去甲基姜黃素對(duì)腦梗死大鼠COX-2和iNOS水平的影響

葛龍敏， 李玥熠， 祝春華

(1.河北省石家莊市第三醫(yī)院保健科，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2016級(jí)臨床醫(yī)學(xué)一大班，河北 石家莊 050017；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

從全世界范圍來看，卒中是目前導(dǎo)致成年人殘疾和死亡的最重要原因，給社會(huì)和家庭都帶來沉重負(fù)擔(dān)。我國(guó)缺血性卒中患者約占3/4以上，并且近年來發(fā)病率和病死率的增長(zhǎng)速度明顯超過了世界平均水平[1]。盡管重組組織纖溶酶原激活劑(recombinant tissue plasminogen activator，rtPA)等靜脈溶栓藥物和血管內(nèi)治療技術(shù)的推廣應(yīng)用，已成為急性缺血性腦卒中重新開通血管的最有效方法，然而由于治療時(shí)間窗較短，僅約2%的患者從中獲益。盡管竭盡全力的挽救缺血腦組織，但仍然有超過50%的患者致殘甚至死亡[1]。近年來在腦梗死后的病理生理機(jī)制方面的研究已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，但目前仍迫切需要探尋更有效的治療藥物，來改善腦梗死的預(yù)后。姜黃素(curcumin)是中藥姜黃的主要活性成分，是來源于姜科植物的一種小分子植物酸性多酚。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有抗炎、抗血栓形成、抗腫瘤、抗凋亡以及神經(jīng)保護(hù)作用等[2]。一般所指的姜黃素是包括姜黃素、去甲基姜黃素(demethoxycurcumin，DMC)和雙去甲基姜黃素(bisdemethoxycurcumin，BDMC)三種化學(xué)成分的混合，其中姜黃素所占比例最大。但是，由于姜黃素在酸性或中性環(huán)境中水溶性差，在堿性溶液中又不穩(wěn)定，使其口服制劑的生物利用度較低；此外，姜黃素具有體內(nèi)清除迅速的特點(diǎn)，也是制約其藥物應(yīng)用的主要原因[3-4]。越來越多的證據(jù)表明，DMC比姜黃素具有更好的抗腫瘤和抗炎效果，并具有更強(qiáng)的療效和更好的生物穩(wěn)定性，成為一種具有吸引力和前景的姜黃素替代品[5]。前期研究結(jié)果顯示[6]，DMC通過降低血管內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)水平，改善自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats,SHR)的內(nèi)皮功能。COX-2不僅介導(dǎo)高血壓導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損害，還是參與組織缺血后炎癥反應(yīng)的重要分子。而DMC是否也通過抑制COX-2對(duì)腦梗死有保護(hù)作用，目前未見詳細(xì)報(bào)道。因此，本研究采用SHR構(gòu)建大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，觀察DMC對(duì)COX-2和iNOS的調(diào)控作用，探討DMC對(duì)腦梗死的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 DMC(購(gòu)于成都曼斯特制藥有限公司)，分子式C20H18O5，純度大于98%；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；兔抗大鼠COX-2多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；兔抗大鼠iNOS多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體(美國(guó)Ambion公司)；PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)；Synergy-HT多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek)；5417R冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；線栓(2432-A，北京沙東生物技術(shù)有限公司)，線體總長(zhǎng)4.0 cm，直徑0.24 mm，末端呈球形直徑為(0.32 ± 0.02) mm。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 雄性30周齡的SHR由東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物服務(wù)中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫22～24 ℃，光照/黑暗周期為12 h，自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飲食和水。將SHR隨機(jī)分為對(duì)照組和DMC組。參照前期觀察DMC改善SHR血管內(nèi)皮功能的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[6]，DMC組大鼠給予腹腔注射DMC(10 mg/kg)+DMSO，1次/d，持續(xù)3周；對(duì)照組給予溶劑對(duì)照，即腹腔注射同等體積的DMSO，1次/d，持續(xù)3周。

1.3構(gòu)建SHR腦梗死模型 參照Longa等[7]的線栓法制作右側(cè)MCAO動(dòng)物模型。水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹部朝上固定大鼠。頸部去毛后消毒，于正中部位切口約3.0 cm，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣逐層鈍性分離肌肉和筋膜至頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)，并沿CCA向上分離血管以及與血管伴行的神經(jīng)，謹(jǐn)慎剝離頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)以及頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)，再沿ECA向顱底方向剝離，結(jié)扎ECA發(fā)出的分支翼腭動(dòng)脈，使用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA和CCA，在ECA上剪一切口，由此口處插入線栓并進(jìn)入ICA的顱內(nèi)段，松開ICA動(dòng)脈夾，線栓進(jìn)入深度為距離CCA分叉處約18 mm，結(jié)扎固定，消毒后縫合皮膚。手術(shù)中及術(shù)畢維持SHR肛溫在37 ℃左右，直至其恢復(fù)自主活動(dòng)。全部SHR完成手術(shù)后，均在20～25 ℃恒溫、潔凈條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。評(píng)價(jià)MCAO模型成功的標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)具備以下體征：①疼痛刺激時(shí)左側(cè)肢體回縮遲鈍或消失；②抓尾懸空時(shí)，SHR左前肢向胸前屈曲；③自主行走時(shí)大鼠身體向右側(cè)傾，或向右轉(zhuǎn)圈不能走直線；④右側(cè)眼部出現(xiàn) Honer's癥。

