限制性酶解調(diào)控燕麥蛋白結(jié)構(gòu)特性與抗氧化功能

鄭召君，王 曼，李嘉欣，李進偉，劉元法

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

近年來，蛋白質(zhì)的市場需求量不斷增加，加之動物蛋白價格不斷攀升，開發(fā)利用來源廣泛、成本低廉的植物蛋白已成為食品領(lǐng)域重點關(guān)注的話題。作為蛋白含量最高的禾谷類糧食作物，燕麥（Avena sativaL.）約含9.7%～17.3%的蛋白質(zhì)，必需氨基酸含量豐富。據(jù)報道，燕麥蛋白的功效比值為2.25～2.38，蛋白質(zhì)凈利用率可達69.1%～72.4%，蛋白消化率為90.3%～94.2%，營養(yǎng)價值高且成本低，是開發(fā)人類食品的優(yōu)質(zhì)蛋白源[1]。然而，燕麥蛋白在食品體系常見的中性環(huán)境中性能較差，極大限制了其在人類食品中的推廣應(yīng)用[2]。因此，尋求適宜的方法提高燕麥蛋白性能是促進燕麥蛋白高效利用的必要條件。

酶解技術(shù)是目前提高蛋白質(zhì)性能較為有效且常用的方法。蛋白酶作用于大分子蛋白使其降解為肽或氨基酸，有助于改變食物蛋白的結(jié)構(gòu)特性，而結(jié)構(gòu)又與其功能之間關(guān)系密切[3]。大量研究表明，酶解改變豌豆蛋白[4]、大米蛋白[5]、花生蛋白[6]和大麻蛋白[7]等植物蛋白的結(jié)構(gòu)，進而改善其功能特性。上述研究也表明，過度水解限制蛋白特性的發(fā)揮，甚至產(chǎn)生異味，而限制性水解有利于提高蛋白的功能特性。限制性酶解可導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)部分解離，改變其構(gòu)象穩(wěn)定性，從而暴露更多的可電離基團和疏水基團，降低蛋白分子質(zhì)量并將肽片段釋放到溶液中[8]。例如，蕓豆蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解制備酶解產(chǎn)物，其中水解度為4%的酶解產(chǎn)物具有良好的乳化穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性[9]。由此可知，水解度是酶解改性的關(guān)鍵調(diào)控因子，而水解度高低受蛋白酶特異性的影響。木瓜蛋白酶是食品工業(yè)最常用的植物蛋白酶，其酶解產(chǎn)物多具有抗氧化等生物學(xué)潛能[10]。例如，Wang Bin等[11]利用木瓜蛋白酶水解錘頭鯊肌肉蛋白，其酶解產(chǎn)物具有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽陽離子自由基清除能力；Al-Shamsi等[12]研究發(fā)現(xiàn)，駱駝乳蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶水解后的抗氧化活性提高，有效抑制水包葡萄籽油乳液和魚糜的脂質(zhì)過氧化。

綜上所述，蛋白酶水解調(diào)控蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，然而關(guān)于限制性酶解對燕麥蛋白結(jié)構(gòu)與功能的影響尚不明確。因此，本實驗選用燕麥蛋白為研究對象，利用木瓜蛋白酶對其進行限制性酶解，深入解析不同水解度條件下燕麥蛋白結(jié)構(gòu)特性以及抗氧化功能的變化，進一步評價其在2 種食品體系中的抗氧化作用，以期為燕麥蛋白的深度開發(fā)及其在食品中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)與理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥 十月稻田農(nóng)業(yè)科技有限公司；木瓜蛋白酶（2 400 U/mg） 北京百靈威科技有限公司；DPPH、菲洛嗪 美國Sigma-Aldrich公司；二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 上海麥克林試劑公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Sorvall Lynx 4000落地式離心機 美國Thermo Fisher公司；Ultrospec 7000PC紫外-可見分光光度計 美國通用電氣公司；SpectraMax-190酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；臺式恒溫振蕩器 上海博訊實業(yè)有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機 上海豫明有限公司；Rancimat 892油脂氧化穩(wěn)定儀 瑞士萬通公司；Zetasizer nano ZS納米粒度及ZETA電位儀 英國馬爾文公司；F-7000熒光分光光度計 日本日立公司；Chirascan V100圓二色光譜儀 英國應(yīng)用光物理公司；T25高速乳化均質(zhì)機 英國IKA公司；偏振光顯微鏡德國徠卡公司。

