豬糞發(fā)酵菌株的篩選、評價及發(fā)酵模式優(yōu)化

夏昊鈞，葉文杰，許崇翔，張晨慧，肖建中，鄭 強(qiáng)

（麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院，浙江麗水323000）

隨著人民生活水平的不斷提高，人們對豬肉及其肉制品的需求不斷升高[1]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）資料顯示[2]，到2050年全世界對肉類的需求量將增加73%，因此養(yǎng)殖規(guī)模也將隨著肉類需求量的增加而不斷擴(kuò)大，同時導(dǎo)致豬糞的產(chǎn)量也隨之增大。但目前規(guī)?；酿B(yǎng)豬場大部分沒有配套設(shè)置相對應(yīng)的糞污處理設(shè)施[3]，從而造成嚴(yán)重的糞污生態(tài)污染。發(fā)酵床養(yǎng)殖模式是近年來備受關(guān)注的一種新模式，由于其不僅具有效率高、成本低、易于推廣的優(yōu)點(diǎn)，還能將糞污轉(zhuǎn)化為有機(jī)肥資源，因此得到了各級地方政府的大力推廣[4]。據(jù)統(tǒng)計，截至2017年10月，僅浙江省采用發(fā)酵床處理模式的養(yǎng)殖場就達(dá)到了323個[4]。

維持發(fā)酵床模式穩(wěn)定運(yùn)行的關(guān)鍵因素之一在于所投加的菌株。投加的菌株在發(fā)酵過程中利用豬糞中的營養(yǎng)維持生長并抑制臭氣物質(zhì)的轉(zhuǎn)化、合成及釋放，從而起到除臭的作用。豬糞發(fā)酵過程中的臭氣物質(zhì)數(shù)量眾多，其中以氨氣（NH3）與硫化氫（H2S）最具代表性，因此本研究結(jié)合嗅辨法初篩及氨氮降解復(fù)篩實(shí)驗(yàn)，從實(shí)驗(yàn)室保存菌種中篩選出具有高效利用氨氮潛力的菌株，并對其在發(fā)酵過程中對兩種臭氣物質(zhì)釋放量的抑制效果做出評價，為發(fā)酵床菌種的開發(fā)提供參考。

此外，進(jìn)一步對基于氣泡石的發(fā)酵模式進(jìn)行了初步探索。傳統(tǒng)的發(fā)酵床模式往往采用機(jī)械翻耕的方式來提高發(fā)酵床中的含氧量，促進(jìn)發(fā)酵優(yōu)勢菌的生長，但機(jī)械翻耕不僅能耗巨大，且翻耕的過程會導(dǎo)致發(fā)酵床體熱量的損失，而維持較高的溫度對于殺滅豬糞中的蟲卵以及加速豬糞的腐熟都具有重要的作用。因此，采用氣泡石作為發(fā)酵床體的基底，從床底均勻通入空氣，理論上能夠達(dá)到提高床體含氧量與維持床體溫度兩者間的平衡。實(shí)驗(yàn)表明，基于氣泡石的發(fā)酵模式能夠進(jìn)一步降低兩種臭氣物質(zhì)的釋放量。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

氨標(biāo)準(zhǔn)儲備試劑、硫化氫標(biāo)準(zhǔn)儲備試劑、紫外分光光度計、臺式高速離心機(jī)、立式壓力蒸汽滅菌器、牛肉膏蛋白胨、PDA、高氏1號、LB等培養(yǎng)基[5]。

1.2 菌種的篩選

1.2.1 菌種的初篩

此次菌種初篩采用六級分類法來測定臭味指標(biāo)[6]。具體為：無臭味（0）；勉強(qiáng)感到臭味（1）；微弱的臭味（2）；明顯的臭味（3）；很強(qiáng)的臭味（4）；難以忍受的臭味（5）。

1.2.2 菌種的復(fù)篩

利用氨選擇培養(yǎng)基進(jìn)行除臭菌種的初篩；繪制氨氮的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過測定復(fù)篩培養(yǎng)基中氨氮的濃度篩選出除臭效果好的菌株。氨氮降解率計算：氨氮降解率（%）=（初始濃度-過段時間后濃度）÷初始濃度×100%。

1.3 NH3和H2S的測定

1.3.1 NH3的測定

在裝有4 kg豬糞的大桶中放入裝有200 mL2%硼酸溶液的大燒杯，用于吸收NH3，再用桶蓋密封，每隔3 d用硼酸吸收凱氏法[7]測定NH3的釋放量，以21 d為一周期。

1.3.2 H2S的測定

在裝有4 kg豬糞的大桶中放入裝有200 mL鋅胺絡(luò)鹽溶液的大燒杯，用于吸收H2S，再用桶蓋密封，每隔3 d用鋅胺絡(luò)鹽吸收比色法[8]測定H2S的釋放量，以21 d為一周期。

