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    快速提取和分析馬齒莧中五個(gè)三萜類(lèi)化合物

    2020-10-27 09:56:10盛同玲李亞楠李建鑫陳立江
    關(guān)鍵詞:三萜類(lèi)馬齒莧果酸

    盛同玲,李亞楠,李建鑫,胡 鈺,陶 霞,陳立江,梁 嘯

    (遼寧大學(xué) 藥學(xué)院,沈陽(yáng) 110036)

    馬齒莧(PortLacaoleraceaL.),又名馬齒菜、五行草、螞蚱菜,是馬齒莧科馬齒莧屬植物全草[1].既可入藥,又可食用,是我國(guó)衛(wèi)生部劃定87種藥食同源的野生植物之一.馬齒莧為一年生草本,全株無(wú)毛.莖平臥或斜倚,伏地鋪散,多分枝,圓柱形,長(zhǎng)10~15 cm淡綠色或帶暗紅色.馬齒莧以其干燥地上部分入藥,性味酸寒,具有清熱解毒,涼血止血之功效.清熱解毒,散血消腫.治熱痢膿血,熱淋,血淋,帶下,癰腫惡瘡,丹毒,痕疬.用于濕熱所致的腹瀉、痢疾,常配黃連、木香.內(nèi)服或搗汁外敷,治癰腫.亦用于便血、子宮出血,有止血作用[2].

    三萜類(lèi)化合物是馬齒莧中的主要活性成分之一[1-3].之前的藥理學(xué)文獻(xiàn)指出馬齒莧中的這些三萜類(lèi)化合物具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗糖尿病、降低血糖、保護(hù)肝臟、抗?jié)僛4].因此,馬齒莧中三萜類(lèi)化合物的提取與檢測(cè)對(duì)于了解馬齒莧藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及質(zhì)量控制是必要的.目前,僅有一篇文獻(xiàn)采用高效液相-質(zhì)譜(UPLC-PDA)測(cè)定馬齒莧中羽扇豆醇的含量[5],然而,上述方法非常的耗時(shí)而且靈敏度和專(zhuān)屬性較差,不適合在中藥這種復(fù)雜系統(tǒng)測(cè)定多個(gè)三萜類(lèi)化合物.超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)作為一種最現(xiàn)代分離和檢測(cè)的方法已經(jīng)越來(lái)越被人們所關(guān)注.它具有較短的分析周期、較好的分離效能、更好的峰型、較低的溶劑消耗、極高的靈敏度及高通量等特點(diǎn).此外,串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)技術(shù)由于其高選擇性,已經(jīng)被證明非常適合對(duì)分析物的檢測(cè).UPLC-MS/MS技術(shù)可以同時(shí)測(cè)定多種含量相對(duì)較低的三萜類(lèi)化合物.

    在傳統(tǒng)的提取方法中,植物中三萜類(lèi)化合物的提取通常采用熱回流提取法(HRE),浸入提取法 (IE)和超聲波提取法 (USE)[6].然而,隨著能源價(jià)格上漲和二氧化碳排放對(duì)環(huán)境的影響,人們擁有極大的興趣開(kāi)發(fā)新技術(shù)(用最小的溶劑量和更少的能量)用于天然產(chǎn)物的提取.最近,微波提取法(MWE)已經(jīng)成為作為一種從植物中提取三萜類(lèi)化合物的趨勢(shì)[7-8].在我們的研究中,使用四種不同的提取方法來(lái)比較黃酮類(lèi)化合物的提取率[9].

    本文中一個(gè)MWE-UPLC-MS/MS方法被用于5個(gè)三萜類(lèi)化合物的提取和定量,包括:熊果酸(1),2α,19α-二羥基熊果酸(2),3α,19α-二羥基熊果酸(3),19α,14-二羥基熊果酸(4),3-乙酰氧基油桐酸(5),化合物1~5的結(jié)構(gòu)如圖1所示.該方法不僅可用于不同產(chǎn)地及不同采摘期的馬齒莧,而且也可以應(yīng)用于提取和測(cè)定其他復(fù)雜系統(tǒng)中的三萜類(lèi)化合物[10].