1.3 方法

1.3.1 燕麥蛋白的制備

燕麥米粉碎后過80 目篩，所得燕麥粉以1∶4（g/mL）的料液比加入正己烷進行脫脂處理，磁力攪拌3 h后過濾去除正己烷，隨后以料液比1∶6（g/mL）加入正己烷攪拌脫脂6 h，去除濾液后的濾餅置于通風(fēng)櫥中過夜風(fēng)干獲得脫脂燕麥粉。之后以脫脂燕麥為原料，參考Zhong Lei等[13]方法采用堿溶酸沉法提取燕麥蛋白并進行冷凍干燥成粉，凱氏定氮法測定其蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為（80.03±2.60）%。

1.3.2 燕麥蛋白酶解

稱取適量燕麥蛋白粉溶于去 離 子 水 （ 1∶10， g/mL） ，100 Hz超聲處理45 min，調(diào)節(jié)溶液至木瓜蛋白酶最適酶解pH 7.0，將底物溶液置于55 ℃恒溫振蕩器中保溫10 min后加入2%木瓜蛋白酶開始酶解，當(dāng)水解度分別達到2%、3%、4%、5%、6%和7%時收集酶解樣品（實際水解度分別為1.95%、3.02%、4.22%、5.07%、6.23%和6.99%），置于90 ℃水浴鍋中滅活15 min，而后冷卻至室溫，調(diào)節(jié)酶解液pH值至中性，8 000 r/min離心15 min，收集上清液并冷凍干燥成粉，燕麥蛋白肽粉置于－20 ℃密封保存?zhèn)溆?。水解度參考Nielsen等[14]的鄰苯二甲醛法進行測定。

1.3.3 Tricine十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

根據(jù)Sch?gger[15]的Tricine SDS-PAGE方法，采用4%濃縮膠和16%分離膠分析燕麥蛋白及其酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布，上樣量為15 μL。在恒壓30 V狀態(tài)下開始電泳，待樣品進入分離膠后調(diào)節(jié)電壓為110 V。電泳結(jié)束后，對蛋白凝膠進行考馬斯亮藍染色以及甲醇-冰醋酸脫色，置于凝膠成像儀中采集電泳圖像。

1.3.4 紫外吸收光譜測定

燕麥樣品溶于超純水配制成蛋白質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的溶液，以超純水作空白，利用紫外分光光度計對其進行紫外掃描，掃描波長范圍為200～800 nm，記錄紫外掃描圖譜。

1.3.5 圓二色光譜測定

利用超純水將燕麥蛋白及其酶解產(chǎn)物稀釋至0.10 mg/mL，采用圓二色光譜儀分析其二級結(jié)構(gòu)。掃描波長范圍為185～265 nm，掃描速率為100 nm/min，光徑為1 mm，3 次平行測樣，結(jié)果以摩爾橢圓率θ表示。

1.3.6 外源性熒光光譜測定

參考Evangelho等[16]的方法，采用外源性熒光探針ANS檢測燕麥蛋白及其酶解產(chǎn)物的表面疏水性變化。首先將樣品溶于10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）配制成蛋白質(zhì)量濃度為1 μg/mL的溶液，而后在1.5 mL樣品稀釋溶液中加入20 μL ANS（8 mmol/L）并混勻，置于熒光分光光度計進行光譜掃描，掃描波長范圍400～700 nm，激發(fā)波長390 nm，狹縫寬度為5.0 nm。

1.3.7 抗氧化活性測定

1.3.7.1 DPPH自由基清除率測定

參考Arise等[17]的方法，并稍作修改。分別將燕麥蛋白及其酶解產(chǎn)物等比倍比稀釋，取50 μL稀釋液與50 μL 0.1 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液混合均勻，室溫下避光靜置30 min后，于517 nm波長處測定樣品的吸光度，按式（1）計算酶解前后燕麥蛋白的DPPH自由基清除率：