2 結(jié)果

2.1 除臭菌的篩選

2.1.1 除臭菌的初篩[9]

通過嗅辨法，在66個菌中共篩選出16株菌可視為有效菌（臭味等級為0、1、2），根據(jù)表1可知這16株菌分別是：活力 Z1、發(fā)酵 Z1、蚯蚓 Z2、發(fā)酵 X1、高溫 Z1、高溫 Z2、高溫 Z3、有機(jī) Z2、有機(jī) Z3、地衣 X1、枯草 X1、有機(jī) X1、豬糞 F2、秸稈 F2、發(fā)酵 Z1、凝結(jié) X1。

表1 嗅辨法結(jié)果

對樣品涂布、分離后得到66個菌株的初步定性篩選結(jié)果。采用以氨氣為唯一氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從而初步篩選出能以氨氣作為氮源的菌種。能利用氨氣的菌種均會在初篩培養(yǎng)基中長菌或出現(xiàn)渾濁（生長情況用“+”表示），與不長菌、空白組（生長情況用“-”表示）存在明顯的差異。由表2可以看出：能以氨氣作為氮源的除臭菌株共50株，其中真菌20株、細(xì)菌12株、放線菌18株。細(xì)菌、真菌、放線菌這3種菌種的篩選比例分別為18.18%、30.30%、27.27%。

表2 不同菌株對NH3利用情況

兩種初篩方法共有的菌包括：活力Z1、發(fā)酵Z1、蚯蚓Z2、發(fā)酵X1、高溫Z1、高溫Z2、高溫Z3、有機(jī)Z2、有機(jī)Z3、地衣X1、枯草X1、有機(jī)X1、豬糞F2、秸稈F2，共14種。初篩的這14株菌不僅具有利用氨氣的潛在能力，還具備較好的除臭能力。

2.1.2 除臭菌的復(fù)篩[10]

篩選以氨作為氮源的除臭菌通常使用氨選擇初篩培養(yǎng)基[11]，選擇30℃氨氮降解率在60%以上、50℃氨氮降解率在25%以上的菌種為復(fù)篩得到的菌種。由圖1可知：有機(jī)Z2、有機(jī)Z3、高溫Z1、高溫Z3、地衣X1及發(fā)酵Z1這6株菌30℃和50℃氨氮降解率都低于篩選要求，秸稈F2、蚯蚓Z2、發(fā)酵X1的30℃氨氮降解率低于篩選要求，活力Z1的50℃氨氮降解率低于篩選要求。其中：枯草X1、有機(jī)X1、高溫Z2和豬糞F2的降解作用明顯；高溫Z2菌株在整個過程中降解作用明顯。總體來看，各菌株在接種復(fù)篩培養(yǎng)基后，在30℃下氨氮濃度呈快速下降趨勢，而在50℃下氨氮濃度的下降趨勢較為平緩。

圖1 在不同溫度下各菌種發(fā)酵的氨氮濃度

2.1.3 除臭評價

在除臭評價實(shí)驗(yàn)中，由圖2和圖3可知：4株菌的NH3累積釋放量均低于空白對照組，說明4株菌對NH3除臭均有明顯效果。4株菌的NH3釋放量減少范圍為10.18%～51.22%，其中效果最好的為枯草X1，其NH3釋放量減少51.22%。除臭菌株中豬糞F2的NH3濃度變化趨勢相較于其他3株菌株更為平緩，其最終的NH3釋放量減少10.18%?？莶軽1、豬糞F2的H2S累積釋放量低于空白對照組，這2株菌對H2S除臭具有明顯的效果，其最終的H2S釋放量分別減少14.56%和19.63%。有機(jī)X1、高溫Z2的H2S釋放量高于空白對照組，這2株菌反倒增加了H2S的釋放，可能原因是由于菌本身會產(chǎn)生H2S，增加了H2S濃度。

高溫Z2對NH3除臭效果明顯，但是其H2S釋放量要高于空白對照組，豬糞F2對H2S除臭具有明顯的效果，但是對NH3除臭效果不明顯。除臭綜合效果最好的組為枯草X1，其氨氣和H2S釋放量分別減少51.22%和14.53%。