    圖1 五個(gè)三萜化合物結(jié)構(gòu)

    1 實(shí)驗(yàn)儀器與藥材

    1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

    UPLC-MS系統(tǒng)(Waters公司);UPLC-MS系統(tǒng) (ESI離子源)(AB Sciex公司);Analyst software (versions 1.5.1) (AB Sciex公司);XP-205十萬(wàn)分之一分析天平、XP-204萬(wàn)分之一分析天平(METTLER TOLEDO公司);HH-2 數(shù)字顯示恒溫水浴鍋(常州國(guó)華儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-210(瑞士BUCHI公司);超聲提取器(昆山超聲儀器有限公司);微波提取器(廣州和竺生物科技有限公司);XW-80 型渦旋混合器 (江蘇海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠);Waters ACQUITY UPLC BEH C18 (100×2.1 mm, 1.7 μm)色譜柱、Waters ACQUITY ;UPLC HSS T3 (100×2.1 mm, 1.7 μm) 色譜柱、Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18(100×2.1 mm, 1.7 μm) 色譜柱(Waters公司);微孔濾膜0.22 μm(密理博公司);微孔濾膜0.45μm (Agilent公司);離心管15 mL/50 mL(coning公司);容量瓶5 mL/10 mL/25mL/50mL/100mL(Brand公司);移液器10 μL/20 μL/100 μL/200 μL/1 000 μL/5 000 μL (Eppendorf公司);玻璃儀器(蜀牛).

    1.2 實(shí)驗(yàn)材料

    1.2.1 材料名稱(chēng)

    用于提取的甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷(天津化工公司)為分析級(jí);超純水(密理博公司);用于分析的乙腈和甲酸(Fisher公司)為色譜級(jí);用于分析的50%甲酸水、甲酸銨、乙酸、乙酸銨(Sigma-Aldrich公司)為色譜級(jí).

    1.2.2 對(duì)照品名稱(chēng)

    熊果酸(1) 、2α,19α-二羥基熊果酸(2) 、3α,19α-二羥基熊果酸(3) 、19α,14-二羥基熊果酸(4) 、3-乙酰氧基油桐酸(5) 均為自制(質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%).

    1.3 藥材

    藥材的收集來(lái)自于中國(guó)的不同區(qū)域(遼寧沈陽(yáng)、吉林白城、黑龍江榆樹(shù)、安徽蕪湖、四川樂(lè)山、湖北宜昌、河北滄州)及不同采摘期(河北1-4分別采摘于3、6、8、11月份),經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院生藥教研室路金才教授鑒定為馬齒莧(PortLacaoleraceaL.).

    2 提取工藝及測(cè)定指標(biāo)

    2.1 提取工藝

    取馬齒莧地上部分1 g用于不同提取方法(熱回流提取法、浸入提取法、超聲波提取法和微波提取法)的考察.

    2.1.1 熱回流提取法

    將1 g藥材放于50 mL玻璃燒瓶中,加入10 mL甲醇,放入80 ℃的水浴中,回流提取2次,每次2h.

    2.1.2 浸入提取法

    將1 g藥材放于50 mL錐形瓶中,加入10 mL甲醇,在室溫下浸泡提取2次,每次2 h.

    2.1.3 超聲提取法

    將1 g藥材放于50 mL 錐形瓶中,加入10 mL甲醇,放入在60 ℃水浴中,在40 kHz的頻率下超聲提取2次,每次30 min.

    2.1.4 微波提取法

    將1 g藥材放于50 mL密閉容器中,采用單因素實(shí)驗(yàn)考察優(yōu)化提取條件(提取溶劑、提取溫度、提取時(shí)間、固液比).

    所有的提取物都被濃縮,干燥,之后用50%的乙腈水溶解、稀釋、定容在50 mL的容量瓶中,溶液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾,可用于進(jìn)樣,進(jìn)樣3 μL[11-12].

