戊糖乳桿菌LS1細菌素的分離純化及性質(zhì)鑒定

李志如，韓建春,,，劉容旭，劉丹怡，梁君鋒

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江 哈爾濱 150028）

細菌素是一種小分子質(zhì)量生物活性抗菌肽，在許多細菌的核糖體中合成并在細胞外釋放。細菌素能夠殺死或抑制原核生物的生長，有助于抵抗病原體和一些具有抗生素抗性的細菌菌株[1]。細菌素與合成藥物和化學(xué)防腐劑不同，即使在低劑量下，細菌素仍然具有快速和強效的作用[2]，并且不會顯著改變?nèi)梭w腸道的微生物群[3-4]。其新的作用模式和對一些致病性細菌具有抑制作用，使其在食品防腐和保鮮方面?zhèn)涫荜P(guān)注[5-6]。其中乳酸菌細菌素通常被認為是安全的[7]，目前產(chǎn)細菌素戊糖乳桿菌已有許多文獻報道[8-10]。其中Okkers[11]對Pentocin TV35b進行純化；呂燕妮[12]對Pentocin 31-1分離純化。戊糖乳桿菌素多具耐熱性高、分子質(zhì)量小、在酸性或弱堿性條件下穩(wěn)定的特點[13]，具有廣泛的抑菌譜并且對一些食品致病菌具有較強的抑制作用[14]，對于食品和制藥工業(yè)都具有重要意義。

本研究主要對從酸菜水中得到的乳酸菌進行16S rDNA鑒定并測定其生長曲線，然后從其發(fā)酵液中分離純化細菌素，測定其分子質(zhì)量。同時研究溫度、pH值、酶和化學(xué)試劑對該細菌素抑菌效果的影響。目的是研究細菌素的有效分離和純化方法以及生物學(xué)特性，為其進一步研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）LS1分離自酸菜水；指示菌單核細胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）CMCC54004和大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922均保藏于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院教育部乳品科學(xué)重點實驗室。

乳酸鏈球菌素標準品、H2O2酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K 美國Sigma公司；醋酸鈉、冰乙酸等均為國產(chǎn)分析純；乙腈、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）和甲醇均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

SP Sepharose Fast Flow填料、Superdex 30 Increase層析柱、GE AKTA pure 150蛋白純化液相色譜系統(tǒng) 瑞典GE Healthcare公司；3-30KS高速冷凍離心機 德國Sigma公司；Pilot5-8ES真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Ultimate3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 德國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 戊糖乳桿菌LS1生長與拮抗活性曲線

將活化后的戊糖乳桿菌LS1接種到MRS液體培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)至對數(shù)生長期（108CFU/mL）。接種3%種子液于250 mL MRS培養(yǎng)基，每2 h（0～48 h）取發(fā)酵液5 mL。稀釋后，用MRS培養(yǎng)基作空白對照，測定OD600nm值；每6 h（0～48 h）取發(fā)酵液5 mL測定pH值，8 000 r/min離心15 min取上清液，通過瓊脂擴散牛津杯法測定抑菌活性，以單核細胞性李斯特菌CMCC 54004為指示菌。

1.3.2 產(chǎn)細菌素菌株鑒定

采用16S rDNA鑒定，參照Jang等[15]方法，離心收集菌體后，用DNA提取試劑盒，提取出菌株DNA，引物為27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’），送于吉林省庫美生物科技有限公司測序。

1.3.3 發(fā)酵上清液制備

將5%的戊糖乳桿菌LS1（18 h細胞年齡）培養(yǎng)物接種到MRS肉湯上，37 ℃培養(yǎng)42 h，8 000 r/min離心15 min后，通過0.22 μm膜過濾得到上清液與菌體，取上清液用3.0 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)至6.5，凍干備用。

1.3.4 細菌素分離純化

1.3.4.1 硫酸銨粗提細菌素

取15 g凍干樣品溶于1 000 mL去離子水，用20%、40%、60%、80%飽和度的硫酸銨，在轉(zhuǎn)速120 r/min條件下攪拌24 h，然后10 000 r/min、4 ℃離心20 min，通過0.22 μm孔徑的硝酸纖維素膜過濾分別得到上清液與沉淀，以單核細胞性李斯特菌CMCC54004和大腸桿菌ATCC25922為指示菌，采用瓊脂擴散牛津杯法分別測定沉淀復(fù)溶液與上清液的抑菌圈直徑，并以沒有接菌的培養(yǎng)基經(jīng)硫酸銨沉淀后的沉淀復(fù)溶液作空白對照，選取硫酸銨溶液的最佳飽和度。

