芽孢桿菌對(duì)發(fā)酵大豆產(chǎn)生氨基酸和揮發(fā)性香氣成分的影響

張 妍，武俊瑞，曹承旭，邱博書，馬 穎，史海粟，楊 慧，烏日娜

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬是風(fēng)味獨(dú)特且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的發(fā)酵大豆類制品[1]。豆醬的風(fēng)味和品質(zhì)與其中發(fā)酵微生物密切相關(guān)[2]，利用對(duì)發(fā)酵有影響的優(yōu)勢(shì)微生物直接接種發(fā)酵，可在不損失營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味的前提下快速縮短豆醬發(fā)酵周期，對(duì)優(yōu)化豆醬發(fā)酵品質(zhì)具有十分重要的意義[3]。

現(xiàn)有研究報(bào)道豆醬發(fā)酵過程中主要微生物類群有霉菌、酵母菌和細(xì)菌[4-5]，Zhang Pengfei等[6]檢測(cè)到豆醬醬醅優(yōu)勢(shì)細(xì)菌中含有芽孢桿菌。實(shí)驗(yàn)室前期通過宏基因組學(xué)研究表明芽孢桿菌與氨基酸形成及香氣物質(zhì)產(chǎn)生具有一定關(guān)系[7-8]，且不同類別及不同含量的氨基酸對(duì)豆醬風(fēng)味物質(zhì)形成具有一定影響[9]。烏日娜等[10]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌可協(xié)助真菌分解大豆中的蛋白質(zhì)和淀粉。續(xù)丹丹等[11]認(rèn)為芽孢桿菌基本貫穿整個(gè)豆醬發(fā)酵過程[12]，參與物質(zhì)的分解代謝[13]。Kim等[14]認(rèn)為中國(guó)豆醬中芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)菌；Gao Xianli等[15]研究表明芽孢桿菌為發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌群；Lee等[16]通過一系列分析認(rèn)為脂肪酸代謝與芽孢桿菌密切相關(guān)。

本研究以傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中篩選出的具有較強(qiáng)產(chǎn)酶能力的芽孢桿菌作實(shí)驗(yàn)菌，探究芽孢桿菌對(duì)大豆發(fā)酵過程氨基酸和揮發(fā)性香氣成分的影響。通過大豆模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、游離氨基酸檢測(cè)[17]、頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）[18]和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[19]對(duì)芽孢桿菌發(fā)酵大豆樣品所產(chǎn)氨基酸和風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究，經(jīng)因子分析[20]，進(jìn)一步明確芽孢桿菌對(duì)大豆發(fā)酵樣品香氣成分具有的貢獻(xiàn)，對(duì)優(yōu)化發(fā)酵條件、提高發(fā)酵豆醬品質(zhì)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芽孢桿菌為本實(shí)驗(yàn)室前期從黑龍江佳木斯、大慶、齊齊哈爾和遼寧朝陽地區(qū)傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬中分離篩選所得9 株益生特性、產(chǎn)酶特性良好的菌株，編號(hào)為：JMS1-1、JMS1-3、JMS2-5、DQ1-1、DQ1-3、QQHE-2、QQHE-3、CY-1、CY-3。經(jīng)鑒定分別為枯草芽孢桿菌6 株、地衣芽孢桿菌1 株和解淀粉芽孢桿菌2 株，保藏于實(shí)驗(yàn)室菌種庫。

LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L，pH 7.2～7.4。

三氯乙酸（trichloroacetic acid solution，TCA）、茚三酮、氨基酸混合標(biāo)樣 德國(guó)Sykam公司；NaCl、胰蛋白胨、酵母浸粉、鹽酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8800全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；6890N-5973型GC-MS聯(lián)用儀 安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢桿菌發(fā)酵大豆樣品中游離氨基酸分析1.3.1.1 樣品的制備

參考胡美忠等[21]方法對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行活化，種子液按2%比例接種于LB培養(yǎng)基中。蒸餾水泡發(fā)1 d的豆子，去皮，取100 g處理好的豆子和5 mL蒸餾水于250 mL錐形瓶中，滅菌。以3%接種量將二代芽孢桿菌分別接種于已高溫滅菌的大豆中，做好標(biāo)記，37 ℃下每12 h扣瓶1 次，固態(tài)發(fā)酵5 d[22]。

