基于代謝標(biāo)志物快速檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌

胡凱麗，李延梅，陳 娟，唐俊妮，馬欣玥

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）廣泛存在于自然界中，如空氣、水、人和動(dòng)物的排泄物中等[1]。人和動(dòng)物的皮膚、黏膜，特別是鼻咽部帶菌率均較高，30%～80%的人群為該病原菌的攜帶者，因此S.aureus污染食品的幾率較大[2]。S.aureus易污染的食品主要有奶、肉、蛋、魚及其制品，是引起食物中毒的主要病原菌之一[3-5]。Chang Yanzi等[6]在2010—2014年期間對(duì)來自于中國不同地區(qū)的3 476 份食物樣品進(jìn)行分離，鑒定出336 株S.aureus，檢出率為9.67%。李自然等[7]采集上海市各類食品進(jìn)行S.aureus的分離和鑒定表明，505 份食品樣品中共有117 份檢出S.aureus，平均檢出率為23.2%。其中，240 份生牛乳樣品中有63 份檢出S.aureus，檢出率為26.3%；70 份生鮮肉樣品中，有23 份檢出S.aureus，檢出率為32.9%。容冬麗等[8]利用定性和定量法對(duì)我國15 個(gè)代表性城市采集的540 份即食食品和蔬菜樣品進(jìn)行S.aureus檢測(cè)，共檢出陽性樣品50 份，平均污染率為9.3%，其中鹵肉（16.3%）污染率最高，其次是烤肉9.2%，蔬菜（4.0%）污染率最低。

快速準(zhǔn)確檢測(cè)S.aureus是預(yù)防其大規(guī)模食物中毒爆發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前對(duì)S.aureus的檢測(cè)方法主要包括細(xì)菌培養(yǎng)法[9-10]、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)[11]和基于特異性基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)方法[12-13]。細(xì)菌培養(yǎng)法和免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)存在耗時(shí)費(fèi)力、操作繁瑣等缺點(diǎn)。傳統(tǒng)的PCR技術(shù)不易區(qū)分死活菌，容易造成假陽性的結(jié)果。開發(fā)準(zhǔn)確快速的S.aureus活菌檢測(cè)技術(shù)至關(guān)重要。隨著分析化學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，挖掘各種微生物的特征性代謝產(chǎn)物目前已成為病原微生物快速檢測(cè)和鑒定研究的一個(gè)重要方向[14-16]。細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物是由復(fù)雜的揮發(fā)性化學(xué)成分組成，包括各種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)和不同極性的揮發(fā)性化合物。盡管某些種或?qū)俚募?xì)菌被發(fā)現(xiàn)存在著交迭的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物類型，但每個(gè)種或?qū)俚募?xì)菌都有著獨(dú)特的代謝方式，典型的揮發(fā)性成分和揮發(fā)性特征必定是種或?qū)偎赜械?，可以視為鑒別的生物標(biāo)志[17-18]。Filipiak等[19]在研究S.aureus胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)物時(shí)，檢測(cè)到3-甲基丁醛和3-甲基丁酸的含量較高。Tait等[20]在胰蛋白胨大豆肉湯、腦心浸出液肉湯和EF肉湯中分別接種S.aureus、大腸桿菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯菌，在S.aureus的培養(yǎng)物中檢測(cè)到3-甲基丁醛和3-甲基丁酸，而在其他2 種菌的培養(yǎng)物中均未檢出。Bos等[21]對(duì)S.aureus、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌和E.coli 6 種致病菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物比較分析證實(shí)，3-甲基丁醛和3-甲基丁酸是S.aureus的特征代謝產(chǎn)物。Chen Juan等[22]在胰蛋白胨大豆肉湯中接種E.coli O157:H7、腸炎沙門氏菌、單核細(xì)胞性李斯特菌、福氏志賀氏菌和S.aureus，只有S.aureus檢出了3-甲基丁醛和3-甲基丁酸。這些研究均表明，3-甲基丁醛和3-甲基丁酸可以作為S.aureus的候選檢測(cè)標(biāo)志物。

本研究參考GB 4789.10—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》中S.aureus的培養(yǎng)條件，以7.5%NaCl肉湯為前增菌培養(yǎng)基，考察了S.aureus代謝產(chǎn)物3-甲基丁醛和3-甲基丁酸的特異性和穩(wěn)定性，進(jìn)一步將代謝標(biāo)志物應(yīng)用于真實(shí)食物樣品的檢測(cè)中，比較代謝標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)與常規(guī)檢測(cè)技術(shù)結(jié)果的符合率，為開發(fā)基于代謝標(biāo)志物檢測(cè)食品中S.aureus活菌技術(shù)打下了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

