基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的濟(jì)生腎氣丸治療骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制研究

傅繁譽(yù) 黃澤青 孫繼高 王榮田 葉恒力 陳衛(wèi)衡*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002 2.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少，骨微觀結(jié)構(gòu)的退化為主要特征，容易發(fā)生脆性骨折的一種全身性骨骼疾病[1]。隨著人口老齡化的加劇，其患病率正在逐年上升，已成為許多國家的主要公共衛(wèi)生問題[2]。盡管目前我國因骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致的骨折發(fā)病率、致殘率及死亡率都較高，然而患者的有效治療率卻偏低[3]。目前臨床上對于OP的治療主要采取藥物治療，包括以化學(xué)藥為主的骨吸收抑制劑、骨形成促進(jìn)劑和骨礦化藥物三類[4]。

濟(jì)生腎氣丸源自宋·嚴(yán)用和《濟(jì)生方》[5]。以“腎主骨”為指導(dǎo)，全方具有補(bǔ)腎壯骨、健脾益氣之功效。有研究[6]表明濟(jì)生腎氣丸能明顯提高骨質(zhì)疏松癥模型大鼠血清雌二醇、骨鈣素及降鈣素水平。但濟(jì)生腎氣丸治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制尚未完全明確，故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對濟(jì)生腎氣丸多成分、多靶點(diǎn)、多通路與骨質(zhì)疏松癥的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行分析，旨在揭示濟(jì)生腎氣丸治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證濟(jì)生腎氣丸作用機(jī)制提供新靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 濟(jì)生腎氣丸活性成分的收集與篩選

本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(http://tcmspw.com/tcmsp.php)以“熟地黃”、“山茱萸”、“牡丹皮”、“山藥”、“茯苓”、“澤瀉”、“肉桂”、“附子”、“牛膝”、“車前子”十味中藥成分作為Herb name檢索，利用口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)為篩選指標(biāo)，選擇OB≥30%，DL≥0.18為符合條件的活性成分，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取濟(jì)生腎氣丸活性成分所對應(yīng)的靶點(diǎn)，輸入到Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中獲得藥物靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因名稱。

1.2 方法

1.2.1骨質(zhì)疏松癥靶標(biāo)基因的獲?。和ㄟ^CTD(https://www.thefreedictionary.com)、GeneCards(https://www.genecards.org)、OMIM(https://www.omim.org)三個(gè)數(shù)據(jù)庫以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞搜索骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶標(biāo)基因。

1.2.2交集靶點(diǎn)的獲?。豪肰enny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具繪制濟(jì)生腎氣丸相關(guān)活性成分靶點(diǎn)和骨質(zhì)疏松癥靶點(diǎn)的韋恩圖，獲得其交集靶點(diǎn)，探究濟(jì)生腎氣丸的有效成分對骨質(zhì)疏松癥靶點(diǎn)的靶向作用。

1.2.3活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浞治觯和ㄟ^Cytoscape 3.6軟件構(gòu)建活性成分-交集靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，中藥成分或靶點(diǎn)表示為網(wǎng)絡(luò)之中的節(jié)點(diǎn)，他們之間的聯(lián)系表示為邊，使用Cytoscape 3.6軟件中Net-work Analyzer計(jì)算連接度(Degree)參數(shù)來評價(jià)藥效成分和靶點(diǎn)的重要性。

1.2.4構(gòu)建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)：將獲得的交集靶基因輸入String數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，選取置信度高于0.7的數(shù)據(jù)，獲得交集基因?qū)?yīng)的蛋白互作信息，然后導(dǎo)入Cytoscape軟件中利用CytoHubba插件對其進(jìn)行蛋白互作分析。

1.2.5DAVID富集分析：將獲得的交集基因輸入到DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體(GO)生物過程富集分析和KEGG通路富集分析(p.adjust<0.05)，將富集度高的前10名GO和前20名KEGG通過R-studio軟件用氣泡圖的形式展現(xiàn)出來。

1.2.6構(gòu)建核心靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖：將獲得的交集基因與前20名KEGG導(dǎo)入cytoscape 3.6軟件構(gòu)建核心靶點(diǎn)與通路的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，圖形的大小代表連接節(jié)點(diǎn)的數(shù)目，選擇明顯調(diào)控通路的基因進(jìn)行基因-通路網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出濟(jì)生腎氣丸治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 濟(jì)生腎氣丸活性成分

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索濟(jì)生腎氣丸各藥物活性成分，滿足OB≥30%和DL≥0.18，最后獲得63個(gè)活性成分。部分結(jié)果見表1。

表1 濟(jì)生腎氣丸部分活性成分Table 1 Some active ingredients in Jisheng Shenqi Pill

2.2 濟(jì)生腎氣丸活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測及骨質(zhì)疏松癥的靶點(diǎn)挖掘