1.3.4.2 Sephadex G-10柱色譜脫鹽及純化

將60%飽和度硫酸銨進行沉淀，離心過濾后的上清液通過Sephadex G-10柱色譜系統(tǒng)脫鹽并純化，以超純水為緩沖液，流速為6 mL/min，然后通過280 nm波長檢測細菌素，采用瓊脂擴散牛津杯法測定其抑菌活性。

1.3.4.3 SP Sepharose Fast Flow純化

參照Tahiri等[16]方法并稍作修改，將從Sephadex G-10柱色譜系統(tǒng)純化獲得初步純化細菌素通過20 mmol/L醋酸鹽沖液（pH 3.8）平衡的SP-Sepherose Fast Flow進行純化。用NaCl梯度（0～0.5 mol/L）線性洗脫細菌素，流速為5 mL/min。然后通過280 nm波長紫外檢測細菌素，并測定其抑菌活性。然后合并活性級分，用Sephadex G-10柱色譜系統(tǒng)脫鹽后，真空冷凍干燥。

1.3.4.4 Superdex 30 Increase分離純化細菌素

參照劉輝[17]方法并稍作修改，用5 mL醋酸鹽緩沖液溶解凍干樣品，使用Superdex 30 Increase，平衡2 個柱體積，在pH 5.2條件下洗脫，洗脫體積為1.5 CV，通過紫外280 nm波長處檢測細菌素，流速1 mL/min，每6 mL為一管進行收集，通過瓊脂擴散牛津杯法測定其抑菌活性。

1.3.5 細菌素純度的檢測

參照Ullah等[18]并稍作修改，取純化后獲得的活性峰樣品，使用HPLC測其純度。平衡液A：超純水＋0.1% TFA；洗脫液B：純乙腈＋0.1% TFA；上樣量為20 μL，以1.0 mL/min的流速，洗脫程序為0～5 min，95% A，5% B；5～20 min，95%～0% A，5%～100% B。采用Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），在215 nm波長處進行紫外檢測。

1.3.6 質(zhì)譜分析

參照劉輝[17]方法并稍作修改，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定從Superdex 30 Increase分離純化得到的細菌素Pentocin LS1分子質(zhì)量。上樣為20 μL，洗脫條件為5%～90%乙腈溶液，洗脫時間60 min，總離子流圖m/z340～2 000，通過數(shù)據(jù)依賴采集模式收集數(shù)據(jù)。二級質(zhì)譜是采用誘導(dǎo)碰撞解離（collision-induced dissociation，CID）方式捕捉二級質(zhì)譜中的b和y離子，通過Peaks 7.0軟件進行數(shù)據(jù)采集和分析[19]。

1.3.7 抑菌譜

將所有指示菌在37 ℃培養(yǎng)24 h后，稀釋至106CFU/mL，制備涂布有不同細菌的指示平板。在不同指示平板上通過牛津杯擴散法檢測發(fā)酵上清液樣品對不同指示菌是否產(chǎn)生抑菌圈，并測量抑菌圈直徑。

1.3.8 細菌素穩(wěn)定性分析

按照Ge Jingping等[20]方法進行細菌素穩(wěn)定性實驗。將細菌素置于40、60、80 ℃持續(xù)30 min以及100、121 ℃持續(xù)15 min，在將樣品冷卻至室溫后測試抑制活性。通過添加不同的酶測試細菌素對酶的敏感性，即蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、透明質(zhì)酸酶、過氧化氫酶，使最終酶質(zhì)量濃度為1 mg/mL，然后在37 ℃將該溶液溫育1 h后，測試抑制活性。將細菌素調(diào)節(jié)至各種pH值（2、3、5、8和10），然后在室溫下溫育2 h，測試抑制活性。接觸不同化學(xué)品時細菌素的穩(wěn)定性，即1%（V/V）吐溫80、1%（V/V）Triton X-100、1 mg/mL十二烷基硫酸鈉，通過將這些化學(xué)物質(zhì)添加到細菌素中然后在室溫下孵育2 h然后測定抑制活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 戊糖乳桿菌LS1生長與拮抗活性曲線

圖1 LS1菌株的生長及拮抗活性曲線Fig.1 Growth rate and antagonistic activity curves of strain LS1