1.4神經(jīng)功能評(píng)價(jià) 術(shù)后24 h時(shí)，采用單盲法、改良的Longa分級(jí)法[7]，評(píng)價(jià)各組大鼠MCAO術(shù)后肢體神經(jīng)功能缺失情況：無(wú)肢體功能異常為0分；左側(cè)前肢不能伸展為1分；左側(cè)前肢屈曲為2分；身體輕度向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為3分；身體嚴(yán)重向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為4分；整個(gè)身體向左側(cè)傾倒為5分。

1.5測(cè)量腦梗死體積 MCAO術(shù)后24 h時(shí)，將各組大鼠斷頭并剝?nèi)∧X，去除小腦和腦干，在腦切片模具上均勻、冠狀將大腦切成5片，厚度約3 mm，全部浸入2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)溶液中染色，放置37 ℃恒溫環(huán)境30 min后，在4 %多聚甲醛液體中固定24 h。紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織，蒼白色區(qū)域?yàn)槟X梗死病灶。腦片逐個(gè)拍照，利用圖像分析軟件 Image J(ver1.37c,NIH)測(cè)定腦梗死面積，并采用公式=(矯正右側(cè)腦梗死體積/左側(cè)大腦半球體積)×100%計(jì)算腦梗死體積的百分比數(shù)值。

1.6Western blot方法 檢測(cè)COX-2、iNOS蛋白水平 MCAO術(shù)后24 h時(shí)，各組SHR取腦梗死核心周圍的皮層腦組織，采用Lowry法(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)測(cè)定蛋白濃度。等數(shù)量的蛋白質(zhì)樣品在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳約100 min，在4 ℃條件下轉(zhuǎn)移、固定到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫非特異性封閉1 h后，加入兔抗大鼠COX-2(1∶500封閉液稀釋)、兔抗大鼠iNOS多克隆抗體(1∶500封閉液稀釋)，鼠抗GAPDH多克隆抗體(1∶400，封閉液稀釋)，4 ℃孵育過夜。后將膜在PBST中洗滌3次，然后與羊抗兔IgG熒光抗體抗體(1∶3 000，封閉液稀釋)在室溫下孵育1 h。最后一次洗膜后，酶標(biāo)儀上掃描，并測(cè)定目標(biāo)抗體條帶的單位密度。以GAPDH作為內(nèi)參。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1DMC減輕MCAO術(shù)后的神經(jīng)功能損害 在術(shù)后24 h時(shí)，對(duì)照組和DMC組Longa評(píng)分均較高，與對(duì)照組比較，DMC組的Longa評(píng)分顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 DMC減輕MCAO術(shù)后神經(jīng)功能損害 分)

2.2DMC顯著減小MCAO術(shù)后腦梗死體積 對(duì)照組和DMC組均可見不同大小的腦梗死病灶。與對(duì)照組比較，DMC組腦梗死病灶體積明顯減小(P<0.05)。見圖1和表2。

圖1 DMC減小MCAO后腦梗死體積

表2 DMC減小MCAO后腦梗死體積

2.3DMC抑制MCAO術(shù)后COX-2、iNOS的表達(dá)水平 Western blot的結(jié)果顯示,MCAO術(shù)后24 h時(shí)，與對(duì)照組比較，DMC組COX-2、iNOS蛋白表達(dá)水平被顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 DMC抑制MCAO術(shù)后COX-2、iNOS蛋白表達(dá)水平

