄球菌對四環(huán)素耐藥主要由tetM、tetK基因介導(dǎo)。本研究中tetM、tetK都未被檢出，四環(huán)素的耐藥率也較低，為8.26%/7.69%（2015年/2018年）。金黃色葡萄球菌對紅霉素耐藥主要由erm基因家族介導(dǎo)[8]。本研究erm基因家族檢出率為35.38%，紅霉素的耐藥率為71.07%/68.13%（2015年/2018年）。本地區(qū)金黃色葡萄球菌耐紅霉素應(yīng)該還存在其他耐藥機(jī)制。aac（6'）-aph（2'）主要介導(dǎo)氨基糖苷類藥物的耐藥。本研究中aac（6'）-aph（2'）檢出率為5.66%，慶大霉素的耐藥率為12.39%/9.89%（2015年/2018年），兩者關(guān)系基本相符。文獻(xiàn)報(bào)道[9]稱替考拉寧與萬古霉素都是糖肽類抗菌藥物，其作用機(jī)制相似，但替考拉寧的蛋白結(jié)合率更高。本研究中212株金黃色葡萄球菌對替考拉寧的耐藥率為49.59%/47.25%（2015年/2018年），對萬古霉素的耐藥率為3.31%/5.49%（2015年/2018年），替考拉寧的耐藥率遠(yuǎn)高于萬古霉素，可能與本地區(qū)替考拉寧的使用量有關(guān)。

綜上所述，本地區(qū)治療金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病可優(yōu)先考慮呋喃妥因、奎奴普丁/達(dá)福普汀和萬古霉素。與2015年相比，2018年收集的金黃色葡萄球菌對大多數(shù)常用抗菌藥物的耐藥率有不同程度的下降，說明近年在耐藥性控制方面取得了一定的成效。