信號(hào)放大策略在疾病標(biāo)志物電化學(xué)生物傳感器中的研究

畢 倩，袁 若，向 云

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

0 前言

為了讓傳感器適應(yīng)社會(huì)需求，在環(huán)境檢測(cè)、臨床醫(yī)學(xué)、食品安全方面擴(kuò)大其應(yīng)用潛力，提供更加準(zhǔn)確、高效的分析平臺(tái)，研究者就傳感器的性能進(jìn)行了探究。靈敏度和選擇性是衡量標(biāo)準(zhǔn)傳感器性能優(yōu)異的關(guān)鍵，因?yàn)樵趯?shí)際樣品分析過(guò)程中，面臨著待測(cè)樣品成分復(fù)雜、含量極低而使分析物不易被傳感器響應(yīng)到其存在的問(wèn)題。因此，為實(shí)現(xiàn)傳感器在分析中展示出高特異性、高靈敏度的優(yōu)良性能，研究者們提出了一系列的信號(hào)放大策略，結(jié)合電化學(xué)傳感快速、穩(wěn)定、易操作的優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)建了眾多性能優(yōu)異的電化學(xué)生物傳感器。該文就針對(duì)改善傳感器性能而提出的幾類(lèi)信號(hào)放大策略做簡(jiǎn)要闡述[1-5]。

1 基于酶輔助的信號(hào)放大策略

1.1 基于核酸酶的信號(hào)放大策略

核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶統(tǒng)稱(chēng)為核酸酶，它像一把剪刀，能將DNA或RNA剪切成不同的序列片段，這是由于它催化并使DNA磷酸骨架上的磷酸二酯鍵發(fā)生水解。由于酶與底物之間專(zhuān)一性的催化過(guò)程，種類(lèi)不同的核酸酶對(duì)應(yīng)催化底物的種類(lèi)和被識(shí)別切割的位置不同。因此，將核酸酶與傳感器的信號(hào)放大技術(shù)相結(jié)合，可以給傳感器帶來(lái)高選擇性。研究者們根據(jù)不同的設(shè)計(jì)目的，將核酸酶作為一種輔助工具，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的循環(huán)放大過(guò)程或者驅(qū)動(dòng)DNA的自組裝行為，由此得到選擇性高、靈敏度高的傳感器用于多種疾病標(biāo)志物的檢測(cè)。

核酸外切酶能沿特定方向?qū)⒐押塑账徭湉哪┒碎_(kāi)始降解。T7核酸外切酶（T7 Exonuclease，EXO T7）沿5'→3'方向作用于雙鏈DNA或雜交狀態(tài)RNA/DNA的平末端或粘性末端（5'凹陷端）的磷酸二脂鍵，使得沿5'→3'方向上的DNA或RNA被降解成單個(gè)核苷酸。Miao等[6]利用EXO T7輔助目標(biāo)RNA循環(huán)放大，結(jié)合銅納米簇（CuNPs）構(gòu)建電化學(xué)傳感策略檢測(cè)miRNA。具體工作如圖1，目標(biāo)RNA經(jīng)Toehold鏈置換掉雙鏈a/b的b鏈并形成RNA/a雜交雙鏈，RNA/a出現(xiàn)可以被EXO T7催化水解的5'平末端。EXO T7降解a后從RNA/a釋放出RNA，以此作為一個(gè)循環(huán)。RNA再次與a/b作用，形成1比n的多次鏈置換和釋放過(guò)程，由此達(dá)到對(duì)痕量目標(biāo)RNA濃度的放大，并通過(guò)這樣的循環(huán)放大釋放出大量b鏈。釋放的b鏈與電極上固定的雙鏈c/d雜交形成5'粘性末端，EXO T7沿5'→3'降解d鏈，導(dǎo)致電極上剩下單鏈固定探針c，破壞掉能與銅納米簇結(jié)合的雙鏈c/d信號(hào)源模板，得到顯著降低的電流信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA的高靈敏檢測(cè)。

圖1 基于Exo T7信號(hào)放大的傳感器檢測(cè)miRNA[6]Fig.1 Determination of miRNA based on T7 exonuclease-assisted cascade signal amplification sensor[6]

