基于Mo/WSe2/血紅素復(fù)合納米材料的比色法對(duì)葡萄糖的檢測(cè)

于 霄，朱志佳，谷夢(mèng)巧，李 慧，楊馥瑞，蔡 晴，楊云慧，胡 蓉

（云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,云南昆明650500）

0 引言

近年來(lái)，糖尿病患病率逐漸升高，糖尿病已經(jīng)成為危害人類(lèi)健康的危險(xiǎn)疾病，同時(shí)也是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要疾病之一[1]。糖尿病患者血液或尿液中葡萄糖含量變化較大，可以通過(guò)測(cè)定人體血液中葡萄糖的含量為糖尿病的診斷提供重要的依據(jù)。因此，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速地檢測(cè)和診斷血液中葡萄糖的含量對(duì)糖尿病的預(yù)防和治療有著重要的意義。

測(cè)定葡萄糖的方法主要有分光光度法[2]、比色法[3]、高效液相色譜法[4]、極譜法[5]及毛細(xì)管電泳法等[6]。相比于其它分析方法，熒光和比色檢測(cè)可以快速、靈敏和選擇性地對(duì)目標(biāo)物做出響應(yīng)。

2007年，Yan等[7]發(fā)現(xiàn)四氧化三鐵納米粒子具有過(guò)氧化物模擬酶的特性，隨著科研工作者的不斷深入研究和探索，納米材料過(guò)氧化物酶被廣泛應(yīng)用于催化研究領(lǐng)域并取得一系列新的研究成果。例如，具有催化作用的納米材料模擬酶有金屬納米材料、貴金屬納米材料、復(fù)合材料和金屬硫化物納米材料等。

層狀過(guò)渡金屬硫族化物（如MoSe2、WSe2、WS2和MoS2等）及其復(fù)合材料具有良好的熱/化學(xué)穩(wěn)定性及導(dǎo)電性，生物相容性，低毒性和大的比表面積等性質(zhì)，吸引了科研工作者的廣泛關(guān)注[8-9]。WSe2是一種典型的層狀過(guò)渡金屬硫族化物，具有類(lèi)似石墨烯的結(jié)構(gòu)。Mo/WSe2是由鉬/鎢金屬層夾在兩個(gè)底層即由三個(gè)原子層(Se-Mo/W-Se)通過(guò)弱范德華力相互作用堆積而成，具有較強(qiáng)的吸附能力、較高的反應(yīng)活性、較強(qiáng)的催化性能等優(yōu)點(diǎn)，因此，層狀Mo/WSe2近來(lái)已被用于生物傳感器[10-11]。然而，Mo/WSe2復(fù)合納米材料的辣根過(guò)氧化物模擬酶性質(zhì)鮮有報(bào)道。

該文利用Mo/WSe2材料具有過(guò)氧化物酶性質(zhì)的特點(diǎn)，以Mo/WSe2材料為主體，設(shè)計(jì)合成Mo/WSe2/血紅素復(fù)合功能納米材料，利用其對(duì)葡萄糖與葡萄糖氧化酶反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫對(duì)TMB的氧化，可實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

電子分析天平（ME104E）德國(guó)賽多利斯集團(tuán)，pH計(jì)（PHS-29A）上海精科雷磁，離心機(jī)（TGL16）長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司，紫外/可見(jiàn)分光度計(jì)（METASH）上海元析儀器有限公司，超聲波清洗器（ST2200HP）上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，真空干燥箱（DZF-6020型）上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)上海和泰儀器有限公司，VTX-E混旋儀 倍捷科技，CS501超級(jí)恒溫器重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；

二硒化鎢（WSe2），納米鉬粉（Mo），血晶質(zhì)，Tris-HCl，TMB，硫酸（H2SO4），購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司（中國(guó)，上海）；過(guò)氧化氫30%（H2O2）購(gòu)于天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司（中國(guó)，天津）；丙酮（C3H6O）購(gòu)于云南楊林工業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司（中國(guó)，昆明），葡萄糖氧化酶購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司（中國(guó)，北京），β-D葡萄糖購(gòu)于百靈威科技有限公司（中國(guó)，北京）。