1.3.1.2 樣品前處理

參考張苗等[23]TCA沉淀法和雙縮脲比色法對(duì)發(fā)酵樣品進(jìn)行測(cè)定。定容后的樣品于47 ℃超聲提取1 h，并以1 700 r/min離心30 min。取2 mL上清液至蒸發(fā)皿中蒸干，向其中加入0.02 mol/L鹽酸溶液2.5 mL，充分溶解后過濾，收集的液體即可作為待測(cè)液進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。

1.3.1.3 氨基酸含量計(jì)算

式中：Xi為樣品中游離氨基酸含量/（mg/g）；Ci為游離氨基酸檢測(cè)量/（nmol/mL）；F為稀釋倍數(shù)；V為體積/mL；M為氨基酸分子質(zhì)量/（g/mol）；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.2 芽孢桿菌發(fā)酵大豆樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

1.3.2.1 發(fā)酵樣品揮發(fā)性風(fēng)味化合物萃取

稱取每種芽孢桿菌發(fā)酵大豆樣品5 g充分研磨至10 mL頂空瓶底部。對(duì)萃取針頭進(jìn)行老化，以確保除去可能吸附的揮發(fā)性成分，將老化好的萃取針頭插入頂空瓶中，通過手柄推出石英纖維頭，使其暴露在頂空瓶頂空氣體中，將頂空瓶放入恒溫60 ℃水浴中萃取30 min。用手柄將石英纖維頭推回針頭內(nèi)并拔出，然后插入GC-MS儀進(jìn)樣器中，同時(shí)啟動(dòng)儀器收集數(shù)據(jù)。

1.3.2.2 GC-MS分析條件

色譜條件：DB-5MS[24]彈性毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）。進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣He，流速1.0 mL/min。由室溫升至80 ℃保持2 min，然后以4 ℃/min升至180 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，降溫至80 ℃，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：離子源在225 ℃全掃描，電離方式為電子電離源，電子能量70 eV；掃描質(zhì)量范圍m/z33～450。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010、Xcalibur和SPSS 17.0軟件系統(tǒng)對(duì)發(fā)酵樣品中各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用面積歸一化法對(duì)檢測(cè)出的化合物相對(duì)含量進(jìn)行確定。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵大豆樣品中游離氨基酸分析

以高溫滅菌未接種芽孢桿菌且發(fā)酵5 d的大豆作為空白大豆對(duì)照組；以傳統(tǒng)工藝發(fā)酵成熟豆醬樣品作為發(fā)酵成熟豆醬對(duì)照組。分別對(duì)9 份接種芽孢桿菌大豆發(fā)酵樣品和2 份對(duì)照組樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。

表1 發(fā)酵大豆樣品中各游離氨基酸含量Table 1 Free amino acid contents in fermented soybeans

從表1可以看出，在芽孢桿菌發(fā)酵大豆樣品中共檢測(cè)出17 種游離氨基酸，不同菌株發(fā)酵樣品間含量差異較大。總游離氨基酸含量由高到低依次為JMS1-1＞JMS2-5＞DQ1-1＞DQ1-3＞QQHE-3＞JMS1-3＞QQHE-2＞CY1＞CY3，JMS1-1發(fā)酵樣品游離總氨基酸含量為12.98 mg/g，明顯高于其他8 株發(fā)酵樣品，是空白大豆對(duì)照組的8 倍，是傳統(tǒng)發(fā)酵成熟豆醬對(duì)照組的42.53%。發(fā)酵樣品中檢測(cè)出的天冬氨酸和谷氨酸是豆醬形成鮮味的主要氨基酸，發(fā)酵樣品鮮味氨基酸平均值占發(fā)酵成熟豆醬樣品23.95%；蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸和丙氨酸是形成甜味的主要氨基酸；組氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸、精氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸是具有微苦的物質(zhì)，苦味形成相關(guān)氨基酸所占比重最大，平均值是發(fā)酵成熟豆醬對(duì)照組的40.92%；賴氨酸、脯氨酸和半胱氨酸為非呈味氨基酸。由表1可知，芽孢桿菌發(fā)酵大豆樣品中，產(chǎn)生苦味和無味氨基酸比重大，鮮味氨基酸其次，甜味氨基酸最少。由于必需氨基酸對(duì)人體至關(guān)重要，對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行整理發(fā)現(xiàn)，9 份樣品必需氨基酸平均值為2.48 mg/g，是發(fā)酵成熟豆醬對(duì)照組的31.55%，所占比值較大，推斷芽孢桿菌發(fā)酵大豆樣品可產(chǎn)生較多的必需氨基酸，提升豆醬的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。其中JMS1-1發(fā)酵樣品必需氨基酸含量最高，為5.23 mg/g，是發(fā)酵成熟豆醬對(duì)照組的66.54%。