圖2 除臭菌NH3釋放量曲線圖

圖3 除臭菌H2S釋放量曲線圖

2.2 填充物對豬糞發(fā)酵中NH3釋放量的影響

豬糞自身含水量高且C/N低，在實(shí)踐過程中可以選擇合適的填充物來為微生物提供碳源，并增加堆體的孔隙度，使豬糞發(fā)酵過程中養(yǎng)分增多，抑制產(chǎn)臭氣的菌，從而加速降解過程[12]。由圖4和圖5可知，各處理組NH3的釋放量比對照低，說明填充物的添加對豬糞有一定的除臭效果，其表現(xiàn)在：改變和優(yōu)化了豬糞內(nèi)的C/N比例，增加了豬糞當(dāng)中的C元素，使得C/N比增加，有利于菌的生長；此外增加了孔隙中的含氧量，抑制厭氧菌產(chǎn)生各種臭氣，從而有效地減少了豬糞NH3的釋放量；維持了濕度的平衡，較長時間維持豬糞當(dāng)中的含水量。各處理組降解NH3的效果在前期較好，第9 d時除氨氣效果最好的是椰絲，NH3的釋放量減少90.97%；各處理組降解NH3的效果在后期變?nèi)?，豬糞堆肥發(fā)酵整個周期內(nèi)除NH3效果最好的是谷殼，NH3的釋放量減少86.48%。

圖4 不同填充物對豬糞氨氣的除臭滴定效果圖

圖5 填充物對豬糞發(fā)酵NH3釋放量的影響曲線圖

2.3 氣泡石對豬糞發(fā)酵中NH3及H2S釋放量的影響

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)酵技術(shù)也在不斷進(jìn)步。在豬糞發(fā)酵過程中適當(dāng)?shù)赝饽芤种瞥魵獾漠a(chǎn)生[13]，氣泡石通氣具有保持溫度、能耗低、連續(xù)通氣等優(yōu)點(diǎn)，促進(jìn)豬糞降解。由圖6和圖7可以看出：在21 d的發(fā)酵過程中，兩組NH3的釋放量都較為平穩(wěn)，氣泡石組的NH3累積釋放量明顯少于空白對照組的NH3釋放量，其NH3釋放量減少64.09%。H2S的釋放量在堆肥前期的0～15 d較多，在堆肥后期15～21 d內(nèi)曲線趨于平緩，說明到后期豬糞中H2S釋放量很少。兩組的H2S累積釋放量存在著明顯的差別，對照組H2S累積釋放量為0.545 mg/kg，氣泡石組H2S累積釋放量為0.419 mg/kg，其H2S釋放量減少23.12%。

氣泡石裝置NH3和H2S累積釋放量均低于空白對照組，說明了氣泡石對豬糞的NH3和H2S有一定的除臭效果，其表現(xiàn)在：增加了豬糞發(fā)酵過程的含氧量，抑制厭氧菌產(chǎn)生各種臭氣，從而有效地減少了豬糞發(fā)酵過程中NH3和H2S的釋放量。

圖6 氣泡石NH3釋放量曲線圖

圖7 氣泡石H2S釋放量曲線圖

3 討論

3.1 臭氣來源及除臭效果評價

堆肥產(chǎn)生的臭氣包括NH3、H2S和揮發(fā)性有機(jī)化合物等，其中NH3產(chǎn)生量較大[14-16]。黃旺州[17]研究顯示，添加15%鋸末的牛糞在降解過程中抑制了NH3釋放（P＜0.01）。陳麗園等[18]在除臭菌株篩選方面做了相關(guān)研究，篩選得到的菌株使NH3和H2S的釋放量降低67.95%和26.6%，抑制NH3釋放效果較明顯，但對H2S作用不明顯。

3.2 發(fā)酵菌株的篩選方法

初篩實(shí)驗(yàn)上，臭氣感官法首先被嘗試，這種方法被很多人運(yùn)用[19-20]，但是這種方法需要培訓(xùn)嗅辨員，在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)嗅辨效果不明顯，費(fèi)時費(fèi)力，于是又采用了氮源培養(yǎng)基選擇法[21-22]，這兩種方法結(jié)合的方式可以提高其準(zhǔn)確率，相對于精細(xì)地測量NH3和H2S可以縮短其檢測時間提高其實(shí)驗(yàn)效率。

3.3 基于氣泡石模式的發(fā)酵床技術(shù)

沈玉君等人[13]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)持續(xù)通氣NH3濃度最先降低至合理濃度，然而間斷通氣及不通氣都要遠(yuǎn)大于這個時間。在此次研究氣泡石對豬糞臭氣影響的實(shí)驗(yàn)中也得出了相同結(jié)論。氣泡石通氣具有保持溫度、能耗低、連續(xù)通氣等優(yōu)點(diǎn)，理論上能夠在提高床體含氧量與維持床體溫度兩者間達(dá)到一個平衡，并最終體現(xiàn)在進(jìn)一步減少臭氣釋放以及加速豬糞降解、腐熟上。關(guān)于氣泡石發(fā)酵床模式與基于機(jī)械翻耕的傳統(tǒng)發(fā)酵床模式在能耗成本、床體溫度變化、豬糞腐熟程度等方面的比較，需要在豬場進(jìn)行系統(tǒng)的實(shí)地評價。