與核酸外切酶不同，限制性核酸內(nèi)切酶（又稱(chēng)限制酶）的催化水解位置需要一段特定的識(shí)別序列，從識(shí)別序列內(nèi)或其鄰近的位置處切割雙鏈DNA，而不是沿著寡核苷酸的端點(diǎn)開(kāi)始催化降解。Miao等[7]報(bào)告了一種基于限制酶裂解DNA的信號(hào)放大策略對(duì)Ag+進(jìn)行超靈敏電化學(xué)檢測(cè)。圖2所示為這項(xiàng)工作中傳感策略的原理：將修飾了探針a的AuNPs與固定在電極上的b探針雜交，使得信號(hào)源模板a/AuNPs定位在電極表面上。探針c和b之間具有一個(gè)不匹配的胞嘧啶-胞嘧啶（C-C），在目標(biāo)Ag+的作用下，即可形成CAg+-C形式的復(fù)合物，使得探針b和c雜交。Ag+輔助的雙鏈DNA（b/c）具有兩個(gè)核酸內(nèi)切酶Nt.CviPII的切割位點(diǎn)。因此，探針b可以被這種切口內(nèi)切核酸酶（NEase）切割成碎片，從而導(dǎo)致雙鏈體b/c和b/a解體并釋放出a/AuNPs，破壞了信號(hào)源模板a/AuNPs在電極上的定位。隨后，從電極表面釋放出Ag+，使得游離探針c再次與另一個(gè)完整的探針b雜交作用，經(jīng)過(guò)更多的切割循環(huán)后，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)Ag+循環(huán)放大和c的循環(huán)利用，導(dǎo)致更多的能負(fù)載電活性物質(zhì)[Ru(NH3)6]3+的a/AuNPs模板離開(kāi)電極表面，可以觀察到顯著降低的電化學(xué)信號(hào)，從而達(dá)到檢測(cè)目的。

圖2 NEase輔助的信號(hào)放大策略測(cè)定Ag+的圖解[7]Fig.2 NEase-assisted signal amplification strategy for the determination of Ag+[7]

1.2 基于連接酶的信號(hào)放大

DNA連接酶與核酸酶的催化作用相反，它可連接DNA鏈3'末端的羥基和另一DNA鏈5'末端的磷酸基團(tuán)，使兩者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連成完整的鏈。DNA連接酶在傳感器信號(hào)放大中作為一種常用的工具酶，被利用來(lái)構(gòu)建了許多高靈敏傳感器。

Chen等[8]利用連接酶使突變體K-ras靶基因呈指數(shù)型復(fù)制擴(kuò)增，構(gòu)建了一種高靈敏的用于單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法。如圖3，在這項(xiàng)工作中：在DNA連接酶的作用下，K-ras靶基因作為模板鏈分別連接DNA探針A和B，探針CP和DP，以此雜交形成新的模板鏈AB和單鏈CPDP。在熱循環(huán)的作用下，K-ras靶基因被釋放與模板鏈AB循環(huán)參與到下一個(gè)酶促連接反應(yīng)，從而導(dǎo)致酶連接產(chǎn)物的擴(kuò)增。來(lái)自新一輪連接的產(chǎn)物成為下一輪的靶標(biāo)，由此得到以指數(shù)型方式擴(kuò)增的酶連接產(chǎn)物，將更多的富含G序列的DP鏈連接在電極上。在添加輔助序列AP和hemin后，形成大量的G-四鏈體/hemin模擬酶，并導(dǎo)致ECL信號(hào)顯著淬滅，實(shí)現(xiàn)對(duì)單核苷酸多態(tài)性靈敏測(cè)定。

圖3 基于DNA連接酶測(cè)定基因[8]Fig.3 DNA ligase assisted gene determination[8]

1.3 基于聚合酶的信號(hào)放大

DNA聚合酶是DNA復(fù)制過(guò)程中必不可少的工具酶，在檢測(cè)痕量靶標(biāo)基因時(shí)被廣泛運(yùn)用于DNA的擴(kuò)增過(guò)程。它能將單個(gè)核苷酸（dNTP）沿著模板鏈加到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵。其具體過(guò)程是：在一段特定的引物序列3'-OH末端，DNA聚合酶催化dNTP加入核苷酸鏈的3'-OH末端形成新的DNA鏈。由于DNA聚合酶對(duì)其引物的專(zhuān)一性及相關(guān)模板鏈的可設(shè)計(jì)性，它成為一種理想的DNA放大擴(kuò)增工具，被廣泛運(yùn)用于傳感器的信號(hào)放大策略中。