1.2 功能化的Mo/WSe2/血紅素復(fù)合材料的制備

按溶劑比為DMSO∶H2O=4∶6配制1 mg/mL的血紅素（Hemin）溶液備用。稱(chēng)取0.10 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶于10 mL 50%的乙醇溶液備用。分別稱(chēng)取WSe2（0.50 g）和Mo粉（0.50 g）溶于10 mL PVP溶液中，加入15 mL NaOH（0.03 g/mL）溶液，緊接著超聲（100 W、25～30℃）6 h；超聲后的再在10000 r/min下離心20 min，取下層1/3的沉淀物,即制備成Mo/WSe2。取Mo/WSe2500 μL加入1 mg/mL的Hemin 500 μL，超聲60 min。即制備成Mo/WSe2/血紅素復(fù)合納米材料。

1.3 葡萄糖的測(cè)定

①將β-D葡萄糖（30 μL，1～10 mmol/L）、葡萄糖氧化酶（30 μL，5.0 mg/mL）與Tris-HCl（50 μL，10 mmol/L,pH7.40）在37℃的恒溫培育箱培育8 min，按照順序分別加入Mo/WSe2/血紅素復(fù)合納米材料（30 μL）、TMB（100 μL）和Tris-HCl（80 μL，10 mmol/L,pH7.40），顯色80秒（避光），加入硫酸（50 μL，1.0 mol/L）終止反應(yīng)，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)其吸光度值（波長(zhǎng)范圍為400～500 nm）。

②將β-D葡萄糖（30 μL，1～10 mmol/L）、葡萄糖氧化酶（30 μL，5.0 mg/mL）與Tris-HCl（50 μL，10 mmol/L,pH7.40）在37℃的恒溫培育箱培育8 min，按照順序分別加入Mo/WSe2/血紅素復(fù)合納米材料（30 μL）、TMB（100 μL）和Tris-HCl（80 μL，10 mmol/L,pH7.40），顯色20 min（避光），拍照記錄下顯色照片。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征圖

采用X射線(xiàn)衍射(XRD)對(duì)不同材料進(jìn)行表征，如圖1所示，圖1(a)為金屬鉬；圖1(b)二硒化鎢。

圖1 不同材料的XRD圖（a:金屬鉬；b二硒化鎢)Fig.1 XRD patterns of different materials.(a)Molybdenum metal;(b)Tungsten diselenide

圖2 為復(fù)合納米材料（a）、金屬鉬(b)和二硒化鎢(c)的透射電鏡圖(TEM)，從圖2可以看出，合成的納米復(fù)合材料呈片狀。

圖2 不同材料的透射電鏡圖（a:復(fù)合納米材料;b:金屬鉬；c:二硒化鎢）Fig.2 TEM of different materials.(a)Composite nanomaterials;(b)Molybdenum metal;(c)Tungsten Selenide

2.2 葡萄糖的檢測(cè)原理

合成的Mo/WSe2/血紅素復(fù)合納米材料具有納米模擬酶的性質(zhì)，其活性類(lèi)似于天然的過(guò)氧化物酶，能夠有效地催化葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下氧化產(chǎn)生的H2O2對(duì)3,3',5,5'－四甲基聯(lián)苯胺（TMB）氧化，產(chǎn)生一種特殊的藍(lán)色反應(yīng)，通過(guò)肉眼或者吸光度測(cè)定的方法間接測(cè)定葡萄糖的濃度。

2.3 不同材料對(duì)過(guò)氧化氫的催化性能

取3個(gè)試管，各加入β-D葡萄糖（30 μL，3 mmol/L）、葡萄糖氧化酶（30 μL，5.0 mg/mL）與Tris-HCl（50 μL，10 mmol/L,pH7.40），在37℃的恒溫培育箱培育8 min，在第一支試管中加入Mo/WSe2/血紅素復(fù)合納米材料（30 μL），第二支試管中加入Hemin（30 μL，0.05 mg/mL），第三支試管中加入Mo/WSe2納米片（30 μL，濃度為1/20倍），然后按照順序繼續(xù)在每支試管中都加入TMB（100 μL）和Tris-HCl（80 μL，10 mmol/L,pH7.40），顯色20 min（避光），加入硫酸（50 μL，1.0 mol/L）終止反應(yīng)，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)其吸光度值（波長(zhǎng)范圍為400～500 nm）。如圖3所示，Mo/WSe2/血紅素復(fù)合納米材料的顯色效果遠(yuǎn)好于單獨(dú)的Mo/WSe2納米片及單獨(dú)的血紅素。

