黑豆皮花青素的提取及體外抗菌活性研究

蘇 適，李 月，董立強(qiáng)，馬 瑞

(綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152061)

黑豆(Glycinemax(L.)merr)為豆科植物大豆的黑色種子，屬一年生草本植物，其中富含脂肪、多糖、蛋白質(zhì)、纖維素、維生素、氨基酸和微量元素等營養(yǎng)成分[1].根據(jù)中醫(yī)理論，黑豆具有烏發(fā)養(yǎng)血、補(bǔ)腎益精、明目鎮(zhèn)心、消腫解毒等功效.黑豆種皮中富含的花青素是一種類黃酮化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、減輕肝功能障礙、美容養(yǎng)顏和改善視力等作用[2-5].原花青素的抗菌、抗病毒作用的研究表明一定濃度的原花青素溶液對多種細(xì)菌均有抑制作用[6].隨著黑豆的營養(yǎng)價值逐漸被人們所認(rèn)識，作為一種食藥兩用型的健康食品，黑豆的種植范圍和產(chǎn)量也逐年擴(kuò)大.

花青素的提取方法有超聲法、有機(jī)溶劑浸提法和微波法等.傳統(tǒng)提取和分離方法有污染重、能耗高、試劑回收率低等問題.微波輻射提取技術(shù)利用電磁場的作用使樣品中的某些有機(jī)物成分與基體有效的分離,且提取效率高[7]，已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn).離子液體在室溫下呈液態(tài)，由有機(jī)陽離子和無機(jī)陰離子構(gòu)成，具有溶解性好、極性強(qiáng)、可設(shè)計性和循環(huán)使用等特殊優(yōu)點(diǎn)，是一種綠色的有機(jī)溶劑[8-10].本文采用微波輔助離子液體提取黑豆皮花青素，利用正交試驗優(yōu)化提取工藝，同時對花青素的抑菌能力進(jìn)行研究，為黑豆的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：黑豆，購自永輝超市.原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù) 98 %)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；染料木素標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù) 98 %)：中國藥品生物制品檢定所；1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽(質(zhì)量分?jǐn)?shù) 97 %)：阿爾法試劑有限公司；瓊脂粉、蛋白胨、牛肉膏、硝酸鋁、氯化鈉、氫氧化鈉、亞硝酸鈉(均為分析純)：國藥試劑有限公司.

供試菌種：供試菌種均為綏化學(xué)院微生物實(shí)驗室提供.

1.2 試驗儀器

PZ-TQ-Q微波提取器：上海斡龍微波科技有限公司；101C-2B電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海市實(shí)驗儀器總廠；XV-9200紫外分光光度計：北京市精密儀器廠；HB-III水循環(huán)多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SPX-150B-2生化培養(yǎng)箱：海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JD-CJ-1A型超凈工作臺：蘇州金大凈化工程設(shè)備有限公司.

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將黑豆人工去皮，置于 40 ℃燥箱中干燥至恒重，粉碎后過 60 目篩，備用.

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參考文獻(xiàn)[3]采用鹽酸-香草醛法測定花青素質(zhì)量濃度，花青素能與顯色劑反應(yīng)，在 500 nm 處有最大的吸收峰.稱取10 mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，配成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液.分別移取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于10 mL的容量瓶中，加入5.00 mL 顯色劑，用1%的鹽酸甲醇溶液定容，恒溫水浴 30 min，花青素在530 nm波長處有最大吸收峰，在此波長下測出待測溶液的吸光度值.以花青素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.9620X+0.0067，R2=0.9964.

1.3.3 提取率計算

稱取1.0 g黑豆皮粉末，以離子液體為提取劑，在一定實(shí)驗條件下提取花青素，提取液以3 000 r/min，離心40 min，取得上層清液，按1.3.1項下方法測定其吸光度，并根據(jù)回歸方程，計算黑豆花青素質(zhì)量濃度及提取率：

其中：C為花青素質(zhì)量濃度(μg/mL)；V為定容體積(mL)；n為稀釋倍數(shù)；M為原料質(zhì)量(g).

1.3.4 微波輔助離子液體提取花青素及純化

稱取黑豆皮粉末1.0 g，采用離子液體水溶液為溶劑，料液比為 1∶20，微波功率 500 W，溫度 60 ℃，提取 6 min；加入 2 倍體積的無水乙醇，沉淀去除粗提取液中的蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，2 000 r/min，離心 10 min，取上清液再用石油醚、氯仿依次萃取，除去粗提取液中的脂溶性成分，棄掉有機(jī)層.合并離心后的上清液；對分離純化后的提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在 40 ℃水浴中蒸發(fā)濃縮至 10 mL，裝入容量瓶中，4 ℃保存，備用.

1.4 微波輔助離子液體提取法單因素實(shí)驗設(shè)計

離子液體濃度: 固定提取溫度50 ℃，微波功率300 W，料液比 1∶15 g/mL，提取6 min，考察不同離子液體濃度(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol/L)對花青素提取率的影響.

微波功率: 固定提取溫度為 50 ℃，料液比15 g/mL，離子液體濃度0.8 mol/L，提取 6 min，考察不同微波功率(100、200、300、400、500 、600 W) 對花青素提取率的影響.

料液比: 固定提取溫度 50 ℃，微波功率300 W，離子液體濃度0.8 mol/L，提取6 min，考察不同料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30) 對花青素提取率的影響.

提取時間: 固定提取溫度50 ℃，微波功率300 W，離子液體濃度0.8 mol/L，料液比 15 g/mL，考察不同提取時間(3、4、5、6、7、8 min) 對花青素提取率的影響.

1.5 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取離子液體濃度(A) 、微波功率(B) 、料液比(C)、提取時間(D) 進(jìn)行四個因素三水平正交試驗，如表1所示.