    2.2 測(cè)定指標(biāo)

    2.2.1 UPLC條件

    色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100×2.1 mm, 1.7 μm)

    流動(dòng)相:乙腈-0.05%甲酸水溶液(V/V)梯度洗脫

    梯度洗脫:采用二元梯度洗脫系統(tǒng),溶劑A(乙腈)-溶劑B(0.05%甲酸水溶液),梯度程序見(jiàn)表1.

    表1 梯度洗脫程序

    柱溫:30 ℃;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:3 μL

    按照實(shí)驗(yàn)的要求收集了12批不同產(chǎn)地批次的藥材.見(jiàn)表2.

    2.2.2 MS條件

    采用電噴霧離子源(ESI)在負(fù)離子模式下檢測(cè).

    離子噴霧電壓:-4.5 kV;渦輪噴射溫度:550 ℃;噴霧器和輔助氣體:氮?dú)?霧化氣體壓力:50 psi;加熱輔助氣壓力:50 psi;氣簾氣壓力:30 psi;掃描方式:MRM;每個(gè)化合物的MRM離子對(duì)、優(yōu)化了的去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)及碰撞單元出口電壓(CXP)詳見(jiàn)表3.

    表2 產(chǎn)地和質(zhì)量

    表3 桔梗中五種三萜的保留時(shí)間,MRM躍遷,去簇電位(DP),碰撞能(CE)和碰撞細(xì)胞出口電位(CXP)

    2.3 結(jié)果和討論

    2.3.1 提取方法的優(yōu)化

    為了獲得滿(mǎn)意的提取率,使用Anhui樣品對(duì)四種不同溶劑提取方法進(jìn)行了評(píng)估.通過(guò)5個(gè)三萜類(lèi)化合物的提取率評(píng)估了熱回流提取法、浸入提取法、超聲提取法和微波提取法.結(jié)果表明采用微波提取法(提?。?0 ℃,固液比:20 mL/g,提取時(shí)間10 min)的提取率顯著高于其他方法,而且微波提取法還擁有更短的提取時(shí)間的優(yōu)勢(shì).結(jié)果見(jiàn)圖2. 因此,微波提取法被選擇成為提取方法[13].

    通過(guò)5個(gè)三萜類(lèi)化合物的提取率評(píng)估了不同的提取溶劑(二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、30%乙醇水(V/V)、70%乙醇水(V/V)和水).結(jié)果表明甲醇是最有效的提取溶劑.結(jié)果見(jiàn)圖3.

    為了進(jìn)一步的優(yōu)化微波提取法,考察了提取溫度(60、70、80 ℃)、固液比(20、30、40 mL/g)、提取時(shí)間(8、10、12 min)等參數(shù)[14].結(jié)果表明,微波提取法的最優(yōu)條件為以甲醇作為提取溶劑,提取溫度為70 ℃,提取時(shí)間為10 min,固液比為30 mL/g時(shí),提取率最高.結(jié)果見(jiàn)圖4.

    圖2 提取程序的評(píng)估:(A)提取方法的評(píng)估(MWE:甲醇,70 ℃,10 min,20 mL /g,其他提取方法參見(jiàn)“實(shí)驗(yàn)”)

    圖3 提取程序的評(píng)估:(B)不同溶劑的評(píng)估

    圖4 MWE程序的優(yōu)化(萃取溫度,溶劑與固體之比和萃取時(shí)間)

    2.3.2 UPLC條件的優(yōu)化

    對(duì)不同種類(lèi)的流動(dòng)相進(jìn)行了測(cè)試.與甲醇相比,乙腈所用分析時(shí)間較短及峰型更好.幾個(gè)流動(dòng)相添加劑,包括甲酸、冰醋酸、氨和醋酸銨,被用來(lái)優(yōu)化分析物的分離度、峰型和質(zhì)譜電離強(qiáng)度.最終,0.05%甲酸被選作為流動(dòng)相添加劑,因?yàn)樗苁狗治鑫锏碾x子強(qiáng)度更高和產(chǎn)生一個(gè)更好的分離效能.