3 討 論

高血壓是腦卒中最重要的危險(xiǎn)因素，與腦卒中之間存在強(qiáng)烈的、連續(xù)的、一致的、獨(dú)立的相關(guān)性[8]。在我國(guó)，因腦卒中所致的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)中有73%與高血壓有關(guān)[9]。前期研究結(jié)果顯示，DMC抑制COX-2水平，改善了SHR腎動(dòng)脈的血管內(nèi)皮功能，并有直接降低SHR血壓的作用[10]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步觀察了DMC對(duì)SHR腦梗死的作用。選擇SHR構(gòu)建MCAO模型，與普通大鼠比較，能夠更好地模擬腦梗死的發(fā)生、發(fā)展過程，更符合目前腦梗死臨床背景。本研究結(jié)果顯示，DMC預(yù)處理能夠顯著改善SHR腦梗死后肢體的神經(jīng)功能，并減小了腦梗死體積，抑制COX-2和iNOS表達(dá)水平。與Ramkumar等[11]發(fā)現(xiàn)DMC抑制COX-2、iNOS等炎癥因子，對(duì)帕金森病大鼠模型具有抗炎、抗氧化等神經(jīng)保護(hù)作用的結(jié)果類似。有研究發(fā)現(xiàn)，在帕金森治療過程中，DMC是最有效的抑制左旋多巴代謝酶的藥物之一[12]。此外，Hatamipour 等[10]對(duì)于DMC的廣泛作用進(jìn)行的系統(tǒng)綜述中，詳細(xì)總結(jié)了DMC具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)、抗高血壓、抗菌和血管舒張等作用，并且根據(jù)DMC抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制方面的研究顯示，COX-2、iNOS是重要的參與分子。

環(huán)氧合酶(cyclooxygenases,COX)是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶，COX家族包括COX-1和COX-2兩種亞型。COX-2不僅介導(dǎo)血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和血管收縮，而且也是腦梗死后炎癥性腦損傷過程的重要參與者[6]。腦梗死后COX-2的表達(dá)水平于12～24 h時(shí)達(dá)到高峰，主要分布于腦梗死病灶周圍的神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞。而且，在腦梗死模型中選擇性抑制COX-2水平可以減少20%～30%的腦梗死體積，并有效減少神經(jīng)元損傷，且與抑制谷氨酸神經(jīng)毒性以及繼發(fā)的炎癥反應(yīng)有關(guān)[13]。因此認(rèn)為，COX-2參與了腦梗死早期的損傷過程，可能是治療腦梗死的一個(gè)有價(jià)值的治療靶點(diǎn)。DMC是傳統(tǒng)中藥的有效成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗凋亡等多效性。本研究中，DMC抑制COX-2水平，減輕了腦梗死后炎癥反應(yīng)，具有腦保護(hù)作用。

一氧化氮(nitric oxide,NO)是廣泛分布于各種組織，特別是神經(jīng)系統(tǒng)的生物信號(hào)分子。研究表明，腦梗死早期NO即反應(yīng)性顯著升高，NO可以刺激線粒體產(chǎn)生超氧化物和二氧化氫，通過細(xì)胞凋亡機(jī)制以及抑制呼吸和糖酵解過程而加速細(xì)胞死亡。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是催化NO合成的關(guān)鍵酶，包括nNOS、eNOS和iNOS三種亞型。其中，nNOS主要定位于正常神經(jīng)元，eNOS主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞和一些神經(jīng)元中。與前兩者不同，iNOS只是在炎癥狀態(tài)下誘導(dǎo)表達(dá)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要分布于膠質(zhì)細(xì)胞。在腦梗死時(shí)iNOS被迅速誘導(dǎo)并產(chǎn)生大量NO，兩者共同參與炎癥反應(yīng)過程。有大量研究證明，抑制iNOS表達(dá)水平能夠明顯抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，從而減小腦梗死體積、減輕缺血性腦損傷[14]。

COX-2和iNOS不僅僅是兩個(gè)參與炎癥反應(yīng)的重要分子，在炎癥反應(yīng)過程中兩者之間還有緊密關(guān)聯(lián)。在體外研究中發(fā)現(xiàn)，COX-2抑制劑對(duì)心肌細(xì)胞缺氧時(shí)的保護(hù)作用與抑制iNOS表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)[15]。與Romana-Souza等[16]在壓瘡小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的研究結(jié)果相似，COX-2選擇性抑制塞來昔布通過降低iNOS和COX-2的表達(dá)，改善壓瘡創(chuàng)面愈合，減輕創(chuàng)面炎癥，促進(jìn)真皮重建和瘢痕形成。由此可見，在參與不同組織、不同環(huán)境的炎癥反應(yīng)過程中，COX-2對(duì)iNOS可能有一定調(diào)控作用，詳細(xì)機(jī)制仍需深入研究。

在本研究中，DMC抑制了MCAO誘導(dǎo)的COX-2和iNOS表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，減輕缺血性腦損傷。在前期研究證明DMC有效抑制血管內(nèi)皮炎癥、改善SHR腎動(dòng)脈血管功能的研究基礎(chǔ)之上[6]，進(jìn)一步證明了DMC預(yù)處理對(duì)腦梗死具有保護(hù)作用。但對(duì)腦梗死后干預(yù)治療是否具體同等的效果以及詳細(xì)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。