Wang等[9]在循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）的超靈敏檢測(cè)過(guò)程中，利用雙酶輔助的多重?cái)U(kuò)增策略，實(shí)現(xiàn)了對(duì)靶標(biāo)基因的循環(huán)放大和電極表面的電信號(hào)放大。如圖4，這項(xiàng)工作具體的檢測(cè)原理是：由三螺旋分子開(kāi)關(guān)（THMS）作為生物傳感器的分子識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)探針，核糖核酸酶HII（RNase HII）和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）作為雙重酶輔助的多重?cái)U(kuò)增促進(jìn)劑。目標(biāo)ctDNA打開(kāi)THMS并雜交形成雙鏈RP/ctDNA，觸發(fā)RNase HII切割雙鏈RP/ctDNA并釋放ctDNA，ctDNA循環(huán)識(shí)別打開(kāi)THMS，從而產(chǎn)生大量的探針STP。STP與固定在金電極上的捕獲探針CP雜交，在TdT的作用下，沿著CP的3'-OH末端延伸并產(chǎn)生穩(wěn)定的含有富T序列的DNA樹(shù)狀納米結(jié)構(gòu)，最后使得亞甲基藍(lán)（MB）嵌入DNA樹(shù)狀結(jié)構(gòu)中，產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的電信號(hào)，從而達(dá)到檢測(cè)目的。該傳感平臺(tái)能在血漿等生物流體中檢測(cè)ctDNA。此外，改變THMS的環(huán)序列，該策略可擴(kuò)展到其他ctDNA的檢測(cè)中，針對(duì)臨床癌癥的篩查具有潛應(yīng)用價(jià)值。

圖4 雙酶輔助多重?cái)U(kuò)增的傳感器[9]Fig.4 Dual-enzyme-assisted multiplex amplification sensor[9]

近年來(lái)，由DNA聚合酶反應(yīng)衍生而來(lái)的滾環(huán)放大技術(shù)（RCA）在傳感策略的信號(hào)放大環(huán)節(jié)中也被廣泛應(yīng)用，這為癌癥的便捷轉(zhuǎn)移診斷，預(yù)后和治療提供了有用的信息。如圖5，Yang等[10]的這項(xiàng)工作中，在固定電極上通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增，在引物和環(huán)狀DNA模板的作用下，以產(chǎn)生具有許多重復(fù)的適體序列多價(jià)、有效地捕獲人血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）。基于RCA的適體鏈擴(kuò)增過(guò)程使得傳感器捕獲靶標(biāo)CTC的能力增強(qiáng)，大大提高了傳感器的靈敏度。此外，該工作還實(shí)現(xiàn)了在全血中檢測(cè)CTC，針對(duì)監(jiān)測(cè)人血中CTC的研究提供了可發(fā)展平臺(tái)。

圖5 基于RCA信號(hào)放大測(cè)定CTC[10]Fig.5 Determination of CTC based on RCA signal amplification[10]

1.4 基于DNAzyme的信號(hào)放大

DNAzyme是一段特定的具有催化功能的核酸序列的DNA核酸酶，具有金屬離子依賴(lài)性，借助特定金屬離子作為輔因子，可以特異性雜交并切割底物序列。由于其高選擇性和高催化功能，被廣泛運(yùn)用于傳感的信號(hào)放大環(huán)節(jié)來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度。

