金納米粒子在比色傳感器中的應(yīng)用研究

唐 玲，張慢樂(lè)，廖詩(shī)晴，郭美彤，何婧琳*，曹 忠*（.長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，電力與交通材料保護(hù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙404）（.重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，重慶403）

0 引言

金納米粒子（AuNPs），通常粒徑分布在1~100 nm之間，又稱(chēng)膠體金，是一種非常穩(wěn)定的納米材料，已被廣泛研究和應(yīng)用[1-2]。AuNPs因其所具有的較強(qiáng)的親和力、獨(dú)特的光學(xué)、熱學(xué)、電子學(xué)、高催化活性、生物相容性等物理化學(xué)性質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用于生化傳感、免疫分析、電化學(xué)分析和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[3-6]。

AuNPs的表面等離子體共振特性導(dǎo)致其最大特征吸收峰波長(zhǎng)在紫外-可見(jiàn)光區(qū)域隨粒子尺寸、形貌和粒子間距離的變化而移動(dòng)，并伴隨著顏色的變化[7]。AuNPs可以通過(guò)與目標(biāo)物質(zhì)形成共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵引起納米粒子的聚集（或抗聚集）來(lái)建立光學(xué)傳感技術(shù)。AuNPs的聚集會(huì)使溶液由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色，相應(yīng)的表面等離子體帶由520 nm向610~670 nm移動(dòng)[8-9]。此外，基于目標(biāo)觸發(fā)制備的功能性AuNPs可用于檢測(cè)各種生物標(biāo)志物[10-11]，基于AuNPs的比色傳感器具有簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于污水處理、食品檢測(cè)、疾病診斷等領(lǐng)域的實(shí)時(shí)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)和快速檢測(cè)[12-14]。該文將從AuNPs的合成、性質(zhì)及其在傳感器中的應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

1 AuNPs的合成

AuNPs因其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)而越來(lái)越受到科學(xué)家們的關(guān)注。AuNPs的制備方法主要分為物理法和化學(xué)法[15-16]。物理方法包括真空冷凝、電彌散、超聲和激光消融。物理方法可以控制AuNPs的形狀，但通常需要大型設(shè)備[17]，且方法復(fù)雜，納米顆粒的粒徑分布不均勻?；瘜W(xué)方法包括檸檬酸還原法、巰基配體法、種子晶體生長(zhǎng)法以及電化學(xué)和光化學(xué)方法[18]。下面介紹幾種常用的AuNPs合成方法。

1.1 檸檬酸鈉還原法

檸檬酸還原法，也被稱(chēng)為T(mén)urkevich-Frens法，是Turkevich[19]首先描述的一種簡(jiǎn)單的水相氧化還原法，是目前合成AuNPs常用的方法之一。首先將一定濃度的氯金酸溶液煮沸，加入一定量的檸檬酸鈉溶液，Au(III)被還原并聚集形成金芯。通過(guò)靜電相互作用，離子（H+，AuCl4-）吸附在金芯表面，形成穩(wěn)定的膠體金溶液[20]。檸檬酸鈉作為還原劑，可以作為配體修飾AuNPs的表面，以防止AuNPs的聚集和沉淀[21]。圖1是用經(jīng)典的檸檬酸鈉還原法制備的AuNPs（13 nm）的透射電鏡表征圖。該方法簡(jiǎn)單，制備的AuNPs分散性好，粒徑分布均勻。粒徑受氯金酸與檸檬酸鈉的比例影響，通過(guò)改變比例可以控制在3~100 nm范圍內(nèi)[22]。