式中：Asample為加入燕麥蛋白及其酶解產(chǎn)物后DPPH溶液的吸光度；Ablank為燕麥蛋白及其酶解產(chǎn)物的吸光度；Acontrol為未加燕麥蛋白及酶解產(chǎn)物時DPPH溶液的吸光度。

1.3.7.2 金屬離子螯合能力測定

參考Taheri等[18]的測定方法，略作修改。將蛋白樣品進行等比倍比稀釋，取50 μL稀釋液依次與100 μL FeCl2溶液（20 μmol/L）、100 μL菲洛嗪（0.5 mmol/L）溶液混勻，室溫孵育10 min，于波長562 nm處測定反應(yīng)液的吸光度As。同時，以50 μL超純水替代稀釋液作為對照組，測其吸光度A1，50 μL酶解液與200 μL超純水作為空白組，測吸光度A0，按式（2）計算金屬離子螯合能力：

1.3.8 氧化誘導(dǎo)時間測定

參考Teixeira等[19]的方法，測定燕麥蛋白肽對葵花籽油氧化誘導(dǎo)時間的影響。稱取3.0 g葵花籽油與質(zhì)量分數(shù)0.5%燕麥蛋白肽或質(zhì)量分數(shù)0.5‰生育酚混合均勻，超聲處理1 h后置于油脂氧化穩(wěn)定儀，溫度（120±1.6）℃、氣流速率1.0 L/h條件下測定其氧化誘導(dǎo)時間。

1.3.9 乳液氧化穩(wěn)定性評價

將30%葵花籽油、1%吐溫20以及69%超純水混合，于室溫條件下磁力攪拌30 min，然后用高速乳化均質(zhì)機在12 000 r/min條件下均質(zhì)2 min，再經(jīng)高壓均質(zhì)處理獲得乳液。隨后加入0.4 g/L燕麥蛋白肽或谷胱甘肽均質(zhì)混勻，無抗氧化劑添加的乳液作為對照。硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）法測定丙二醛（次級氧化產(chǎn)物）含量，具體方法如下：取1.5 mL乳液與1.0 mL 0.01 g/mL硫代巴比妥酸溶液以及2.5 mL 0.1 g/mL三氯醋酸溶液充分混勻，沸水浴孵育30 min后冰浴冷卻5 min，2.5 mL溶液與等體積三氯甲烷混勻并在4 500 r/min離心10 min，收集上清液以測定波長532 nm處吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本研究所有數(shù)據(jù)至少重復(fù)測定3 次，采用JMP 13統(tǒng)計軟件中的Student’s法檢驗數(shù)據(jù)的差異顯著性，并通過OriginPro 2016軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 限制性水解燕麥蛋白的電泳分析

圖1 不同水解度的燕麥蛋白SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE patterns of oat protein isolate hydrolysates with different DHs

如圖1所示，未經(jīng)酶解處理的燕麥蛋白（對照）顯示出2 條清晰的電泳條帶，其分子質(zhì)量主要集中在35～45 kDa和20～30 kDa之間，分別對應(yīng)燕麥球蛋白中的酸性多肽鏈和堿性多肽鏈[20]。而經(jīng)木瓜蛋白酶水解的燕麥蛋白的電泳圖譜發(fā)生明顯變化，40 kDa左右的蛋白條帶明顯變淺，且隨著水解程度加劇，蛋白條帶逐漸模糊不清，表明該類蛋白被大量水解。同時發(fā)現(xiàn)小于20 kDa的蛋白條帶顯著增多，說明大分子蛋白被木瓜蛋白酶降解為分子質(zhì)量較小的肽段。在水解度2%～7%條件下，隨水解度增加蛋白條帶呈輕微變淺趨勢，這與Ahmadifard等[21]利用木瓜蛋白酶水解大豆蛋白和米糠蛋白以及Xu Xingfeng等[5]利用胰蛋白酶水解大米谷蛋白（水解度0.5%～6%）的電泳結(jié)果相似。整體看，木瓜蛋白酶作用于燕麥球蛋白的酸性多肽和堿性多肽等片段，致使大分子蛋白降解產(chǎn)生小分子肽。

2.2 限制性水解對燕麥蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響

2.2.1 紫外-可見光光譜分析

圖2 不同水解度下燕麥蛋白紫外吸收光譜變化Fig.2 Effects of enzymatic hydrolysis on UV-Vis spectrum of oat isolate protein