將戊糖乳桿菌LS1在37 ℃條件下培養(yǎng)，其生長曲線見圖1。在培養(yǎng)2 h后進入對數(shù)生長期，菌體數(shù)量迅速增加，在22 h達到峰值，然后逐漸平緩，到達穩(wěn)定期；pH值從第6小時開始快速下降，24 h后逐漸穩(wěn)定至3.7左右；培養(yǎng)18 h后出現(xiàn)明顯抑菌圈，在第42小時抑菌直徑達到峰值為20.51 mm，隨后趨于平緩，說明抑菌活性物質(zhì)主要在發(fā)酵后期產(chǎn)生。

2.2 乳酸菌菌種的鑒定

以2%瓊脂糖凝膠對提取菌株DNA后擴增片段進行電泳，得到約1 500 bp的聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）片段，結(jié)果見圖2。

圖2 LS1菌株的16S rDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis patterns of PCR-amplified fragments from LS1 strain

將PCR的產(chǎn)物在吉林省庫美生物科技有限公司測序，將測序的結(jié)果輸入到www.NCBI.nlm.nih.gov，進行BLAST比對分析，得到菌株的相似度。根據(jù)同源性分析發(fā)現(xiàn)LS1屬于戊糖乳桿菌，相似度達到99%，采用MEGA 7.0軟件，鄰接算法構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3 LS1菌株的16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain LS1 based on the 16S rDNA gene sequence

2.3 細菌素的分離純化

2.3.1 硫酸銨粗提細菌素

由表1可知，分別用飽和度為20%、40%、60%硫酸銨，得到的沉淀量隨硫酸銨飽和度增加而增加，但均沒有明顯抑菌圈，上清液中出現(xiàn)較大抑菌圈并且差異不顯著；在硫酸銨飽和度為60%時，對大腸桿菌抑菌直徑為17.60 mm，對單核細胞性李斯特抑菌直徑為20.15 mm。當(dāng)硫酸銨飽和度增加到80%時，沉淀中出現(xiàn)抑菌圈，相應(yīng)地在上清液中抑菌圈減小。說明在硫酸銨飽和度達到80%以后發(fā)酵上清液中的細菌素就會被逐漸沉淀出來。故選擇60%硫酸銨既能夠保證將細菌素留在上清液中又能夠最大程度地將雜蛋白沉淀除去。

表1 不同飽和度的硫酸銨沉淀細菌素結(jié)果Table 1 Results of bacteriocin precipitation using different degrees of ammonium sulfate saturation

2.3.2 Sephadex G-10柱色譜脫鹽并純化

圖4 Pentocin LS1的Sephadex G-10層析圖譜Fig.4 Ion-exchange chromatogram of pentocin LS1 on Sephadex G-10

由于60%硫酸銨沉淀除雜上清液中含有大量鹽，選用Sephadex G-10柱色譜進行脫鹽。得到P1、P2兩個較大的紫外峰（圖4），P2無明顯抑菌圈而且與鹽峰重合；P1峰形較好，能夠較好地與分子質(zhì)量較小雜蛋白分開，對大腸桿菌和單核細胞性李斯特菌抑菌活性分別為25.62 mm和17.88 mm；故選擇峰P1進行下一步純化。

2.3.3 SP Sepharose Fast Flow純化抗菌肽

圖5 Pentocin LS1的SP Sepharose Fast Flow層析圖譜Fig.5 Ion-exchange chromatogram of pentocin LS1 on SP Sepharose Fast Flow

研究表明，大部分由乳酸菌產(chǎn)生的細菌素含有堿性氨基酸，在酸性及中性的條件下帶正電荷，能夠被陽離子層析柱吸附。將Sephadex G-10柱色譜脫鹽并純化得到的細菌素粗品在pH 3.8的條件下進行SP Sepherose Fast Flow分離純化[17,21]，如圖5所示，將收集液通過牛津杯法測定抑菌活性，結(jié)果表明抑菌活性區(qū)域在主要分離峰后面（圖5陰影部分），說明Pentocin LS1對陽離子柱SP Sepharose Fast Flow的吸附能力較其他雜蛋白強，洗脫下來活性位置在主洗脫峰后面，說明大部分雜蛋白已經(jīng)除去，有利于后期的分離純化。經(jīng)過SP Spharose Fast Flow離子層析柱，可以從上清液中分離出大部分有活性的細菌素，細菌素的比活力是原發(fā)酵上清液的28.4 倍。

2.3.4 Superdex 30 Increase分離純化細菌素

圖6 Superdex 30 Increase分離純化Pentocin LS1的色譜圖Fig.6 Chromatogram obtained from purification of pentocin LS1 by Superdex 30 Increase