S.aureus參考菌株（ATCC 6538，ATCC 43300）、E.coli O157:H7參考菌株（CICC 21530）、腸炎沙門氏菌參考菌株（Salmonella enteritidisCICC 21482）。S.aureus分離菌株（編號(hào)分別為127、134、137、140、Y4、B83、H5和F19），采用S.aureus 16S rDNA特異性引物PCR擴(kuò)增鑒定。上述菌株保存于西南民族大學(xué)食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 材料與培養(yǎng)基

生鮮豬瘦肉購于成都各超市、菜市場(chǎng)、便利店；生牛乳采集于成都市青白江區(qū)散養(yǎng)牛場(chǎng)；米飯購于成都各單位食堂、飯店、外賣。

Baird-Parker（BP）瓊脂基礎(chǔ)、改良山梨醇麥康凱（modified sorbitol maconkey agar，CT-SMAC）瓊脂基礎(chǔ)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（xylose lysine deoxycholate agar，XLD）瓊脂、亞碲酸鹽卵黃增菌液、CT-SMAC添加劑、7.5% NaCl肉湯、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB） 青島海博生物技術(shù)有限公司；TaqPCR Master Mix（2X with Blue Dye）、DL2000 Marker、TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L pH 8.0乙二胺四乙酸二鈉鹽） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace DSQ型氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀（配置Triplus自動(dòng)進(jìn)樣器） 美國Thermo公司；MOF-4086S低溫冰箱、MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；GHP-9280隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HZQ-F160恒溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司；Galanz WD800B型微波爐 廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 S.aureus揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的特異性分析

分別從BP平板、CT-SMAC平板和XLD平板上挑取S.aureus 6538、E.coliO157:H7 21530和S.enteritidis 21482典型菌落接入5 mL TSB培養(yǎng)基中，于（36±1）℃、200 r/min條件下培養(yǎng)13 h。然后，將這些新鮮培養(yǎng)物進(jìn)行梯度稀釋至10－5，分別吸取S.aureus 6538菌懸液240 μL、E.coliO157:H7 21530菌懸液120 μL和S.enteritidis 21482菌懸液120 μL各接入400 mL無菌7.5% NaCl肉湯中，使初始接種量均為100～200 CFU/mL，于（36±1）℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12、16、20、24 h，取樣測(cè)定揮發(fā)性代謝標(biāo)記物。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3 個(gè)平行樣品，進(jìn)行2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 S.aureus單獨(dú)培養(yǎng)

分別從BP平板上挑取S.aureus 6538、43300、127、134、137、140、Y4、B83、H5和F19的典型菌落接入5 mL TSB培養(yǎng)基中，于（36±1）℃、200 r/min條件下培養(yǎng)13 h。然后，將這些新鮮培養(yǎng)物進(jìn)行梯度稀釋至10－5，吸取S.aureus菌懸液240 μL接入400 mL無菌7.5% NaCl肉湯中，使S.aureus初始接種量為100～200 CFU/mL，于（36±1）℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。每隔2 h取樣測(cè)定揮發(fā)性代謝標(biāo)記物和S.aureus的生長數(shù)量，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3 個(gè)平行樣品。以不接種S.aureus的7.5% NaCl肉湯為空白樣品。進(jìn)行2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 S.aureus與E.coli混合培養(yǎng)