如圖2可知，燕麥蛋白及其酶解產(chǎn)物在可見光區(qū)域沒有明顯變化，而在200～350 nm波長處存在紫外特征吸收峰（280 nm和210 nm左右）。酶解前后的燕麥蛋白均在波長280 nm處有相對弱的紫外吸收峰，這主要是因為肽鏈中酪氨酸和色氨酸的π→π*躍遷產(chǎn)生了吸收帶[22-23]。而在波長210 nm左右存在的強吸收峰是肽鍵中C＝O發(fā)生n→π*躍遷所形成的經(jīng)典肽吸收峰[24]。酶解前后燕麥蛋白的紫外吸收光譜存在明顯差別，主要表現(xiàn)在峰形和峰強度。與未酶解的對照組相比，燕麥蛋白酶解產(chǎn)物的特征吸收峰窄而尖，且紫外光譜發(fā)生藍移，這可能是因為酶解導(dǎo)致肽鍵斷裂，暴露芳香族發(fā)色團并改變蛋白構(gòu)象[25-26]。此外，在較低水解度（水解度2%～6%）時，燕麥蛋白酶解產(chǎn)物的紫外吸收峰的峰形、峰位以及峰強度變化不明顯，然而其峰強度在水解度7%時達到最高值，這是由于蛋白內(nèi)部的芳香族氨基酸殘基如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等隨水解進程而釋放于水中，從而增加了紫外吸收強度。

2.2.2 圓二色光譜分析

圖3 不同水解度下燕麥蛋白圓二色光譜變化Fig.3 Effects of enzymatic hydrolysis on CD spectrum of oat isolate protein

如圖3所示，未經(jīng)酶解的燕麥蛋白在波長190～200 nm處呈正峰，波長208 nm和220 nm左右有負峰，表明其具有α-螺旋結(jié)構(gòu)；同時在波長210～220 nm有負峰，表明β-折疊結(jié)構(gòu)的存在，這與Zhong Lei等[13]的研究結(jié)果一致。而經(jīng)過木瓜蛋白酶水解后，α-螺旋的含量明顯下降，向β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等二級結(jié)構(gòu)形式轉(zhuǎn)化，類似的現(xiàn)象也發(fā)現(xiàn)于酶解的大豆蛋白中[26-27]。此外，燕麥蛋白在水解度2%～7%時以無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)為主，表明蛋白經(jīng)酶解后由有序變得無序，二級結(jié)構(gòu)遭到明顯破壞。Lin Songyi等[28]研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化五肽SHCMN的部分α-螺旋轉(zhuǎn)換成無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，有助于活性位點暴露，進而提高其抗氧化能力。由此推知，酶解后的燕麥蛋白應(yīng)具有較強的抗氧化潛能。

2.2.3 熒光光譜分析

圖4 不同水解度下燕麥蛋白熒光光譜變化Fig.4 Effects of enzymatic hydrolysis on fluorescent spectrum of oat isolate protein

酶解前后的燕麥蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，而決定其構(gòu)象的關(guān)鍵因素之一是蛋白的表面疏水性。ANS是測定蛋白表面疏水性最常見且有效的熒光探針，其與蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生的熒光強度與疏水性呈正相關(guān)[5,22]?；诖?，本實驗選用ANS熒光探針研究燕麥蛋白酶解前后的疏水性差異。如圖4所示，與未酶解處理的對照組相比，燕麥蛋白在水解度2%時熒光強度顯著增加并達到峰值，這表明木瓜蛋白酶水解破壞蛋白質(zhì)分子，從而暴露其內(nèi)部的疏水基團。而隨著水解度逐漸增加，熒光強度反而降低，這說明隨著水解進行，暴露出的部分疏水氨基酸殘基被掩埋，更多的親水基團被釋放于極性環(huán)境中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞[29]。

2.3 限制性水解對燕麥蛋白Zeta電位的影響

圖5 燕麥蛋白水解過程Zeta電位變化Fig.5 Change in zeta-potential of oat protein isolate during limited hydrolysis