由電泳所得bacteriocin-LS1估測分子質(zhì)量，采用Superdex 30 Increase作為最后一步純化，分離過程如圖6所示?？梢钥闯龌钚灾饕性?63～469 mL。采用牛津杯的方法，對分離純化各個步驟進行取樣測定活性，結(jié)果如表2和圖7所示，Pentocin LS1比活力逐漸增大，Superdex 30 Increase雖然得率低，只有2.1 mg，但其獲得了110.5 倍純化，Pentocin LS1比活力達到了1 238.1 AU/mg，說明在分離小分子物質(zhì)中凝膠層析能夠起到更明顯的分離作用。

表2 細菌素LS1的分離純化Table 2 Summary of purification steps of pentocin LS1

圖7 分離純化后細菌素的抑菌結(jié)果Fig.7 Antibacterial effect of pentocin LS1 after separation and purification

2.4 HPLC檢測細菌素純度

圖8 Pentocin LS1的HPLC圖譜Fig.8 Analytical RP-HPLC profile of pentocin LS1

HPLC具有高分辨率的特征，能夠檢測出細菌素的純度[18,22-23]。利用樣品的極性和疏水性進行分離，經(jīng)過Superdex 30 Increase純化后的樣品經(jīng)過HPLC分析（圖8），在6.7 min處出峰，峰形較好，沒有出現(xiàn)明顯雜峰，說明得到了較高純度的Pentocin LS1。

2.5 質(zhì)譜分析

經(jīng)過Superdex 30 Increase分離純化后的細菌素樣品進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，得出Pentocin LS1的分子質(zhì)量為1 123.8 Da。對1 123.8 Da的峰再次進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，得到二級質(zhì)譜圖（圖9）。通過Peaks 7.0軟件對該細菌素的二級質(zhì)譜片段進行分析得出該細菌素的氨基酸序列為ACDFCFCGMK。將Pentocin LS1氨基酸序列在GenBank和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中利用BLASTP搜索相同序列，結(jié)果顯示Pentocin LS1沒有相同的匹配的序列，表明Pentocin LS1是一種新型的戊糖乳桿菌素。

圖9 細菌素Pentocin LS1的二級質(zhì)譜圖Fig.9 Mass spectrum of pentocin LS1

2.6 Pentocin LS1的抑菌譜

具有廣泛抗菌活性的細菌素在食品工業(yè)中具有應(yīng)用價值。Pentocin LS1具有廣泛的抗微生物譜（表3）。它能夠強烈抑制一些革蘭氏陽性細菌，如單核細胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌；同時它能抑制革蘭氏陰性細菌，包括大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞桿菌。此外，它對乳酸菌屬的一些菌株也有一定的抑制作用；然而，它不能抑制酵母和霉菌。

表3 Bacteriocin-LS1抑菌譜Table 3Antimicrobial spectrum of bacteriocin-LS1

2.7 Pentocin LS1對溫度、pH值、化學(xué)試劑、蛋白酶敏感性

表4 Pentocin LS1對溫度、pH值、化學(xué)試劑、蛋白酶的敏感性Table 4 Effects of heating temperature, pH, chemical reagents, and enzymes on antibacterial activity of pentocin LS1

如表4所示，在所研究溫度下均保持活性，Pentocin LS1能夠在巴氏殺菌下更穩(wěn)定，100 ℃加熱15 min仍保留80.2%的抑菌活性，但在121 ℃高壓滅菌15 min后活性損失較大；在接觸各種化學(xué)品后，Pentocin LS1也保持了幾乎100%的活性。用蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶處理導(dǎo)致完全喪失活性；用脂肪酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、透明質(zhì)酸酶、過氧化氫酶進行酶處理后幾乎無活性損失，從而證實了其蛋白質(zhì)性質(zhì)。細菌素Pentocin LS1的抑菌活性在pH 2.0～8.0時保持相對穩(wěn)定，但其活性在pH 10.0～12.0顯著降低，這種對酸的抗性可能適合于食品的制造和保存。