表2 發(fā)酵組和空白大豆對(duì)照組方差分析Table 2 Analysis of variance for fermented and unfermented soybeans

對(duì)上述所得發(fā)酵組與空白組數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著差異分析，結(jié)果如表2所示。F=31.351 57＞F0.01（1,78），說明芽孢桿菌發(fā)酵樣品相對(duì)于空白大豆發(fā)酵樣品所產(chǎn)生氨基酸差異極顯著。

綜合上述結(jié)果，得出5 株芽孢桿菌在大豆發(fā)酵過程中對(duì)氨基酸形成起促進(jìn)作用的優(yōu)勢(shì)菌株，分別為枯草芽孢桿菌JMS1-1、JMS2-5、DQ1-1、DQ1-3菌株和地衣芽孢桿菌QQHE-3菌株，進(jìn)一步對(duì)其揮發(fā)性成分種類含量進(jìn)行測(cè)定。

2.2 發(fā)酵大豆樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分分析

采用HS-SPME-GC-MS對(duì)上述5 株芽孢桿菌發(fā)酵樣品揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行分析，得到總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 芽孢桿菌產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of flavor substances produced by Bacillus

由圖1可看出，5 株芽孢桿菌發(fā)酵樣品產(chǎn)物的色譜圖極為相似，發(fā)酵產(chǎn)物的出峰時(shí)間和峰的強(qiáng)度一致，說明5 株芽孢桿菌產(chǎn)物大致相同。將所得總離子流色譜圖，經(jīng)質(zhì)譜檢索分析后，得出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及相對(duì)含量，如表3所示。

表3 芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中鑒定出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及相對(duì)含量Table 3 Volatile flavor substances and their relative contents identified in Bacillus fermented soybeans%

續(xù)表3

由表3可知，不同芽孢桿菌發(fā)酵樣品所產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量和組成不同，相對(duì)含量由22.34%～75.77%不等。在5 株芽孢桿菌發(fā)酵大豆樣品中共檢測(cè)出71 種香氣成分，包含10 種酯類、13 種醇類、6 種醛類、11 種烷類、8 種酸類、5 種酮類和18 種其他類化合物。

5 份發(fā)酵樣品中，酯類物質(zhì)[25]含量最多的為JMS2-5和DQ1-1，物質(zhì)相對(duì)含量為10.34%和18.85%，醇類物質(zhì)相對(duì)含量為21.37%、48.64%、40.52%、5.9%和12.35%。酯、醇類化合物是豆醬發(fā)酵過程中重要的香氣成分，5 份樣品中乙酸己酯和1-辛烯-3-醇均有檢出，但含量各不相同。

5 份發(fā)酵樣品中，酮類物質(zhì)是醛類形成的前體物質(zhì)，醛可被還原生成醇和酯等化合物[26]。QQHE-3產(chǎn)醛類物質(zhì)含量最多，相對(duì)含量為7.50%；DQ1-1產(chǎn)酮類物質(zhì)較多，相對(duì)含量為8.06%。在5 株芽孢桿菌發(fā)酵樣品中均有檢出的烷類化合物分別為六甲基環(huán)三硅氧烷、八甲基環(huán)四硅氧烷、十甲基環(huán)五硅氧烷和十二甲基環(huán)六硅氧烷，DQ1-3菌株發(fā)酵樣品中含量最高的烷類化合物，相對(duì)含量分為36.12%。龐惟俏等[27]認(rèn)為發(fā)酵過程產(chǎn)生的烷烴類化合物可能是微生物的代謝產(chǎn)物，或大豆原料中含有的物質(zhì)。苯酚類化合物在4 株發(fā)酵樣品中均被檢測(cè)出，其中JMS2-5菌株所產(chǎn)相對(duì)含量相比于其他菌株含量較高，含氮類化合物2-正戊基呋喃在4 株發(fā)酵樣品中均被檢測(cè)且相對(duì)含量較高，苗志偉等[28]認(rèn)為這種物質(zhì)為常見的傳統(tǒng)豆醬香氣成分。愈創(chuàng)木酚作為豆醬中常見的香氣物質(zhì)，在JMS2-5、DQ1-1和DQ1-3中均有檢出。綜上所述，5 株芽孢桿菌發(fā)酵大豆樣品所產(chǎn)揮發(fā)性香氣成分具有差異，但有利于豆醬風(fēng)味物質(zhì)的形成。