蛋白質(zhì)Zeta電位大小主要受帶電基團以及氨基酸殘基分布的影響[30]。由圖5可知，酶解前后的燕麥蛋白Zeta電位均表現(xiàn)為負值，表明其表面帶有大量負電荷，靜電斥力使顆粒散落分布而不易發(fā)生聚集[31]。所有酶解產(chǎn)物的電位絕對值均顯著低于未酶解的燕麥蛋白（P＜0.05），其原因可能是酶解過程釋放的帶正電荷氨基酸多于帶負電荷的氨基酸。就酶解產(chǎn)物而言，Zeta電位絕對值的變化趨勢為水解度4%＞6%＞2%＞5%＞3%＞7%，但除末者（水解度7%）外，各酶解產(chǎn)物間的負電位差距不明顯（P＞0.05），這說明低水解度對酶解產(chǎn)物的Zeta電位影響甚微。

2.4 限制性水解對燕麥蛋白抗氧化活性的影響

圖6 水解對燕麥蛋白DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effects of enzymatic hydrolysis on DPPH radical scavenging activity of oat protein isolate

如圖6所示，燕麥蛋白及其酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨蛋白質(zhì)量濃度的增加而呈逐漸上升趨勢，直至達到穩(wěn)定水平。燕麥蛋白酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除速率均高于未酶解的對照組，表明酶解有助于活性肽段的釋放，從而提高其抗氧化能力。不同水解度酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率各有差異，其中水解度4%和水解度7%具有最高的DPPH自由基清除速率，IC50分別為36.83 μg/mL和37.68 μg/mL；而水解度6%和水解度2%清除DPPH自由基速率最低，其IC50分別為51.46 μg/mL和57.45 μg/mL。此外，燕麥蛋白的水解度與其DPPH自由基清除率無直接相關(guān)關(guān)系，這與已有研究報道結(jié)果一致[32-34]。整體來說，燕麥蛋白酶解產(chǎn)物水解度4%的DPPH自由基清除率最強。

圖7 水解對燕麥蛋白金屬離子螯合能力的影響Fig.7 Effect of enzymatic hydrolysis on metal ion chelating activity of oat protein isolate

由圖7可知，與DPPH自由基清除率相似，燕麥蛋白及其酶解產(chǎn)物的金屬離子螯合能力呈現(xiàn)明顯的質(zhì)量濃度依賴性。而未經(jīng)酶解的燕麥蛋白展現(xiàn)出較低的金屬離子螯合速率，其金屬離子螯合能力低于50%。相反地，燕麥蛋白經(jīng)酶解后均展現(xiàn)出優(yōu)秀的金屬離子螯合能力，尤其是水解度在2%～5%之間時，其IC50維持在33 μg/mL左右，如水解度4%時，IC50為33.42 μg/mL。然而隨著水解度上升至6%或7%，酶解產(chǎn)物的金屬離子螯合能力略有下降，其IC50分別為51.95 μg/mL和50.11 μg/mL。綜合而言，燕麥蛋白酶解產(chǎn)物的金屬離子螯合能力顯著優(yōu)于前期報道的植物源蛋白酶解產(chǎn)物，如大麻蛋白[35]、大豆蛋白[36]以及菜籽蛋白[37]等。

2.5 燕麥蛋白肽對葵花籽油氧化穩(wěn)定性的影響

圖8 燕麥蛋白肽DH4對葵花籽油氧化誘導(dǎo)時間的影響Fig.8 Effect of oat protein peptide with 4% DH on the induction period of sunflower oil

燕麥蛋白在水解度為4%時具有適宜的理化特性以及最佳抗氧化活性，因此本實驗進一步分析水解度4%的燕麥蛋白肽（簡稱為肽DH4）對不飽和植物油氧化穩(wěn)定性的影響。氧化誘導(dǎo)時間是衡量油脂氧化穩(wěn)定性的通用指標，主要表征油脂在高溫條件下快速生成氧化產(chǎn)物所需時間[38]。如圖8所示，未添加抗氧化劑的葵花籽油的氧化誘導(dǎo)時間為（121.50±1.27）min，極顯著低于含有生育酚和肽DH4的葵花籽油（P＜0.01）。添加肽DH4的葵花籽油的氧化誘導(dǎo)時間為（141.00±2.55）min，高于添加生育酚的葵花籽油（139.20±0.85）min。由此可見，燕麥蛋白肽DH4可有效延緩葵花籽油的氧化誘導(dǎo)時間，這可歸因于其良好的自由基清除能力，抑制自由基鏈式反應(yīng)，從而抑制過氧化物的形成。