分別從BP平板、CT-SMAC平板挑取S.aureus 6538和E.coli O157:H7 21530典型菌落接入5 mL TSB中，于（36±1）℃、200 r/min條件下培養(yǎng)13 h。然后，將S.aureus 6538和E.coli O157:H7 21530新鮮培養(yǎng)物進(jìn)行梯度稀釋至10－5，分別吸取S.aureus 6538菌懸液240 μL和E.coli O157:H7 21530菌懸液120 μL同時(shí)接入400 mL無菌7.5% NaCl肉湯中，使S.aureus 6538和E.coli O157:H7 21530初始接種量均為100～200 CFU/mL（S.aureus 6538與E.coli O157:H7 21530比例1∶1）；將S.aureus 6538新鮮培養(yǎng)物梯度稀釋至10－5、E.coli O157:H7 21530新鮮培養(yǎng)物梯度稀釋至10－4，分別吸取10－5S.aureus 6538菌懸液240 μL和10－4E.coli O157:H7 21530菌懸液120 μL同時(shí)接入400 mL無菌7.5% NaCl肉湯中，使S.aureus 6538初始接種量為100～200 CFU/mL，E.coli O157:H7 21530初始接種量為1 000～2 000 CFU/mL（S.aureus 6538與E.coli O157:H7 21530比例1∶10）；將S.aureus 6538新鮮培養(yǎng)物梯度稀釋至10－5、E.coli O157:H7 21530新鮮培養(yǎng)物梯度稀釋至10－3，分別吸取10－5S.aureus 6538菌懸液240 μL和10－3E.coli O157:H7 21530菌懸液120 μL同時(shí)接入400 mL無菌7.5% NaCl肉湯中，使S.aureus 6538初始接種量為100～200 CFU/mL，E.coli O157:H7 21530初始接種量為10 000～20 000 CFU/mL（S.aureus 6538與E.coli O157:H7 21530比例1∶100）。于（36±1）℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣測(cè)定揮發(fā)性代謝標(biāo)記物和S.aureus 6538的生長數(shù)量，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3 個(gè)平行。以不接種S.aureus 6538和E.coli O157:H7 21530的7.5% NaCl肉湯為空白樣品。進(jìn)行2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 S.aureus與S.enteritidis混合污染

同1.3.3節(jié)。

1.3.5 S.aureus、E.coli和S.enteritidis混合污染

使S.aureus 6538、E.coli O157:H7 21530和S.enteritidis 21482的初始接種量分別為100～200 CFU/mL（接種比例1∶1∶1），其他操作同1.3.3節(jié)。

1.3.6 代謝標(biāo)志物檢測(cè)食物樣品中S.aureus

取豬精瘦肉、生牛乳、米飯各20 份，每份樣品25 g。將樣品轉(zhuǎn)移至225 mL無菌7.5% NaCl肉湯中，均質(zhì)。于（36±1）℃、200 r/min條件下增菌培養(yǎng)至20 h，分別取樣進(jìn)行揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析、BP平板培養(yǎng)以及細(xì)菌PCR鑒定，每份樣品做3 個(gè)平行。分別以不培養(yǎng)的豬肉、生牛乳和米飯為空白樣品（0 h的樣品）。

1.3.7 揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的測(cè)定

1.3.7.1 萃取條件

采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在80 ℃預(yù)孵化10 min，萃取30 min[23]。

1.3.7.2 氣相色譜條件

TR-FFAP色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；不分流模式，不分流1 min之后分流比為50∶1；流速1 mL/min；升溫程序：40 ℃保持3 min，7 ℃/min升溫至220 ℃并保持2 min；載氣為99.999%氦氣；進(jìn)樣口溫度230 ℃；解吸時(shí)間2 min。

1.3.7.3 質(zhì)譜定性條件

電子電離源，電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度220 ℃；選擇離子流掃描模式，參數(shù)見表1。

表1 選擇離子流掃描參數(shù)Table 1 Parameters for selective ion flow scan

1.3.8 細(xì)菌生長數(shù)量的測(cè)定

吸取1 mL 7.5% NaCl肉湯培養(yǎng)物，經(jīng)10 倍梯度稀釋至適宜的稀釋度，吸取1 mL于滅菌平板中，倒入冷卻至50 ℃左右的BP培養(yǎng)基，混搖均勻，置于（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3 個(gè)平行樣品，進(jìn)行2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.9 S.aureus的PCR鑒定

DNA提?。何∨囵B(yǎng)20 h的7.5% NaCl肉湯培養(yǎng)物1 mL于1.5 mL的EP管中，4 ℃、12 000 r/min離心2 min，收集菌體；加入適量TE緩沖溶液充分洗滌菌體，離心棄上清；加入1 mL的TE緩沖溶液重懸菌體，渦旋使菌體充分混勻；采用微波爐（額定微波頻率2.45 GHz，最大輸出功率800 W）加熱2 min，離心取上清液，－20 ℃保存。

PCR擴(kuò)增體系：TaqPCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.8 μL，DNA模板0.4 μL，滅菌的dd H2O補(bǔ)足20 μL體系。用S.aureus 16S rDNA特異性引物（S.aureus 16S rDNA）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為（5’-3’）F-GTGCACATCTTGACGGTACC、R-CGAAGGGGAAGGCTCTATC，Tm值為60 ℃，產(chǎn)物理論長度為565 bp[24]。

PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測(cè)：配制1%瓊脂糖凝膠，取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，80 V電泳45 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察與儲(chǔ)存電泳圖片。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 S.aureus揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的特異性

表27.5% NaCl肉湯中3-甲基丁醛的檢測(cè)結(jié)果Table 2Detection results of 3-methyl-butanal in 7.5% NaCl broth at different culture times

圖17.5% NaCl中3-甲基丁醛提取離子流色譜圖Fig.1 Extraction ion chromatograms of 3-methyl-butanal in 7.5% NaCl broth at different culture times

保留時(shí)間2.97～2.99 min為3-甲基丁醛。由表2和圖1可見，以不接種S.aureus的7.5% NaCl肉湯為空白樣品，與接種了S.aureus的7.5% NaCl肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行比較，空白樣品和培養(yǎng)樣品均檢出了一定強(qiáng)度的3-甲基丁醛，但是當(dāng)培養(yǎng)樣品檢出強(qiáng)度扣除空白樣品檢出強(qiáng)度以后，3-甲基丁醛沒有表現(xiàn)出凈增長。說明S.aureus沒有產(chǎn)生高于空白的3-甲基丁醛信號(hào)，不能作為檢測(cè)標(biāo)志物。

表37.5% NaCl肉湯中3-甲基丁酸的檢測(cè)結(jié)果Table 3Detection results of 3-methyl-butyric acid in 7.5% NaCl broth at different culture times

圖27.5% NaCl中3-甲基丁酸提取離子流色譜圖Fig.2 Extraction ion chromatograms of 3-methyl-butyric acid in 7.5% NaCl broth at different culture times

保留時(shí)間17.12～17.14 min為3-甲基丁酸。由表3和圖2可知，在7.5% NaCl肉湯中，培養(yǎng)至第12、16、20、24小時(shí)只有S.aureus能檢出3-甲基丁酸，E.coli O157:H7和S.enteritidis都沒有檢出3-甲基丁酸。因此，3-甲基丁酸可以作為S.aureus的特征揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。

2.2 S.aureus揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性

2.2.1 不同S.aureus單獨(dú)培養(yǎng)

圖3 不同S.aureus菌株3-甲基丁酸的釋放規(guī)律Fig.3 Release of 3-methyl-butyric acid from different S.aureus strains

圖4 不同S.aureus的菌體生長情況Fig.4 Growth rates of different S.aureus strains

由圖3、4可知，在7.5% NaCl肉湯中，10 株S.aureus單獨(dú)生長6～10 h 3-甲基丁酸信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)首次顯著增長（P＜0.05），對(duì)應(yīng)的菌體生長量在5×105～3.25×109CFU/mL。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，3-甲基丁酸響應(yīng)強(qiáng)度呈現(xiàn)持續(xù)增長，第24小時(shí)達(dá)到最大值4.29×107～1.68×108，對(duì)應(yīng)的菌體生長量為0.86×1013～1.21×1013CFU/mL。其中，第24小時(shí)S.aureus 6538產(chǎn)生的3-甲基丁酸響應(yīng)強(qiáng)度為1.09×108，菌體生長量為9.55×1012CFU/mL。

2.2.2 S.aureus和E.coli混合培養(yǎng)

2.2.2.1 S.aureus和E.coli（1∶1）混合培養(yǎng)

由圖5可知，在7.5% NaCl肉湯中，S.aureus 6538和E.coli O157:H7 21530（1∶1）混合生長至第14小時(shí)3-甲基丁酸信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)首次顯著增長（P＜0.05），之后逐漸上升，第24小時(shí)達(dá)到3.36×107，略低于S.aureus單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)3-甲基丁酸的信號(hào)強(qiáng)度。S.aureus的菌體最終生長量達(dá)到8.95×1012CFU/mL，與S.aureus 6538單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)菌體生長量相近。

圖5 S.aureus和E.coli（1∶1）混合培養(yǎng)時(shí)菌體生長與3-甲基丁酸釋放規(guī)律Fig.5 Bacterial growth and release of 3-methyl-butyric acid from S.aureus when co-cultured with E.coli O157:H7 (1:1)