Lei等[11]利用DNAzyme驅(qū)動(dòng)的DNA Walker構(gòu)建了高靈敏度測(cè)定凝血酶（TB）的電化學(xué)生物傳感器。 該工作具體如圖6，在電極上固定上一種雙重功能發(fā)夾DNA（HP），其中環(huán)區(qū)域設(shè)計(jì)為Mg2+依賴(lài)的DNAzyme特異性識(shí)別的底物序列，莖區(qū)域設(shè)計(jì)為G-四鏈體序列片段。當(dāng)目標(biāo)物TB存在時(shí)，適體靶特異性識(shí)別TB并將具有酶促序列的DNA walker（TBA2-DWs）間接引入至金電極，由此引發(fā)酶促序列DNAzyme與底物序列雜交。在Mg2+的輔助下，DNA Walker重復(fù)雜交并切割底物HP，釋放許多G-四鏈體。最后，hemin進(jìn)一步結(jié)合G-四鏈體形成G-四鏈體/hemin絡(luò)合體并產(chǎn)生增強(qiáng)的電流輸出。該方法檢測(cè)限低至0.58 pmol/L，且檢測(cè)過(guò)程是免標(biāo)記和無(wú)蛋白酶參與的。

圖6 基于DNAzyme的電化學(xué)傳感器的示意圖[11]Fig.6 Scheme of the DNAzyme-Based Electrochemical Sensor[11]

Yang等[12]構(gòu)建了免標(biāo)記型的傳感器用于凝血酶的檢測(cè)，傳感原理如圖7，在凝血酶的作用下，兩個(gè)不同的凝血酶適體鏈（S1和S2）的鄰近結(jié)合置換出Mg2+依賴(lài)性的酶促序列S3，S3與電極上的發(fā)夾底物DNA雜交并剪切。在K+和氯化血紅素（hemin）的協(xié)作下，電極上裂解出的底物鏈通過(guò)Hoogsteen氫鍵形成籠狀的G-四鏈體/hemin絡(luò)合物。最終導(dǎo)致hemin被捕獲在電極上并向電極轉(zhuǎn)移電子，從而產(chǎn)生DPV電信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶的檢測(cè)。

圖7 免標(biāo)記電化學(xué)方法測(cè)定凝血酶示意圖[12]Fig.7 Schematic diagram of label-free electrochemical method for determination of thrombin[12]

2 基于納米材料的信號(hào)放大技術(shù)

在傳感器研究方面，為了得到更靈敏的、性能優(yōu)異的電化學(xué)生物傳感器，研究者們結(jié)合納米材料尺寸效應(yīng)帶來(lái)的獨(dú)特物化性質(zhì)（如生物相容性好，比表面積大易修飾，導(dǎo)電性能優(yōu)異），從不同的途徑對(duì)傳感器進(jìn)行了信號(hào)放大[13]。其主要途徑有：將納米材料作為基底修飾在電極上增強(qiáng)其導(dǎo)電性，作為載體用于固載大分子形成信號(hào)探針或識(shí)別元件[14]。

2.1 納米材料修飾電極基底的電化學(xué)傳感平臺(tái)

研究者們利用納米粒子體現(xiàn)出來(lái)的優(yōu)異理化性質(zhì)，將納米材料與電極傳感界面相結(jié)合，加快了電子向電極的轉(zhuǎn)移和傳導(dǎo)效率，制備出了一系列響應(yīng)快速、導(dǎo)電性能強(qiáng)的電極基底材料進(jìn)行信號(hào)放大，成功提高了電化學(xué)生物傳感器的靈敏度。常用到納米基底材料有：碳納米材料（如石墨烯、氧化性或還原性石墨烯）、金屬納米材料（AuNPs）或金屬?gòu)?fù)合納米材料[15]。

石墨烯是一種sp2雜化的二維碳納米材料，具有較大的比表面積和快速傳輸電子的能力[16]。利用其氧化物即氧化石墨烯（GO）經(jīng)電沉積制備成還原石墨烯（rGO）并修飾在電極上提高傳感器靈敏度，是一種成熟的信號(hào)放大方法。如圖8所示，Gan等[17]經(jīng)電沉積制備rGO作為電極的基底，增強(qiáng)了電活性物質(zhì)[Ru（bpy）3]2+在傳感表面發(fā)生氧化還原時(shí)的電子轉(zhuǎn)移能力，結(jié)合基于末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）的信號(hào)放大技術(shù)，構(gòu)建了簡(jiǎn)易且高靈敏的電化學(xué)生物傳感器，用于監(jiān)測(cè)酸性磷酸酶（ACP）的活性。 此外，該傳感策略還成功在稀釋的血清樣品中檢測(cè)ACP，具有快速、高選擇性，高靈敏度的檢測(cè)性能。