表1 正交試驗因素水平表

1.6 花青素的抑菌圈實(shí)驗

試驗采用大腸桿菌、短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌作為供試菌；采用濾紙片法[10]判斷花青素的抑菌活性.將黑豆皮花青素提取液稀釋至0.0、0. 05、0.25、0.35、0.45、0.55 mg·mL-1作為供試樣品溶液.在超凈臺上分別將菌種活化，并用無菌涂布棒涂布均勻到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，在平板上分別放置浸有不同濃度樣品溶液的 6 mm 濾紙片，放生化培養(yǎng)箱內(nèi) 37 ℃培養(yǎng) 24 h，觀察抑菌效果，用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈的直徑，另選取一個只加以無菌水為對照組，抑菌圈直徑越大則抑菌活性越強(qiáng)[11-12].

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對提取率的影響

提取黑豆皮花青素提取率高低依次是微波輔助離子液體法>傳統(tǒng)有機(jī)溶劑法.

2.1.1 離子液體濃度對提取率的影響

由圖1可知，隨著離子液體濃度的增加，花青素的提取率隨之升高，在離子液體濃度試驗設(shè)定范圍內(nèi)，花青素的提取率也隨著 [BMIM]Cl濃度的增加而增大.當(dāng)[BMIM]Cl的濃度達(dá)到 1.0 mol/L 時，花青素提取率達(dá)最大，當(dāng)離子液體的濃度超過 1.0 mol/L時，提取率開始下降.可能是花青素類化合物是一類極性化合物，在離子液體濃度為1.0 mol/L溶液中溶出程度最大[13].所以，離子液體濃度選擇1.0 mol/L 最佳.

圖1 離子液體濃度對提取率的影響

2.1.2 微波功率對提取率的影響

由圖2可知，微波功率在100～500 W的試驗設(shè)定范圍內(nèi)，隨著微波功率的升高，黑豆皮花青素的提取率逐漸升高，當(dāng)功率為500 W時，花青素的提取率最高，隨后提取率開始下降.微波功率越大，使得體系溫度上升迅速，花青素的浸出量逐漸增加；而功率過大時，系統(tǒng)內(nèi)的強(qiáng)熱導(dǎo)致花青素被氧化[14]，故提取率下降.所以，最佳的微波功率選為 400 W.

圖2 微波功率對提取率的影響

2.1.3 料液比對提取率的影響

由圖3可知，料液比在1∶5～1∶25的試驗設(shè)定范圍內(nèi)，花青素提取率隨著料液比的增大而升高，料液比為1∶25時，提取率達(dá)到最大值，當(dāng)料液比高于1∶25時，花青素提取率開始下降.可能是體系中所能提取的花青素達(dá)到溶解極限，溶劑量增加也不能再提高花青素提取率，反而會增加雜質(zhì)成分的溶出[15]，影響后序濃縮工藝，加大成本.所以，選擇料液比為 1∶15.

圖3 料液比對提取率的影響

2.1.4 提取時間對提取率的影響

由圖4可知，提取時間在3～7 min的試驗設(shè)定范圍內(nèi)，花青素提取率隨著時間的延長而升高，微波提取時間在7 min時，提取率達(dá)到最大值，隨后沒有明顯增加.可能是花青素溶出量達(dá)到飽和，繼續(xù)延長提取時間花青素也不再繼續(xù)溶出[16].所以，綜合考慮成本因素，超聲時間選擇7 min.

圖4 提取時間提取率的影響

2.2 提取工藝優(yōu)化

根據(jù)正交試驗分析的結(jié)果，各因素對黑豆皮花青素取效果影響的主次順序依次為 A>C>D>B.由表 2 極差分析可知，花青素提取得率最高的理論組合應(yīng)為A1B3C3D1，即離子液體濃度0.8 mol/L、微波功率500 W、料液比 1∶25(g/mL)、提取時間5 min，此條件下多酚提取得率為4.45 %.

2.3 抑菌活性研究

本試驗測定了不同質(zhì)量濃度黑豆花青素的抑菌活性，結(jié)果如表3所示.由表3可知，花青素質(zhì)量濃度低于0.25 mg/mL時，對五種菌株的生長均無抑制作用；質(zhì)量濃度在0.5～1.75 mg/mL對金黃色葡萄球菌的生長有較明顯的抑制作用；質(zhì)量濃度在0.75～1.75 mg/mL對短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的生長有較明顯的抑制作用.在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，花青素的抑菌作用隨著質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng).

由表3可知，用最佳工藝條件下制得的黑豆皮花青素對受試三個菌種均有抑制作用，最小抑菌質(zhì)量濃度均為 0.20 mg/mL，按敏感程度順序依次為: 枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌，大腸桿菌.

表2 正交試驗結(jié)果表

表3 黑豆花青素的最低抑菌質(zhì)量濃度實(shí)驗結(jié)果

3 結(jié) 語

黑豆皮中花青素含量豐富，本研究采用微波輔助離子液體提取法，正交試驗優(yōu)化得到最佳工藝條件為：離子液體濃度1.0 mol/L、微波功率400 W、料液比 1∶20(g/mL)、提取時間5 min，此條件下黑豆花青素的提取率可達(dá)4.45%，離子液體可重復(fù)利用，是一種高效提取黑豆花青素的方法.抗生素的廣泛使用導(dǎo)致耐藥菌株越來越多，本試驗采用濾紙片法確定黑豆皮花青素的抑菌活性，花青素對細(xì)菌的生長具有良好的抑制作用，后續(xù)可對其抑菌機(jī)制等進(jìn)行研究，本研究對更好地為天然抗菌抑菌劑的研發(fā)提供理論依據(jù)，更為黑豆皮的綜合利用開辟新路.