2.2.2.2 S.aureus和E.coli（1∶10）混合培養(yǎng)

圖6 S.aureus和E.coli（1∶10）混合培養(yǎng)時(shí)菌體生長與3-甲基丁酸釋放規(guī)律Fig.6 Bacterial growth and release of 3-methyl-butyric acid from S.aureus when co-cultured with E.coli O157:H7 (1:10)

由圖6可知，在7.5% NaCl肉湯中，S.aureus 6538和E.coli O157:H7 21530（1∶10）混合生長至第12小時(shí)3-甲基丁酸信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)首次顯著增長（P＜0.05），之后逐漸上升，第24小時(shí)達(dá)到2.72×107，略低于S.aureus單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)3-甲基丁酸的信號(hào)強(qiáng)度。S.aureus 6538的菌體最終生長量達(dá)到8.35×1012CFU/mL，與S.aureus 6538單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)菌體生長量相近。

2.2.2.3 S.aureus和E.coli（1∶100）混合培養(yǎng)

圖7 S.aureus和E.coli（1∶100）混合培養(yǎng)時(shí)菌體生長與3-甲基丁酸釋放規(guī)律Fig.7 Bacterial growth and release of 3-methyl-butyric acid fromS.aureus when co-cultured with E.coli O157:H7 (1:100)

由圖7可知，在7.5% NaCl肉湯中，S.aureus 6538和E.coli O157:H7 21530（1∶100）混合生長至第14小時(shí)3-甲基丁酸信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)首次顯著增長（P＜0.05），之后逐漸上升，第24小時(shí)達(dá)到5.21×107，略低于S.aureus單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)3-甲基丁酸的信號(hào)強(qiáng)度。S.aureus 6538的菌體最終生長量達(dá)到9.05×1012CFU/mL，與S.aureus 6538單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)菌體生長量相近。

2.2.3 S.aureus和S.enteritidis混合培養(yǎng)

2.2.3.1 S.aureus和S.enteritidis（1∶1）混合培養(yǎng)

圖8 S.aureus和S.enteritidis（1∶1）混合培養(yǎng)時(shí)菌體生長與3-甲基丁酸釋放規(guī)律Fig.8 Bacterial growth and release of 3-methyl-butyric acid from S.aureus when co-cultured with S.enteritidis (1:1)

由圖8可知，在7.5% NaCl肉湯中，S.aureus 6538和S.enteritidis 21482（1∶1）混合生長至第12小時(shí)3-甲基丁酸信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)首次顯著增長（P＜0.05），之后逐漸上升，第24小時(shí)達(dá)到9.7×107，與S.aureus 6538單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)3-甲基丁酸的釋放量相似。S.aureus 6538的菌體最終生長量可以達(dá)到7×1011CFU/mL，略低于S.aureus 6538單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)菌體生長量。

2.2.3.2 S.aureus和S.enteritidis（1∶10）混合培養(yǎng)

圖9 S.aureus和S.enteritidis（1∶10）混合培養(yǎng)時(shí)菌體生長與3-甲基丁酸釋放規(guī)律Fig.9 Bacterial growth and release of 3-methyl-butyric acid fromS.aureus when co-cultured with S.enteritidis (1:10)

由圖9可知，在7.5% NaCl肉湯中，S.aureus 6538和S.enteritidis 21482（1∶10）混合生長至第12小時(shí)3-甲基丁酸信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)首次顯著增長（P＜0.05），之后逐漸上升，第24小時(shí)達(dá)到4.66×107，略低于S.aureus單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)3-甲基丁酸的信號(hào)強(qiáng)度。S.aureus 6538的菌體最終生長量可以達(dá)到4.91×1011CFU/mL，略低于S.aureus 6538單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)菌體生長量。

2.2.3.3 S.aureus和S.enteritidis（1∶100）混合培養(yǎng)

圖10 S.aureus和S.enteritidis（1∶100）混合培養(yǎng)時(shí)菌體生長與3-甲基丁酸釋放規(guī)律Fig.10 Bacterial growth and release of 3-methyl-butyric acid from S.aureus when co-cultured with S.enteritidis (1:100)

由圖10可知，在7.5% NaCl肉湯中，S.aureus 6538和S.enteritidis 21482（1∶100）混合生長至第12小時(shí)3-甲基丁酸信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)首次顯著增長（P＜0.05），之后逐漸上升，第24小時(shí)達(dá)到6.31×107，略低于S.aureus單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)3-甲基丁酸的信號(hào)強(qiáng)度。S.aureus 6538的菌體最終生長量可以達(dá)到4.36×1011CFU/mL，略低于S.aureus 6538單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)菌體生長量。