1.2 巰基配體法

在巰基配體法中，將氯金酸和巰基配體添加到雙相或單相溶劑中，然后加入強(qiáng)還原劑（硼氫化鈉）將Au3+還原為AuNPs。巰基配體可以通過(guò)Au-S鍵與AuNPs表面結(jié)合[21]。該方法制備的AuNPs尺寸分布較窄，一般在0.8~8 nm之間。根據(jù)溶劑的極性，該方法可分為單相和雙相法。在單相法中[23]，使用水溶性的巰基配體，如巰基乙酸、半胱氨酸或谷胱甘肽作為配體，在水中制備具有良好分散性的AuNPs。雙相法中經(jīng)常使用烷基硫醇作為配體，制備的AuNPs具有良好的油溶性，且在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定[24]。Brust-Schiffrin法[25]是一種經(jīng)典的巰基配體法，它以四辛基溴化銨為試劑，將氯金酸從水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)相，然后分別以NaBH4和硫醇作為還原劑和配體制備AuNPs。四辛基溴化銨可作為相轉(zhuǎn)移劑和穩(wěn)定劑保護(hù)AuNPs[26]。

1.3 種子晶體生長(zhǎng)法

在種子生長(zhǎng)法中，以水相氧化還原法制備的小AuNPs為種子，以氯金酸溶液為生長(zhǎng)溶液，將氯金酸還原到AuNPs表面，生成大的AuNPs[27]。如圖2所示，通過(guò)控制晶體與生長(zhǎng)溶液的比例，可以制備出球形、棒狀和三角形等不同尺寸和形貌的顆粒[28]。El-Sayed等[29]以十六烷基三甲基溴化銨修飾的AuNPs為種晶，制備了軸向比可控的金納米棒。

圖2 在不同條件下合成的AuNPs的TEM（插圖SEM）圖像[28]Fig.2 TEM(inset SEM)images of Au nanoparticles synthesized under different conditions[28]

2 AuNPs在比色傳感中的應(yīng)用

對(duì)于AuNPs而言，納米粒子之間的距離縮短或納米粒子的粒徑變大，體系的顏色由酒紅色逐漸變成紫色或者藍(lán)色。AuNPs聚集引起的顏色變化為比色分析提供了基礎(chǔ)[30-31]?；贏uNPs的比色分析的主要優(yōu)點(diǎn)是分子識(shí)別事件可以轉(zhuǎn)化為顏色變化，肉眼可以很容易地觀察到[32]。重要的是，由于AuNPs的消光系數(shù)極高，因此基于AuNPs的比色測(cè)定法具有極高的靈敏度，并已用于檢測(cè)包括DNA和蛋白質(zhì)在內(nèi)的許多物質(zhì)[33]。

2.1 基于交聯(lián)的AuNPs的聚集

在交聯(lián)比色法中，AuNPs表面上的目標(biāo)化合物與配體形成絡(luò)合物，從而縮短了顆粒間距離并引起聚集[34]。該方法需要用特定的配體對(duì)納米粒子進(jìn)行修飾。通常，配體的一個(gè)末端應(yīng)具有巰基，而另一末端應(yīng)具有可以與靶標(biāo)結(jié)合的官能團(tuán)。配體的巰基可以通過(guò)強(qiáng)Au-S鍵與AuNPs的表面結(jié)合[35]。在目標(biāo)物的存在下，配體也與目標(biāo)物結(jié)合，縮短了AuNPs之間的距離并引起聚集[36]。Yan等[37]基于AuNPs的交聯(lián)或非交聯(lián)聚集提出了兩種獨(dú)立的比色策略，用于同時(shí)監(jiān)測(cè)多個(gè)miRNA（圖3）。通過(guò)引入Y形DNA結(jié)構(gòu)和兩種類(lèi)型的DNA修飾的AuNPs，可以輕松開(kāi)發(fā)出三輸入DNA AND邏輯門(mén)，并以AuNPs的交聯(lián)聚集作為信號(hào)輸出。為了提高靈敏度并縮短反應(yīng)時(shí)間，通過(guò)進(jìn)一步使用形成雙鏈體和雜交鏈反應(yīng)的三條DNA鏈來(lái)修飾邏輯門(mén)，且AuNPs的非交聯(lián)聚集可用于評(píng)估初始miRNA輸入的濃度。

圖3 （A）交聯(lián)和（B）非交聯(lián)策略檢測(cè)多種miRNA的插圖[37]Fig.3 Illustration of Multiple miRNAs Detection with(A)CA and(B)NCA Strategies[37]