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫得到濟(jì)生腎氣丸活性成分靶點(diǎn)211個(gè)，經(jīng)過三個(gè)數(shù)據(jù)庫(CTD)、(GeneCards)、(OMIM)共檢索出OP相關(guān)靶點(diǎn)3 126個(gè)，通過Venny 2.1將成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，得到132個(gè)共同靶點(diǎn)，這132個(gè)共同靶點(diǎn)視為濟(jì)生腎氣丸治療骨質(zhì)疏松癥可能的潛在靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集后的韋恩圖Fig.1 Venn diagram after the intersection of the component target and the disease target

2.3 濟(jì)生腎氣丸活性成分-交集靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將濟(jì)生腎氣丸的活性成分與交集靶點(diǎn)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.6軟件，繪制濟(jì)生腎氣丸活性成分-交集靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，得到了一個(gè)包含192個(gè)點(diǎn)和386條邊的網(wǎng)絡(luò)。圖中藍(lán)色長方形為132個(gè)交集基因，圓圈代表各個(gè)藥物，藍(lán)色代表車前子，淺紫色代表茯苓，灰色代表附子，深紫色代表牡丹皮，淺綠色代表牛膝、深綠色代表山藥、粉色代表山茱萸，黃色代表澤瀉，紅色代表多種藥物，見圖2。由此可見濟(jì)生腎氣丸是以多成分-多靶點(diǎn)-多途徑的形式來治療骨質(zhì)疏松癥的，體現(xiàn)了濟(jì)生腎氣丸治療OP作用機(jī)制的系統(tǒng)性與復(fù)雜性。根據(jù)連接度值(degree)大小排列，其中槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、漢黃芩素(Wogonin)的連接度值位于前三名，分別為98、37、28，是與交集靶點(diǎn)連接較緊密的活性成分，表明這3個(gè)成分可能是濟(jì)生腎氣丸治療OP的重要核心活性成分，具有重要意義。

圖2 濟(jì)生腎氣丸有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析Fig.2 Analysis of the active ingredient-intersection target network of Jisheng Shenqi pill

2.4 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

將濟(jì)生腎氣丸與骨質(zhì)疏松癥交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中，獲得交集蛋白相互作用關(guān)系，去掉無連接的蛋白，再將獲得的蛋白互作用關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape軟件中利用CytoHubba插件根據(jù)degree值進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，該網(wǎng)絡(luò)由122個(gè)節(jié)點(diǎn)與915條邊構(gòu)成，見圖3。圖中圓形節(jié)點(diǎn)表示單個(gè)基因蛋白，節(jié)點(diǎn)之間的連線代表2個(gè)蛋白有相互作用關(guān)系，線越多代表作用關(guān)系越強(qiáng)，圖形的大小、顏色由淺變紅映射degree值由小變大，根據(jù)結(jié)果得到：AKT1、MAPK1、MAPK8、IL6、JUN、VEGFA等基因排名靠前，可能為濟(jì)生腎氣丸治療OP的核心靶點(diǎn)。

圖3 蛋白相互作用關(guān)系圖Fig.3 Protein interaction diagram

2.5 DAVID富集分析

采用DAVID在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG通路分析，濟(jì)生腎氣丸可影響基因本體(gene ontology，GO)生物學(xué)過程2 127個(gè)，其中生物過程(biological process，BP)1 945個(gè)，細(xì)胞組成(cellular component，CC)55個(gè)，分子功能(molecular function，MF)127個(gè)；京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)代謝通路147條。如圖4所示，在生物學(xué)過程(BP)中富集顯著度較高的是對有毒物質(zhì)的反應(yīng)，對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)，對氧化應(yīng)激的反應(yīng)，對營養(yǎng)水平的反應(yīng)等；在細(xì)胞組成(CC)中富集顯著度較高的是膜微區(qū)、膜區(qū)域、核染色體部分、核染色質(zhì)等；在分子功能(MF)中富集顯著度較高的是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、RNA聚合酶II近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合、血紅素結(jié)合、核受體活性等。通過KEGG分析得到148條富集通路，圖5為富集程度最高的前20條代謝通路。主要涉及腫瘤壞死因子信號通路、白細(xì)胞介素17信號通路、AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化信號通路等，表明濟(jì)生腎氣丸可能通過作用于這些通路起到治療OP的作用。

圖4 GO富集分析氣泡圖Fig.4 Bubble chart of GO enrichment analysis

圖5 通過KEGG分析得到濟(jì)生腎氣丸治療OP作用預(yù)測靶點(diǎn)通路Fig.5 Prediction of target pathways for the effect of Jisheng Shenqi Pills on OP by KEGG analysis