2.2.4 S.aureus、E.coli和S.enteritidis（1∶1∶1）混合培養(yǎng)

圖11 S.aureus、E.coli和S.enteritidis（1∶1∶1）混合培養(yǎng)時(shí)菌體生長與3-甲基丁酸釋放規(guī)律Fig.11 Bacterial growth and release of 3-methyl-butyric acid from S.aureus when co-cultured with E.coli O157:H7 and S.enteritidis (1:1:1)

由圖11可知，在7.5% NaCl肉湯中，S.aureus 6538、E.coli O157:H7和S.enteritidis 21482（1∶1∶1）混合生長至第12小時(shí)3-甲基丁酸信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)首次顯著增長（P＜0.05），之后逐漸上升，第24小時(shí)達(dá)到8.10×107，略低于S.aureus 6538單獨(dú)培養(yǎng)。S.aureus 6538最終菌體生長量可以達(dá)到4.73×1011CFU/mL。

2.3 食物樣品中S.aureus的檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 生鮮豬肉樣品中S.aureus檢出情況

由表4可知，采集的20 份生鮮豬肉樣品經(jīng)7.5% NaCl肉湯增菌培養(yǎng)20 h后，頂空固相微萃取-GC-MS的結(jié)果全部顯示檢出3-甲基丁酸，峰響應(yīng)強(qiáng)度在105～106。同時(shí)，對(duì)培養(yǎng)的菌液進(jìn)行PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)20 份樣品培養(yǎng)液基因組DNA全都能擴(kuò)增出S.aureus 16S rDNA特異性片段（圖12），表明所有樣品均為陽性。另外，BP平板培養(yǎng)結(jié)果也顯示全部檢出S.aureus，生長量在109～1011CFU/g?？梢钥闯鰝鹘y(tǒng)培養(yǎng)法、PCR法和基于揮發(fā)性代謝標(biāo)志物檢測(cè)方法對(duì)于生鮮豬肉樣品中S.aureus檢測(cè)所得結(jié)果一致，3 種方法結(jié)果之間的符合率為100%。

表4 生鮮豬肉樣品中S.aureus生長與代謝標(biāo)志物檢出情況Table 4 Growth and metabolic markers of inoculated S.aureus in fresh pork samples

圖12 生鮮豬肉樣品S.aureus 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.12 Electrophoresis patterns of 16S rDNA PCR amplification products from inoculated S.aureus in fresh pork samples

2.3.2 生牛乳樣品中S.aureus檢出情況

由表5可知，采集的20 份生牛乳樣品經(jīng)7.5% NaCl肉湯增菌培養(yǎng)20 h后，頂空固相微萃取-GC-MS的結(jié)果全部顯示檢出3-甲基丁酸，峰信號(hào)強(qiáng)度在105～106。同時(shí)，對(duì)培養(yǎng)的菌液進(jìn)行PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)20 份樣品培養(yǎng)液基因組DNA全都能擴(kuò)增出S.aureus16S rDNA特異性片段（圖13），表明所有樣品均為陽性。另外，BP平板培養(yǎng)結(jié)果也顯示全部檢出S.aureus，生長量在109～1011CFU/g?？梢钥闯鰝鹘y(tǒng)培養(yǎng)法、PCR法和基于揮發(fā)性代謝標(biāo)志物檢測(cè)方法對(duì)于生牛乳樣品中S.aureus檢測(cè)所得結(jié)果一致，3 種方法結(jié)果之間的符合率為100%。

表5 生牛乳樣品中S.aureus生長與代謝標(biāo)記物檢出情況Table 5 Growth and metabolic markers of inoculated S.aureus in raw milk samples

圖13 生乳樣品S.aureus 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.13 Electrophoresis patterns of 16S rDNA PCR amplification products from inoculated S.aureus in raw milk samples