圖8 基于TdT和rGO構(gòu)建電化學(xué)方法測(cè)定ACP[17]Fig.8 Determination of ACP by an electrochemical method based on TdT and rGO[17]

如Ma等[18]使用二維（2D）金屬-有機(jī)骨架（MOF）納米材料2D Cu-TCPP作為電極基底，結(jié)合G-四鏈體/hemin構(gòu)建了檢測(cè)雙氧水（H2O2）的高靈敏電化學(xué)生物傳感器。如圖9，在這項(xiàng)工作中，研究者以（4-羧基苯基）卟啉（TCPP）為配體，結(jié)合Cu2+制備了二維Cu-TCPP MOF材料作為電極基底修飾在電極上。該材料的二維多孔結(jié)構(gòu)化學(xué)穩(wěn)定性好、比表面積大，具有高密度和均勻分散的活性位點(diǎn)，且具有過(guò)氧化物模擬酶的催化活性。將其結(jié)合G-四鏈體/hemin辣根過(guò)氧化物模擬酶的性質(zhì)，能夠有效地催化靶標(biāo)H2O2在傳感界面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，提供了足夠暴露的活性位點(diǎn)與H2O2接觸。又由于其優(yōu)異的電化學(xué)性質(zhì)，使電子轉(zhuǎn)移快速，增強(qiáng)了傳感器的信號(hào)放大能力和靈敏度。

圖9 基于二維Cu-TCPP納米膜的電化學(xué)傳感器[18]Fig.9 An electrochemical sensor based on twodimensional Cu-TCPP nanomaterials[18]

2.2 納米材料為載體固載信號(hào)探針或信號(hào)分子

在構(gòu)建電化學(xué)生物傳感平臺(tái)時(shí)，由于納米材料具有較大的比表面積且和良好的生物相容性，被視為理想的生物大分子（如蛋白質(zhì)、DNA）的承載介質(zhì)。利用納米材料作為載體修飾上識(shí)別元件（如適配體、抗體等）的傳感器，增加了識(shí)別元件捕獲靶標(biāo)的接觸概率從而提高了傳感器的靈敏度。另一方面，利用納米材料大的比表面積和暴露出的活性位點(diǎn)固載上大量信號(hào)分子，得到信號(hào)源更強(qiáng)的復(fù)合電活性物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)傳感器的電信號(hào)放大。

復(fù)合材料的信號(hào)放大原理與生物活性材料的親和力緊密相關(guān)，而磁性納米復(fù)合材料可以顯著提高傳感器的性能。氮摻雜碳微管（NCMTs）作為一種新型的碳材料，由于其大的表面積，高的電導(dǎo)率和低的細(xì)胞毒性而受到了廣泛的關(guān)注，且摻雜在復(fù)合材料中的氮原子可以顯著增強(qiáng)納米材料的活性位點(diǎn)。Zheng等[19]通過(guò)硅酸銅與氮摻雜磁性碳微管（NCMTs）合成NCMTs@Fe3O4@Cusilicate，設(shè)計(jì)了一種新型生物傳感器，用于測(cè)定癌胚抗原CEA腫瘤標(biāo)志物。如圖10，在這項(xiàng)工作中，他們制備了NCMTs@Fe3O4@Cusilicate，其較大的表面積在銅離子的作用下能特異性識(shí)別CEA的刀豆蛋白（ConA）并螯合，增強(qiáng)了ConA的吸附能力和負(fù)載量，從而提高了與靶標(biāo)CEA的接觸概率，增強(qiáng)傳感器的靈敏度。另一方面，結(jié)合金納米團(tuán)簇（AuNCs）出色的生物相容性、小尺寸、高電導(dǎo)率和比表面積的優(yōu)點(diǎn)，利用AuNCs來(lái)固定適體進(jìn)一步增強(qiáng)電信號(hào)，最終實(shí)現(xiàn)了對(duì)傳感器的信號(hào)放大，該傳感策略可用于檢測(cè)血清中的CEA，具有巨大的臨床診斷潛力。

圖10 基于NCMTs的豆球蛋白A傳感測(cè)定[19]Fig.10 Preparation of NCMTs for sensing determination of legumin A[19]