2.6 核心靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖分析

構(gòu)建核心靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖基于顯著富集的通路和調(diào)控這些通路的基因，如圖6所示。對前20條通路和81個(gè)與前20條通路有關(guān)系的基因根據(jù)連接節(jié)點(diǎn)的數(shù)目(degree)進(jìn)行了分析，黃色正方形代表目標(biāo)基因，V形代表前20條通路。從結(jié)果中得知，AKT1的degree值最大，是核心靶基因。其他幾個(gè)基因也有較大的degree，如MAPK1、MAPK8、JUN、IL6、VEGFA等，他們可能是濟(jì)生腎氣丸治療OP的核心靶點(diǎn)。

圖6 核心靶點(diǎn)-信號通路相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Core target-signal pathway interaction network diagram

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是多學(xué)科交叉互接，應(yīng)用整體生物網(wǎng)絡(luò)的分析，揭曉藥物與靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系，解釋中藥活性成分之間的協(xié)同作用機(jī)制[7]。把網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的思想與方法融入進(jìn)中藥藥理研究中，闡釋中藥治療疾病的作用機(jī)制，能更好的推動(dòng)骨質(zhì)疏松癥的防治[8]。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制與脾、肝、腎三臟之間的關(guān)系緊密[9]。其中脾虛失其健運(yùn)，氣血生化乏源致四肢不榮是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要因素；肝失疏泄，藏血瀆職，筋脈失其所養(yǎng)是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要病因；腎精虧虛、天癸衰竭、骨骼失養(yǎng)則是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的直接原因[10]。濟(jì)生腎氣丸由“熟地黃”、“山茱萸”、“牡丹皮”、“山藥”、“茯苓”、“澤瀉”、“肉桂”、“附子”、“牛膝”、“車前子”十味藥組成，方中熟地黃具有滋補(bǔ)腎陰之效，佐以肉桂、附子助命門之火而溫陽化氣，有“陰中求陽”之意；山茱萸、山藥聯(lián)合運(yùn)用可補(bǔ)肝益脾，生精化血；牛膝滋陰益腎，澤瀉、茯苓功可利水滲濕，可防地黃滋膩之弊；牡丹皮清肝泄熱，車前子清熱利濕，四藥功用為補(bǔ)中寓瀉[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)濟(jì)生腎氣丸治療OP的主要核心活性成分為槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、漢黃芩素(Wogonin)等。Yuan等[12]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素增加了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度，改善了骨的生物力學(xué)性能，還能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化。Konar等[13]通過研究證實(shí)了槲皮素對BMP-2的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象有顯著影響，表明槲皮素是一種潛在的治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療方法。山柰酚通過促進(jìn)成骨細(xì)胞形成來預(yù)防去卵巢誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松癥，使大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的礦化作用增強(qiáng)，ALP活性升高、Runx-2和Osterix表達(dá)水平升高、p-S6K表達(dá)水平升高、p-4E/BP1表達(dá)水平降低，與其促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的能力一致[14]。山柰酚能通過抑制脂肪生成、炎癥、氧化應(yīng)激、破骨細(xì)胞自噬和成骨細(xì)胞凋亡，激活成骨細(xì)胞自噬，達(dá)到骨保護(hù)作用，因此對骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療有潛在的效果[15]。漢黃芩素通過抑制NFATc1從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制與破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的下調(diào)，且抑制了破骨細(xì)胞的分化，表明漢黃芩素是一種潛在的治療骨質(zhì)疏松癥的藥物[16]。