2.3 發(fā)酵大豆樣品產(chǎn)生的香氣成分因子分析

2.3.1 KMO和Bartlett球形檢驗(yàn)

為確定不同菌株發(fā)酵大豆所產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣成分?jǐn)?shù)據(jù)是否適宜進(jìn)行因子分析，首先對(duì)KMO和Bartlett球形檢驗(yàn)進(jìn)行分析，如表4所示。KMO值為0.760，數(shù)值在0.5～1之間且接近于1，表明變量間的相關(guān)性較大。Bartlett球形檢驗(yàn)，P=0.000＜0.005，說明數(shù)據(jù)滿足正態(tài)總體分布。因此，芽孢桿菌發(fā)酵大豆所產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣成分?jǐn)?shù)據(jù)可進(jìn)行因子分析。

表4 KMO和Bartlett球形檢驗(yàn)Table 4 KMO and Bartlett test

2.3.2 芽孢桿菌發(fā)酵大豆香氣成分因子分析

用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行因子分析，由表5可知，前2個(gè)因子不旋轉(zhuǎn)時(shí)因子貢獻(xiàn)率分別為54.857%和29.929%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到84.786%＞80%，特征值分別為3.840和2.095均大于1，說明這2 個(gè)因子包含7 類香氣成分信息[20]，因此，提取2 個(gè)公因子較為合適。

表5 優(yōu)勢(shì)菌接種大豆醬香氣成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 5 Eigenvalues and variance contributions of aroma components of Bacillus fermented soybeans

由于因子意義不明，本研究采用方差正交旋轉(zhuǎn)因子模型法，對(duì)初始因子進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，得到因子載荷矩陣和因子得分系數(shù)矩陣（表6）。由旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣可以看出，第1公因子酯類（X1）、醇類（X2）、醛類（X3）和烷類（X4）載荷較大，說明這4 類化合物具有較強(qiáng)相關(guān)性，也表示芽孢桿菌發(fā)酵大豆樣品所產(chǎn)生的香氣成分，酯、醇和醛3 種物質(zhì)為芽孢桿菌發(fā)酵大豆樣品中主要香氣成分。第2公因子酸類（X5）、酮類（X6）和其他類（X7）載荷較大，這幾類在發(fā)酵過程中比重較小，但可起自身獨(dú)特作用豐富豆醬風(fēng)味。根據(jù)旋轉(zhuǎn)后因子得分系數(shù)矩陣，建立因子得分模型F1、F2。

表6 旋轉(zhuǎn)后的載荷矩陣和因子得分系數(shù)矩陣Table 6 Loading and component score coefficient matrix after rotation

2.3.3 芽孢桿菌發(fā)酵大豆香氣成分綜合評(píng)價(jià)

單獨(dú)使用因子F1或因子F2并不能對(duì)芽孢桿菌發(fā)酵大豆香氣成分作出綜合評(píng)價(jià)，因此，按各公因子對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)數(shù)計(jì)算綜合統(tǒng)計(jì)量為：F=0.544 72F1＋0.303 14F2。

最后根據(jù)所求F值對(duì)不同芽孢桿菌發(fā)酵的大豆進(jìn)行排序，見表7。不同芽孢桿菌發(fā)酵的大豆所產(chǎn)香氣因子分析排序?yàn)椋篋Q1-1＞JMS2-5＞DQ1-3＞JMS1-1＞QQHE-3。