2.2 基于鹽老化的AuNPs聚集

在鹽老化方法中，有檸檬酸鈉還原法得到的AuNPs對(duì)檸檬酸的親和力很弱，檸檬酸很容易被更強(qiáng)的配體取代。通過(guò)加入NaCl，德拜長(zhǎng)度縮短，AuNPs可以更接近彼此，進(jìn)入一個(gè)有吸引力的范德華力區(qū)，而范德華力區(qū)是其聚集的原因。AuNPs具有非常大的Hamaker常數(shù)（即很強(qiáng)的范德華力），這使得它們特別容易聚集。柔性的單鏈DNA（ssDNA）可以暴露其堿基，吸附在AuNPs上；而雙鏈DNA（dsDNA）具有穩(wěn)定的雙螺旋幾何結(jié)構(gòu)，暴露在外的帶負(fù)電的磷酸鹽骨架，與AuNPs之間發(fā)生靜電相互作用，因此dsDNA不會(huì)被吸附?；趕sDNA和dsDNA對(duì)AuNPs的不同的結(jié)合特性，已經(jīng)被廣泛用于比色生物傳感器的制備，根據(jù)粒子間的距離變化，檢測(cè)AuNPs從紅色到藍(lán)色（聚集）或從藍(lán)色到紅色的顏色變化（抗聚集）。

大多數(shù)的分析都是通過(guò)AuNPs的聚集來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而很少的分析是通過(guò)AuNPs的抗聚集機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。將游離的特異性適體（DNA/RNA片段，核酸適體或非巰基有機(jī)小分子）與AuNPs混合，并通過(guò)弱相互作用與其表面結(jié)合。在高鹽濃度下，納米顆粒保持分散并呈紅色。目標(biāo)物與適體之間的結(jié)合力更強(qiáng)使配體脫離AuNPs的表面，從而導(dǎo)致AuNPs聚集，顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色。Wang等[38]介紹了一種基于AuNPs的比色檢測(cè)和雜交鏈反應(yīng)（HCR）擴(kuò)增的高靈敏度、特異性DNA檢測(cè)方法。如圖4所示，設(shè)計(jì)了兩種發(fā)夾式輔助探針，其末端為ssDNA，能夠穩(wěn)定AuNPs，有效防止其在鹽誘導(dǎo)下的聚集。目標(biāo)DNA與發(fā)夾輔助探針雜交，觸發(fā)HCR反應(yīng)形成dsDNA聚合物。因此，沒(méi)有ssDNA的末端，形成dsDNA聚合物后，AuNPs的穩(wěn)定性較差，當(dāng)鹽濃度增加時(shí)，AuNPs發(fā)生聚集。隨后，在膠體溶液中觀察到溶液顏色從紅色到藍(lán)色的變化。該系統(tǒng)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，使用方便。這種策略消除了對(duì)酶反應(yīng)、分離過(guò)程、化學(xué)修飾和精密儀器的需要。檢測(cè)和識(shí)別過(guò)程可以用肉眼看到。重要的是，該方案為確定完全匹配的目標(biāo)寡核苷酸和單堿基對(duì)不匹配的目標(biāo)之間提供了高選擇性。

圖4 使用金納米顆粒和雜交鏈反應(yīng)擴(kuò)增技術(shù)對(duì)DNA進(jìn)行高靈敏比色檢測(cè)的示意圖[38]Fig.4 Schematic of Highly Sensitive Colorimetric Detection of DNA by the Use of Gold Nanoparticles and Hybridization Chain Reaction Amplification[38]