本研究通過蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)與核心靶點(diǎn)-通路圖的結(jié)果提示濟(jì)生腎氣丸作用于OP的關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及AKT1、MAPK1、JUN、MAPK8、IL6、VEGFA等。Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)AKT1(絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶)與成骨細(xì)胞分化、破骨細(xì)胞形成有著密切聯(lián)系，可作為骨質(zhì)疏松癥的治療靶點(diǎn)。研究表明AKT1是成骨細(xì)胞中一個(gè)獨(dú)特的信號傳導(dǎo)媒介，它可以控制成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化[18]。Zhang等[19]在基因網(wǎng)絡(luò)分析中發(fā)現(xiàn)AKT1等基因都與骨密度存在密切的聯(lián)系。MAPK8、MAPK1是MAP激酶家族的成員，參與多種細(xì)胞過程，如增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育等。研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體通過MAPK促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，從而改善骨質(zhì)疏松癥[20]。MAPKs可以控制各種細(xì)胞活動(dòng)，包括基因表達(dá)、分化、細(xì)胞存活和凋亡，特別是在調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)中起重要作用，研究表明MAPKs在破骨細(xì)胞中的激活和對胞吐作用的抑制是糖尿病骨質(zhì)疏松癥的主要原因[21]。此外，研究發(fā)現(xiàn)活化的MAPK在促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成、減少破骨細(xì)胞分化以及改善OP方面具有重要意義[22-23]。c-Jun氨基端激酶(其蛋白為JUN)與成骨細(xì)胞的增殖和破骨細(xì)胞的分化、成熟和功能有著密切的聯(lián)系，在維系骨形成和骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡中有著重要作用[24]。Ji等[25]探討IL-6(白細(xì)胞介素6)基因四種單核苷酸多態(tài)性與骨質(zhì)疏松易感性的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)rs1800796基因與IL-6的C等位基因rs2069849的相互作用均與增加骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。Lin等[26]發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素6多效性的細(xì)胞因子對骨重建至關(guān)重要。VEGFA(血管內(nèi)皮生長因子A)被認(rèn)為同時(shí)支持血管生成和成骨細(xì)胞功能，這兩個(gè)過程是體內(nèi)骨形成所必需條件之一，VEGFA還能以劑量依賴的方式促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的存活、分化和礦化[27]。

根據(jù)KEGG通路分析提示濟(jì)生腎氣丸治療OP相關(guān)通路涉及腫瘤壞死因子信號通路、白細(xì)胞介素17信號通路、AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化信號通路等。腫瘤壞死因子(TNF)具有脂質(zhì)代謝、凝血、胰島素抵抗、內(nèi)皮功能等作用，TNF可刺激破骨細(xì)胞的分化，抑制成骨細(xì)胞的祖細(xì)胞聚集。TNF還可促進(jìn)RANKL的產(chǎn)生，并與RANKL協(xié)同促進(jìn)破骨細(xì)胞分化作用，與RANKL誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路整合，促進(jìn)破骨細(xì)胞吸收[28]。炎癥反應(yīng)亦是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(POP)重要的病理生理過程，有研究發(fā)現(xiàn)POP患者血清中白細(xì)胞介素17(IL-17)水平越高反而骨密度越低，進(jìn)而提示IL-17可能通過影響骨密度來參與POP的發(fā)病過程，通過降低POP患者體內(nèi)增加的IL-17水平可能對其治療及預(yù)后有重要的臨床意義[29]。AGE-RAGE信號通路存在于許多疾病中，晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)與AGEs受體(RAGE)相互作用，對骨細(xì)胞代謝和功能改變有重要作用。一些糖尿病骨病患者的臨床結(jié)果，如骨密度降低、骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物抑制和骨質(zhì)量損害，可能是由于AGE-RAGE信號通路的影響[30]。AGE-RAGE的相互作用會導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，進(jìn)而引發(fā)多種細(xì)胞的炎癥和凝血反應(yīng)，加重骨質(zhì)疏松癥等疾病的進(jìn)展，結(jié)果表明抑制AGE-RAGE引起的氧化應(yīng)激的產(chǎn)生可能是一個(gè)新的治療靶點(diǎn)[31]。流體剪切應(yīng)力(FSS)可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)鈣快速釋放，產(chǎn)生鈣瞬變，在成骨細(xì)胞增殖和分化中起重要作用，此研究闡明了FSS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖與鈣瞬變的大小有關(guān)，而鈣瞬變又進(jìn)一步激活了能量代謝信號通路[32]。動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis)和骨質(zhì)疏松癥是相互關(guān)聯(lián)的實(shí)體，具有相似的致病機(jī)制[33]。最近有研究[34]表明骨代謝的關(guān)鍵蛋白，如骨保護(hù)蛋白(osteoprotegerin，OPG)和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)也參與血管粥樣硬化和鈣化。

綜上所述，濟(jì)生腎氣丸治療OP具有多靶點(diǎn)、多途徑、多通路的特點(diǎn)，也體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)的辨證論治與整體觀念，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析藥物與疾病的相互關(guān)系能有效的揭示濟(jì)生腎氣丸治療OP的可能機(jī)制。濟(jì)生腎氣丸治療OP結(jié)果表明：濟(jì)生腎氣丸活性成分可能通過作用于AKT1、MAPK1、IL6、MAPK8、JUN、VEGFA等關(guān)鍵靶標(biāo)基因，調(diào)控腫瘤壞死因子信號通路、白細(xì)胞介素17信號通路、AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化信號通路等發(fā)揮其臨床功效，達(dá)到治療OP的目的。由于本研究主要基于數(shù)據(jù)庫信息的提取，雖然使用多個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行綜合分析，但仍可能與濟(jì)生腎氣丸發(fā)揮作用的實(shí)際過程存在一定的區(qū)別，下一步需要通過動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。