表7 因子綜合得分Table 7 Synthetic factor scores of Bacillus fermented soybeans

3 討 論

芽孢桿菌具有很強(qiáng)的分解能力，它可以在增殖的同時(shí)，釋放出蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶等，這些可將大分子物質(zhì)分解成有利用價(jià)值的小分子物質(zhì)[29]。經(jīng)芽孢桿菌發(fā)酵的大豆樣品中游離氨基酸含量明顯升高，9 份發(fā)酵樣品總游離氨基酸平均值比空白大豆對(duì)照組高出4 倍以上，推測(cè)芽孢桿菌的添加通過酶的效果可以使大豆蛋白質(zhì)分解并轉(zhuǎn)化為游離氨基酸。芽孢桿菌發(fā)酵樣品產(chǎn)生揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分較多，其中，酯、醇類化合物含量較高，檢測(cè)到存在十六烷酸甲酯，有研究表明這種酯類物質(zhì)對(duì)豆醬風(fēng)味穩(wěn)定性具有貢獻(xiàn)[27]。發(fā)酵樣品中檢測(cè)出的3-羥基-2-丁酮物質(zhì)，有報(bào)道表明在豆醬、醬油以及日本味增等發(fā)酵產(chǎn)品中被檢出過，且為一種常見的風(fēng)味物質(zhì)[30]。產(chǎn)生的苯酚和愈創(chuàng)木酚等物質(zhì)是豆醬風(fēng)味形成中常見的香氣物質(zhì)。5 份芽孢桿菌發(fā)酵樣品中乙酸己酯和1-辛烯-3-醇均有檢出，推測(cè)這2 種物質(zhì)與芽孢桿菌發(fā)酵的大豆樣品具有一定相關(guān)性。因此，推斷芽孢桿菌對(duì)大豆發(fā)酵過程游離氨基酸及風(fēng)味物質(zhì)的形成具有影響。

從總游離氨基酸含量可以看出，9 份發(fā)酵樣品游離氨基酸含量不同，推測(cè)不同芽孢桿菌分解產(chǎn)生游離氨基酸量的能力存在差異。發(fā)酵樣品產(chǎn)生呈味氨基酸差異較大，苦味氨基酸含量高于其他呈味氨基酸含量。在成熟豆醬對(duì)照組中甜味氨基酸含量較多，因此，推測(cè)在發(fā)酵后期甜味氨基酸形成較多。發(fā)酵樣品中異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸，這3 種必需氨基酸含量平均值大于發(fā)酵成熟豆醬對(duì)照組，推斷芽孢桿菌發(fā)酵大豆樣品可產(chǎn)生較多的必需氨基酸，提升豆醬的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。5 份芽孢桿菌發(fā)酵樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量差異較大，推測(cè)不同菌株產(chǎn)香氣能力存在較大差異，發(fā)現(xiàn)4 份發(fā)酵樣品產(chǎn)醇類化合物最多，而QQHE-3發(fā)酵樣品產(chǎn)醛類化合物最多。芽孢桿菌的添加可產(chǎn)生不同種類含量化合物，這些化合物共同作用使整體香氣協(xié)調(diào)，這與張鵬飛等[1]認(rèn)為傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中酯、醇、醛、酸、酮等物質(zhì)是豆醬香氣形成的主要成分觀點(diǎn)一致。

4 結(jié) 論

綜上所述，采用氨基酸自動(dòng)分析儀、GC-MS聯(lián)用儀對(duì)芽孢桿菌發(fā)酵的大豆樣品中游離氨基酸和揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行測(cè)定，共檢測(cè)出17 種游離氨基酸和71 種揮發(fā)性香氣成分。然而，不同芽孢桿菌菌株間存在個(gè)體差異，JMS1-1菌株發(fā)酵樣品產(chǎn)總游離氨基酸和必需氨基酸含量最多，分別是發(fā)酵成熟豆醬對(duì)照組的42.53%和66.54%，DQ1-1菌株發(fā)酵樣品產(chǎn)香綜合因子得分最高。各發(fā)酵樣品中均有乙酸己酯和1-辛烯-3-醇檢出，而豆醬風(fēng)味形成常見的香氣物質(zhì)苯酚和愈創(chuàng)木酚也被檢出。因此，推斷芽孢桿菌對(duì)大豆發(fā)酵過程游離氨基酸及風(fēng)味物質(zhì)的形成均發(fā)揮著重要的作用。進(jìn)一步因子分析，認(rèn)為酯、醇和醛3 類物質(zhì)為芽孢桿菌發(fā)酵大豆樣品中主要香氣成分，這可為生產(chǎn)加工具有良好風(fēng)味的發(fā)酵豆制品，提供參考。