2.6 燕麥蛋白肽對乳液氧化穩(wěn)定性的影響

食品等反應(yīng)體系的復(fù)雜性直接影響抗氧化劑的活性，因此通過對TBARS（油脂次級氧化產(chǎn)物）進行測定以評估燕麥蛋白肽DH4對水包葵花籽油乳液氧化穩(wěn)定性的影響。從圖9可以發(fā)現(xiàn)，乳液的TBARS含量隨存儲時間的延長而逐漸上升，在第6天時達到最大值（2.46±0.03）mg/kg。相較而言，谷胱甘肽和肽DH4的添加可有效抑制TBARS的生成，其中肽DH4的作用效果最為顯著。值得注意的是，含有肽DH4的乳液在存儲4 d內(nèi)的TBARS含量最低，始終維持在2.0 mg/kg以下，且在存儲8 d后仍顯示出低的TBARS含量（1.37±0.01）mg/kg，相較于無抗氧化劑添加的乳液，肽DH4可降低43.27%的TBARS產(chǎn)量。

圖9 燕麥蛋白肽DH4對水包油乳液氧化穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effects of oat protein peptide with 4% DH on the oxidative stability of sunflower oil-in-water emulsion

圖10 燕麥蛋白肽DH4對水包油乳液氧化穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of oat protein peptide with 4% DH on the oxidative stability of sunflower oil-in-water emulsion

由圖10可知，無抗氧化劑添加的乳液體系中乳滴形狀規(guī)則且分布均勻，乳滴粒徑較小且大小均一，但貯存4 d后發(fā)生聚集形成大乳滴，乳液逐漸趨于不穩(wěn)定狀態(tài)。而添加谷胱甘肽的乳液在貯存1 d后就出現(xiàn)乳滴大小不均一現(xiàn)象，且隨著時間的延長，顆粒尺寸變大，說明谷胱甘肽降低了乳液的穩(wěn)定性。相較于谷胱甘肽，燕麥蛋白肽DH4添加的乳液在6 d貯藏期內(nèi)液滴較小且較為均一，這與上述TBARS產(chǎn)量的結(jié)果較為一致。究其原因，可能是帶負電荷的燕麥蛋白肽DH4形成的靜電斥力使乳滴均勻分布，從而保證乳液顯示出良好的穩(wěn)定性[39-40]。而乳液在貯藏末期（8 d）出現(xiàn)部分聚集，這可能是由于氧化產(chǎn)物的生成以及小肽從油/水界面的解吸造成的。

3 結(jié) 論

本研究利用木瓜蛋白酶對燕麥蛋白進行限制性酶解，系統(tǒng)表征了低水解度條件下燕麥蛋白結(jié)構(gòu)特性以及抗氧化功能，并探討了抗氧化活性強的燕麥蛋白肽對含油食品體系氧化穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，經(jīng)木瓜蛋白酶水解后燕麥蛋白的分子質(zhì)量由大分子蛋白向小分子肽遷移，進而影響其結(jié)構(gòu)特性。與未酶解的對照組相比，酶解后燕麥蛋白的紫外吸收光譜發(fā)生藍移，熒光光譜結(jié)果顯示蛋白三級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。此外，木瓜蛋白酶限制性酶解使燕麥蛋白由有序的α-螺旋結(jié)構(gòu)向無序的無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，說明酶解后蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，活性位點暴露，有助于提升燕麥蛋白的抗氧化潛能。酶解后的燕麥蛋白DPPH自由基清除率和金屬離子螯合能力顯著提高，尤其是在水解度為4%時，IC50分別為36.83 μg/mL和33.42 μg/mL。此外，燕麥蛋白肽DH4可顯著提供葵花籽油的氧化誘導(dǎo)時間并提高乳液的氧化穩(wěn)定性，在油脂、乳液體系等食品工業(yè)中具有重要的理論指導(dǎo)意義以及潛在的應(yīng)用價值。