圖3 不同材料對(duì)過(guò)氧化氫的催化性能Fig.3 Catalytic properties of different materials for hydrogen peroxide

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4.1 培育時(shí)間對(duì)吸光度的影響

β-D葡萄糖和葡萄糖氧化酶發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生H2O2需要一定的時(shí)間，因此考察了在其它條件相同的情況下，β-D葡萄糖和葡萄糖氧化酶的培育時(shí)間對(duì)吸光度的影響。結(jié)果如圖4所示，在培育時(shí)間為8 min時(shí)得到的吸光度值最大，因此，選擇培育時(shí)間為8 min。

圖4 β-D葡萄糖和葡萄糖氧化酶的培育時(shí)間對(duì)吸光度值的影響Fig.4 The effect of β-D glucose and glucose oxidase incubation time on absorbance value

2.4.2顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響

在避光條件下，考察了TMB催化H2O2反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)的時(shí)間對(duì)吸光度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。當(dāng)顯色時(shí)間為80 s時(shí)，其吸光度值達(dá)到最大，因此選擇80 s作為最佳顯色時(shí)間。

圖5 TMB的顯色時(shí)間對(duì)吸光度值的影響Fig.5 The effect of TMB color development time on absorbance value

2.4.3 葡萄糖氧化酶濃度對(duì)吸光度的影響

葡萄糖氧化酶作為催化劑，對(duì)過(guò)氧化氫的產(chǎn)生起到關(guān)鍵作用。對(duì)其濃度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果見(jiàn)圖6。從圖中可看出，當(dāng)其濃度為5 mg/mL時(shí)，吸光度值最大。因此選擇5 mg/mL為最佳葡萄糖氧化酶濃度。

圖6 不同濃度的葡萄糖氧化酶對(duì)吸光度值的影響Fig.6 The influence of different concentrations of glucose oxidase on absorbance

2.4.4 顯色劑TMB的體積對(duì)吸光度的影響

TMB作為催化反應(yīng)的底物，其濃度對(duì)酶催化顯色反應(yīng)會(huì)有很大的影響作用。固定其它優(yōu)化條件不變，改變加入TMB的體積，對(duì)其測(cè)定吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖7。當(dāng)TMB體積達(dá)到100 μL時(shí)，吸光度值最大。

圖7 TMB體積的對(duì)吸光度值的影響Fig.7 The influence of TMB volume on absorbance value

2.5 不同濃度的葡萄糖檢測(cè)

在最優(yōu)條件下，對(duì)不同濃度的葡萄糖進(jìn)行定量測(cè)定得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（見(jiàn)圖8），圖9為測(cè)定不同濃度的葡萄糖的吸收曲線(xiàn)。吸光度與葡萄糖濃度1～10 mmol/L范圍內(nèi)有線(xiàn)性關(guān)系，檢測(cè)限為0.3 mmol/L，線(xiàn)性方程為y=0.0353x+0.2984，相關(guān)系數(shù)R2=0.96。

圖8 測(cè)定不同濃度葡萄糖的校正曲線(xiàn)Fig.8 Calibration curve for measuring different concentrations of glucose

圖9 不同濃度葡萄糖的紫外吸收曲線(xiàn)（內(nèi)置圖為顯色圖）Fig.9 UV absorption curve of different concentrations of glucose(Inset shows chromogenic chart)

3 結(jié)論

該文利用合成的功能化的Mo/WSe2/血紅素材料具有過(guò)氧化物酶性質(zhì)，能夠催化過(guò)氧化氫與TMB顯色，可應(yīng)用于葡萄糖的定量測(cè)定。該方法簡(jiǎn)單快捷，易于操作，對(duì)葡萄糖的測(cè)定提供了一種新方法。