基于AuNPs的無(wú)標(biāo)記比色檢測(cè)的各種策略已經(jīng)有許多報(bào)道。人們普遍認(rèn)為，游離適配體可以保護(hù)AuNPs免受鹽誘導(dǎo)的聚集，而靶向適配體不能。然而，這些研究只考慮了適配體與靶標(biāo)的結(jié)合，以及適配體對(duì)AuNPs的吸附，而沒(méi)有考慮AuNPs對(duì)靶標(biāo)的吸附。其中，劉玨文教授團(tuán)隊(duì)[39]報(bào)道了腺苷（Ade）吸附使檸檬酸包封的AuNPs不穩(wěn)定，腺苷的Kd僅為7.7 μmol/L，而ATP吸附穩(wěn)定AuNPs是因?yàn)槿姿峄鶐ж?fù)電荷（圖5），吸附的ATP抑制了DNA的吸附。使用適體和非結(jié)合突變體，無(wú)論DNA序列如何，ATP和鳥(niǎo)苷5'-三磷酸（GTP）具有相同的比色響應(yīng)，腺苷和鳥(niǎo)苷也是如此，表明顏色變化主要反映了核苷和核苷酸的吸附，而不是適體結(jié)合。在此文中，以Ade和ATP為模型，詳細(xì)闡述了靶標(biāo)、適體和AuNPs的相互作用。

圖5 通過(guò)適體和金納米顆粒感測(cè)腺苷和ATP[39]Fig.5 Sensing Adenosine and ATP by Aptamers and Gold Nanoparticles[39]

2.3 基于靜電吸附的AuNPs的聚集

鹽誘導(dǎo)的AuNPs聚集是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，并且樣品的顏色不斷變化，難以進(jìn)行定量測(cè)量[40-41]。大多數(shù)研究都在單個(gè)樣品中測(cè)量了AuNPs的吸光度，時(shí)間點(diǎn)和吸光度可能仍會(huì)隨時(shí)間發(fā)生顯著變化。新鮮制備的AuNPs由于其負(fù)電荷而被其表面檸檬酸鹽配體所穩(wěn)定[42]，加鹽通過(guò)降低AuNPs的負(fù)電勢(shì)來(lái)屏蔽電荷排斥[43]。Liu等[44]提出降低負(fù)電荷密度的另一種方法是：吸附陽(yáng)離子分子以中和表面電荷，這能帶來(lái)更快的顏色變化和潛在的更穩(wěn)定的聚集體。通過(guò)使用帶正電荷的分子進(jìn)行電荷中和，例如DNA染色染料SYBR Green I（SG），以實(shí)現(xiàn)AuNPs的高效且穩(wěn)定的組裝（圖6a）。DNA染色染料通常帶正電[45]，他們發(fā)現(xiàn)SG可以在少數(shù)幾種化合物中形成高度穩(wěn)定的AuNPs聚集體，顏色可能會(huì)保留幾天。另外，所顯影的顏色比鹽誘導(dǎo)的顏色要穩(wěn)定得多，SG的電荷中和作用通過(guò)zeta電位測(cè)量得到證實(shí)。由于SG可以嵌入dsDNA螺旋中并被dsDNA屏蔽[46-47]，因此SG誘導(dǎo)的聚集也可以通過(guò)dsDNA的形成或解離來(lái)調(diào)節(jié)。這樣，與鹽誘導(dǎo)的聚集相比，SG誘導(dǎo)的AuNPs組裝可演變?yōu)榫哂卸喾N優(yōu)勢(shì)的靈活生物傳感平臺(tái)，具有更強(qiáng)烈和穩(wěn)定的顏色變化以及更高的靈敏度。SG誘導(dǎo)的AuNPs組裝被開(kāi)發(fā)為無(wú)標(biāo)記的比色傳感平臺(tái)（圖6b），得益于強(qiáng)烈的顏色變化，這種新的傳感策略允許視覺(jué)檢測(cè)限低至0.1 nmol/L DNA，比鹽誘導(dǎo)的策略低50倍。

圖6 （a）NaCl電荷篩選和SG電荷中和的示意圖。（b）使用所提出的SG誘導(dǎo)AuNPs聚集的DNA分析的示意圖[44]Fig.6(a)schematic illustration of charge screening of NaCl and charge neutralization of SG.(b)schematic illustration of the DNA analysis using the proposed SG-induced aggregation of AuNPs[44]