3 基于Toehold介導(dǎo)的自組裝信號(hào)放大技術(shù)

基于酶和復(fù)合納米材料的信號(hào)放大技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，并有效地提高了傳感器的靈敏度。但是，酶和納米材料涉及嚴(yán)苛的使用條件或復(fù)雜的制備過(guò)程，使得其發(fā)展空間受到限制。為了擴(kuò)展傳感器中信號(hào)放大技術(shù)的方式，Yukre等[20]提出了Toehlod介導(dǎo)的DNA鏈置換概念。其置換的過(guò)程是：一個(gè)發(fā)夾或雙鏈DNA（A/B）暴露出粘性末端，B鏈末端提供一條5-8個(gè)堿基的單鏈片段作為支點(diǎn)即Toehold，單鏈C以該支點(diǎn)為立足點(diǎn)并經(jīng)堿基互補(bǔ)配對(duì)作用與B雜交形成熱力學(xué)上更穩(wěn)定的雙鏈B/C，導(dǎo)致A被替換掉從A/B中釋放出?；诖烁拍?，研究者們將其拓展衍生出眾多有效的信號(hào)放大手段，并成功運(yùn)用于眾多傳感平臺(tái)的構(gòu)建中，其中兩個(gè)經(jīng)典的放大原理分別是催化發(fā)夾自組裝(CHA)和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）。

3.1 催化發(fā)夾自組裝(CHA)的信號(hào)放大

CHA的信號(hào)放大過(guò)程是：由一條入侵的寡聚單鏈經(jīng)Toehold鏈置換后引發(fā)兩個(gè)穩(wěn)定莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA相互雜交，導(dǎo)致入侵的單鏈被置換下來(lái)。通常將入侵鏈設(shè)計(jì)為靶標(biāo)分子，由此，被置換下來(lái)的靶標(biāo)單鏈可再次引發(fā)新的CHA，經(jīng)過(guò)多次循環(huán)后靶標(biāo)分子形成1:n的放大，從而提高傳感器的靈敏度。如Zang等[21]的工作中，利用CHA和FeTMPyP介導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光設(shè)計(jì)了無(wú)需蛋白酶放大的電化學(xué)傳感策略。如圖11，在存在靶標(biāo)DNA（tDNA）的情況下，tDNA引發(fā)CHA形成H1/tDNA中間體，催化H1和H2進(jìn)一步組裝為產(chǎn)物H1/H2雙鏈體并釋放tDNA。同時(shí)，釋放的tDNA可以再一次引發(fā)新的一輪CHA，從而促進(jìn)CHA中H1和H2的循環(huán)組裝。隨后，經(jīng)CHA反應(yīng)后的混合溶液與捕獲DNA（C-DNA）孵育，所得的dsDNA可與FeTMPyP相互作用形成FeTMPyP@H1CdS量子點(diǎn)（QDs）并修飾電極上，在原位催化魯米諾的氧化以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，導(dǎo)致顯著增強(qiáng)的光電流，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)DNA的高靈敏檢測(cè)。該傳感器經(jīng)CHA信號(hào)放大技術(shù)構(gòu)建，具有優(yōu)異的選擇性和濃度低至fmol/L的檢測(cè)限，因此在未來(lái)的生物分析和分子診斷中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖11 基于CHA放大的電化學(xué)傳感器[21]Fig.11 Electrochemical sensor based on CHA amplification[21]

如Yu等[22]的這項(xiàng)工作中，在傳感界面的DNA中嵌入電活性物質(zhì)，將雙鏈特異性核酸酶（DSN）輔助的靶標(biāo)回收與催化發(fā)夾裝配（CHA）反應(yīng)相結(jié)合，構(gòu)建了檢測(cè)microRNA-141（miR-141）的傳感平臺(tái)。其工作原理如圖12，從癌細(xì)胞中提取miR-141與DNA發(fā)夾H1雜交并展開(kāi)，DSN驅(qū)動(dòng)靶miR-141循環(huán)識(shí)別并釋放出能夠打開(kāi)發(fā)夾H2的單鏈DNA片段Connector。Connector啟動(dòng)隨后的CHA反應(yīng)，將經(jīng)H2和H3修飾的金納米粒子（HP-AuNP）在電極上進(jìn)行自組裝形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。最后使大量帶正電荷的RuHex通過(guò)靜電相互作用與H2/H3雙鏈體的帶負(fù)電的磷酸骨架相作用，進(jìn)一步產(chǎn)生顯著增加的電化學(xué)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)miR-141的定量檢測(cè)。該免標(biāo)記的電化學(xué)方法利用DSN輔助靶標(biāo)回收和CHA反應(yīng)的擴(kuò)增效率高，可擴(kuò)展用于臨床應(yīng)用中miRNA的高靈敏度測(cè)定。