2.3.3 米飯樣品中S.aureus檢出情況

由表6可知，采集的20 份米飯樣品經(jīng)7.5% NaCl肉湯增菌培養(yǎng)20 h后，9號(hào)樣品沒有檢出3-甲基丁酸，PCR結(jié)果也為陰性，傳統(tǒng)培養(yǎng)法也沒有檢出S.aureus，說明9號(hào)樣品不存在S.aureus的污染。在剩下的19 份樣品中，頂空固相微萃取-GC-MS檢測(cè)結(jié)果除2號(hào)樣品外，其他樣品均檢出3-甲基丁酸，峰信號(hào)強(qiáng)度在105～106；對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行PCR鑒定，14號(hào)樣品基因組DNA未能擴(kuò)增出S.aureus16S rDNA特異性片段，其余樣品基因組DNA都能擴(kuò)增出該片段（圖14），表明代謝標(biāo)記物檢測(cè)方法與PCR檢測(cè)方法之間的符合率為90%。BP平板培養(yǎng)結(jié)果顯示全部樣品檢出S.aureus，生長量在106～1011CFU/g，表明代謝標(biāo)記物檢測(cè)方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)果之間的符合率為95%。

表6 米飯樣品中S.aureus生長與代謝標(biāo)記物檢出情況Table 6 Growth and metabolic markers of inoculated S.aureus in cooked rice samples

圖14 米飯樣品S.aureus 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.14 Electrophoresis patterns of 16S rDNA PCR amplification products from inoculated S.aureus in cooked rice samples

3 討 論

在常用食品發(fā)酵劑乳酸菌[25-26]和肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌[27-28]中，支鏈氨基酸分解代謝途徑已有報(bào)道，亮氨酸首先在支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶催化作用下生成α-酮異己酸，經(jīng)非氧化脫羧途徑生成3-甲基丁醛，最后經(jīng)醛脫氫酶催化為3-甲基丁酸，或者α-酮異己酸經(jīng)氧化脫羧途徑直接生成3-甲基丁酸?？梢?，3-甲基丁醛是亮氨酸分解代謝的中間產(chǎn)物，3-甲基丁酸是最終產(chǎn)物。有學(xué)者建議通過檢測(cè)細(xì)菌的代謝終產(chǎn)物鑒定細(xì)菌，但是從細(xì)菌的代謝終產(chǎn)物中找到穩(wěn)定的標(biāo)志物比較困難[29]。在已有研究報(bào)道[19-21]和本課題組前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選出3-甲基丁醛和3-甲基丁酸作為S.aureus潛在的檢測(cè)標(biāo)志物。本研究參考國家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，以7.5% NaCl肉湯為前增菌培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)基本身會(huì)產(chǎn)生高強(qiáng)度的3-甲基丁醛，S.aureus的代謝活動(dòng)沒能改變其檢出水平，說明S.aureus在7.5%NaCl肉湯中幾乎不產(chǎn)生3-甲基丁醛或產(chǎn)生后被迅速轉(zhuǎn)化為3-甲基丁酸。與在胰蛋白胨大豆肉湯中S.aureus被檢出3-甲基丁醛[19,22]相比較，說明培養(yǎng)基質(zhì)會(huì)影響細(xì)菌的代謝活動(dòng)。3-甲基丁酸則是在各種培養(yǎng)基質(zhì)中穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物，包括本實(shí)驗(yàn)使用的7.5% NaCl肉湯及胰蛋白胨大豆肉湯[19,22]、腦心浸出液肉湯[20]和牛乳[30]等其他培養(yǎng)基質(zhì)。

鑒于目前缺乏S.aureus支鏈氨基酸分解代謝途徑的詳細(xì)研究報(bào)道，今后課題組擬開展食品源S.aureus分離菌株的支鏈氨基酸分解代謝能力分析，并詳細(xì)探究支鏈氨基酸分解代謝途徑，即探明S.aureus中3-甲基丁酸的產(chǎn)生機(jī)理，可以為建立代謝標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)奠定更深入的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

在7.5% NaCl肉湯培養(yǎng)基中，S.aureus不能產(chǎn)生高于空白的3-甲基丁醛信號(hào)，3-甲基丁酸則是S.aureus的特異性代謝產(chǎn)物，該代謝產(chǎn)物的釋放不受S.aureus菌株差異的影響，也不受與S.aureus共同培養(yǎng)的E.coliO157:H7和S.enteritidis的影響，具有良好的穩(wěn)定性。對(duì)于生鮮豬肉、生牛乳和米飯樣品，揮發(fā)性代謝標(biāo)志物檢測(cè)法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法和PCR檢測(cè)法的結(jié)果之間符合率很高，該方法只需將待檢樣品增菌培養(yǎng)20 h，然后取樣裝入頂空瓶即可上機(jī)自動(dòng)化檢測(cè)，操作流程簡單。