帶正電荷的金納米顆粒（(+)AuNPs）可以有效區(qū)分長(zhǎng)鏈DNA和短鏈DNA，從而為比色分析檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單直觀的方法。由于帶正電荷的AuNPs與帶負(fù)電荷的DNA鏈之間的靜電吸附作用，當(dāng)直接向(+)AuNP中添加ssDNA或dsDNA時(shí)，AuNP溶液的顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色，而片段DNA不能誘導(dǎo)(+)AuNP溶液的顏色變化。基于此構(gòu)建了一系列的由長(zhǎng)短鏈對(duì)AuNPs的不同作用的比色傳感器，其中Li等[48]描述了一種簡(jiǎn)單，快速且通用的比色法，使用(+)AuNPs作為探針來(lái)測(cè)量核酸酶活性。如圖7所示，當(dāng)將ssDNA或dsDNA直接添加到(+)AuNPs中時(shí)，AuNP溶液顯示出從紅色到藍(lán)色的顏色變化，而片段化的DNA無(wú)法誘導(dǎo)(+)AuNPs溶液的顏色變化。S1核酸酶對(duì)ssDNA或RNA的磷酸二酯鍵具有內(nèi)切和外切水解活性，并產(chǎn)生單核苷酸或寡核苷酸片段，以該酶為模型，以提供該方法的原理驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。ssDNA用作核酸酶底物，(+)AuNPs和聚陰離子DNA之間的靜電吸引導(dǎo)致AuNPs聚集，這導(dǎo)致溶液快速的紅到藍(lán)顏色變化。在存在核酸酶的情況下，ssDNA水解成小片段，AuNPs溶液保持紅色。因此，可以用肉眼或簡(jiǎn)單的比色法方便地測(cè)量核酸酶活性。

圖7 基于帶正電的金納米顆粒（(+)AuNPs）的顏色變化的核酸酶活性的比色測(cè)定[48]Fig.7 Colorimetric assay of nuclease activity based on the color change of the positively charged gold nanoparticles((+)AuNPs)[48]

3 結(jié)論與展望

AuNPs作為一種多功能納米材料具有廣闊的應(yīng)用前景。AuNPs具有良好的電子學(xué)和物理學(xué)特性、易于表面修飾等優(yōu)點(diǎn)，使得AuNPs成為學(xué)術(shù)研究領(lǐng)域中被研究最廣泛的納米材料之一。AuNPs聚集（或抗聚集）過(guò)程中的顏色變化為比色傳感提供了一個(gè)良好的檢測(cè)策略，利用該策略可實(shí)現(xiàn)任何直接或間接觸發(fā)AuNPs聚集（或抗聚集）的目標(biāo)物的比色分析?；贏uNPs的比色傳感器具有靈敏度高、無(wú)需昂貴設(shè)備、操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)迅速等特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

然而，在AuNPs比色傳感器的廣泛應(yīng)用之前，還有幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題需要解決。首先，目前的AuNPs制備方法無(wú)法滿(mǎn)足合成高度均勻納米材料的廣泛應(yīng)用需求，且大多數(shù)傳統(tǒng)的合成過(guò)程需要較長(zhǎng)的時(shí)間和繁瑣的洗滌步驟，這極大地限制了此類(lèi)傳感器的實(shí)際應(yīng)用。其次，在實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)于構(gòu)建基于金納米粒子的比色傳感平臺(tái)而言，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的定量檢測(cè)至關(guān)重要。盡管豐富的顏色變化已經(jīng)滿(mǎn)足了用肉眼進(jìn)行更精確檢測(cè)的需求，但是用肉眼進(jìn)行顏色辨別暫不能對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行最準(zhǔn)確的檢測(cè)?？傊ㄟ^(guò)逐步解決難點(diǎn)，該檢測(cè)策略將會(huì)因其顯著的優(yōu)勢(shì)受到廣泛關(guān)注，為這項(xiàng)技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室到大規(guī)模應(yīng)用的轉(zhuǎn)變帶來(lái)機(jī)遇和挑戰(zhàn)。