3 討 論

目前許多研究已經(jīng)采用不同的方法純化由乳酸菌產(chǎn)生的細菌素[24-26]。本研究第1步采用硫酸銨法獲得6.0 倍純化，具有工作條件溫和、成本效益高、結(jié)果快速生成、最終產(chǎn)品回收率高的優(yōu)點。Rumjuankiat等[27]使用硫酸銨沉淀作為提取細菌素的第一純化步驟，僅獲得1.5 倍的純化；然后采用Sephadex G-10柱色譜進行純化，在脫鹽的同時達到了分離純化的目的，較目前常用的透析袋脫鹽有著脫鹽效果好、快速等特點；而最后一步精細純化采用Superdex 30 Increase得到了純度較高的細菌素，劉輝[17]在最后一步精細純化也用該方法獲得了高純度細菌素。

通過質(zhì)譜法測得戊糖乳桿菌素Pentocin LS1分子質(zhì)量為1 123.8 Da。關(guān)于從戊糖乳桿菌中純化細菌素并獲得準確分子質(zhì)量的報道較少，其中有Pentocin MQ1[28]（2 110.672 Da）、Pentocin TV35b[11]（3 929.63 Da）、Pentocin 31-1[29]（5 592.225 Da）、Pentocin K2N7[30]（2.017 kDa）和Pentocin JL-1[31]（2 987.23 Da）。戊糖乳桿菌素Pentocin LS1分子質(zhì)量與任何已報道的戊糖乳桿菌素均不匹配，同時將Pentocin LS1氨基酸序列在GenBank和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中利用BLASTP搜索相同序列，結(jié)果顯示Pentocin LS1沒有相同的匹配的序列，表明Pentocin LS1是一種新型的戊糖乳桿菌素。

Pentocin LS1具有廣泛的抑菌活性，對一些革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌表現(xiàn)出較強的抑制活性。Zhang Jinlan等[29]也報道了Pentocin 31-1是一種廣譜細菌素，對單核細胞性李斯特菌，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑制活性。Watthanasakphuban等[30]報道Pentocin K2N7具有較窄的抑菌活性，對單核細胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌均沒有抑制作用，但對乳酸菌屬的一些菌株顯示出抑制作用。Wayah等[28]研究得出Pentocin MQ1是一種廣譜細菌素，對單核細胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞桿菌具有抑制活性，并且能夠抑制植物乳桿菌K25。Pentocin LS1能夠強烈抑制一些革蘭氏陽性細菌，如單核細胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌；同時它能抑制革蘭氏陰性細菌，包括大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞桿菌。此外，它對乳酸菌屬的一些菌株也有一定的抑制作用；然而，它與大多數(shù)細菌素一樣都不能抑制酵母和霉菌。廣泛的抗菌活性是選擇細菌素用于食品保存的重要標準之一[32-33]，Pentocin LS1的廣泛抗菌譜很好地表明它是食品防腐劑的良好候選者。Pentocin LS1對所研究的化學(xué)處理均高度穩(wěn)定，同時具有很高的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性，在pH 2.0～10.0和40～121 ℃仍具有活性。已報道的Pentocin TV35b在pH 1.0～10.0和60～100 ℃溫度處理后具有活性[11]；Pentocin 31-1與Pentocin LS1具有相似的穩(wěn)定性都在pH 2.0～10.0和60～121 ℃時具有活性[29]；Pentocin MQ1在40～120 ℃有抑菌活性，在pH 10時無活性，但用化學(xué)試劑處理后仍具有穩(wěn)定性[28]；Pentocin K2N7在pH 2.0～12.0時保持活性，但在121 ℃時無活性[30]。Pentocin LS1對化學(xué)，pH值和熱穩(wěn)定的屬性有利于其在食品加工中的應(yīng)用[34]，同時其本質(zhì)為多肽，具有對蛋白酶敏感的的特性，降低其對有益腸道菌群的抑制，從而提高了其安全性[35]。

4 結(jié) 論

利用16S rDNA基因序列對從酸菜水中分離出的1 株產(chǎn)細菌素菌株LS1進行鑒定，最終鑒定該菌為戊糖乳桿菌。細菌素依次通過硫酸銨沉淀取上清液經(jīng)Sephadex G-10柱色譜脫鹽并純化，然后SP Sepharose Fast Flow中度純化，最后Superdex 30 Increase精細純化。純化后比活力1 238.1 AU/mg，是原始活性的110.5 倍。根據(jù)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定細菌素分子質(zhì)量為1 123.8 Da，氨基酸序列為ACDFCFCGMK。細菌素Pentocin LS1對溫度、pH值、化學(xué)試劑都有很好的穩(wěn)定性，且能夠被腸道中的酶滅活，同時對一些食品致病菌有著較強的抑制作用，在食品防腐和保鮮方面有著重要意義。