圖12 基于DSN輔助靶標(biāo)回收和CHA的級(jí)聯(lián)放大研究示意圖[22]Fig.12 Schematic Illustration of Cascade Amplification of DSN-Assisted Target Recycling and CHA Reaction[22]

3.2 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）的信號(hào)放大

HCR的信號(hào)放大過(guò)程是：由一條入侵的寡聚單鏈經(jīng)Toehold鏈置換后引發(fā)兩個(gè)穩(wěn)定莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA交替雜交，最終雜交延伸形成呈具有開(kāi)口的雙鏈聚合物。由此形成的雙鏈聚合物，由于DNA雙鏈磷酸骨架的延伸，因此可負(fù)載上更多的電活性物質(zhì)產(chǎn)生放大的電信號(hào)，從而提高傳感器的靈敏度。如Guo等[23]基于HCR的信號(hào)放大技術(shù)，構(gòu)建了檢測(cè)外泌體中與癌癥相關(guān)的基因miR-122的超靈敏電化學(xué)傳感平臺(tái)。如圖13，在這項(xiàng)工作中，將發(fā)夾DNA（hpDNA）探針固定在電極表面上，隨后通過(guò)引發(fā)鏈即靶標(biāo)miR-122打開(kāi)hpDNA，并觸發(fā)DNA1（H1）和DNA2（H2）在電極上的HCR反應(yīng)，經(jīng)交替雜交后形成延長(zhǎng)的帶切口的雙鏈DNA。利用電活性物質(zhì)RuHex對(duì)DNA雙鏈體的強(qiáng)結(jié)合力，使得電極表面負(fù)載上眾多的信號(hào)分子，從而達(dá)到信號(hào)放大的效果和檢測(cè)靶標(biāo)miR-122的目的。在最佳條件下，該傳感器成功地在不同癌細(xì)胞衍生的外泌體中檢測(cè)到了miR-122，證明了其在癌癥診斷中的潛在應(yīng)用。

圖13 基于HCR電分析法測(cè)定miRNA[23]Fig.13 Schematic Illustration of the HCR Electroanalytical Assay for miRNA Detection[23]

4 結(jié)論與展望

綜上所述，電化學(xué)生物傳感器是多學(xué)科交叉和發(fā)展的產(chǎn)物，它是分析化學(xué)與生命科學(xué)相融合的結(jié)果，在分析化學(xué)領(lǐng)域檢測(cè)體現(xiàn)出操作簡(jiǎn)易、靈敏度高、響應(yīng)快速、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，尤其在疾病標(biāo)志物的分析檢測(cè)中發(fā)揮著重要作用?？蒲腥藛T探索了多種信號(hào)放大策略與之結(jié)合，增強(qiáng)了電化學(xué)生物傳感器的靈敏度和準(zhǔn)確性，拓展了檢測(cè)策略的可應(yīng)用潛力和范圍，并已在多個(gè)領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用中取得優(yōu)秀的研究成果。隨著時(shí)代飛速發(fā)展，多種生物技術(shù)以及納米材料相繼興起，體外檢測(cè)受到了越來(lái)越多的關(guān)注，而電化學(xué)生物傳感器的探究也面對(duì)著具有很大的挑戰(zhàn)和機(jī)遇。相信在21世紀(jì)的生物經(jīng)濟(jì)時(shí)代，多學(xué)科的交叉融合及齊肩并進(jìn)，會(huì)為電化學(xué)傳感開(kāi)闊新的廣闊空間，在分析、生命科學(xué)、環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域推動(dòng)社會(huì)的進(jìn)步。