    三種色譜柱被考察,包括Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100×2.1 mm, 1.7 μm);Waters ACQUITY UPLC HSS T3 (100×2.1 mm, 1.7 μm);Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18(100×2.1 mm, 1.7 μm).最終選擇Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100×2.1 mm, 1.7 μm)作為分析色譜柱,因?yàn)槿祁?lèi)化合物的同分異構(gòu)體在該色譜柱上擁有最佳的分離度、更佳對(duì)稱(chēng)峰的形狀,及更短的色譜分離時(shí)間.5個(gè)三萜類(lèi)化合物的的總離子流圖見(jiàn)圖5.

    圖5 五個(gè)三萜的標(biāo)準(zhǔn)混合物的總離子色譜法

    2.4 方法學(xué)考察

    2.4.1 校正曲線

    制備5個(gè)化合物的乙腈儲(chǔ)備溶液,稀釋至適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度用以建立校正曲線,按上述色譜條件測(cè)定,記錄色譜峰面積.以峰面積(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果表明該方法在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.結(jié)果見(jiàn)表4.

    2.4.2檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)

    稀釋5個(gè)三萜類(lèi)化合物的乙腈儲(chǔ)備溶液成一系列適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度,檢測(cè)限和定量限測(cè)量的信噪比(S / N)分別大約為3和10.檢測(cè)限和定量限均分別小于1.211和4.335 ng/mL, 說(shuō)明該方法檢測(cè)這5個(gè)三萜類(lèi)化合物的具有較高的靈敏度[15].結(jié)果見(jiàn)表4.

    2.4.3 精密度

    精密度是通過(guò)日內(nèi)精密度和日間精密度來(lái)評(píng)價(jià)的.采用用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來(lái)作為精密度的衡量指標(biāo).選用樣品Anhui作為提取和分析的對(duì)象,日內(nèi)精密度是一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次,日間精密度是連續(xù)進(jìn)樣3 d.日內(nèi)和日間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均分別低于2.56%和2.73%,說(shuō)明該方法適合于定量測(cè)量這5個(gè)三萜類(lèi)化合物.結(jié)果見(jiàn)表5.

    2.4.4 準(zhǔn)確度

    準(zhǔn)確度測(cè)試是通過(guò)回收率實(shí)驗(yàn)來(lái)實(shí)現(xiàn)的.準(zhǔn)確稱(chēng)取九份0.5 g包含5個(gè)三萜類(lèi)化合物的藥材樣品.9份樣品分別加入三種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)(大約相當(dāng)于0.5、1.0和1.5倍樣品的質(zhì)量濃度),然后進(jìn)行該樣本提取,使用最佳樣品提取過(guò)程如上所述.回收率通過(guò)測(cè)得量與加入量的比計(jì)算得到.所有分析物的整體回收率范圍從95.1%到104.4%,且回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于2.79%,這說(shuō)明該方法可以準(zhǔn)確的測(cè)定這些分析物的含量.結(jié)果見(jiàn)表5.

    2.4.5 重現(xiàn)性

    重現(xiàn)性是由分析Anhui樣品得到的.三份樣本,分別提取每個(gè)0.5 g,每份進(jìn)樣3次.重復(fù)性的結(jié)果顯示相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于2.84%.結(jié)果見(jiàn)表 5.

    綜上所述,該方法的驗(yàn)證結(jié)果顯示良好的線性、靈敏度、精確度、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度.

    表4 五個(gè)馬齒莧三萜的UPLC-ESI-MS / MS分析的校準(zhǔn)參數(shù)

    表5 UPLC-ESI-MS / MS分析馬齒莧的五個(gè)三萜的精密度、準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和回收率

    2.5 定量分析

    在最優(yōu)的條件下,同時(shí)檢測(cè)十個(gè)不同批次馬齒莧中含5個(gè)三萜類(lèi)化合物的量.采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析.不同批次馬齒莧中含5個(gè)三萜類(lèi)化合物的總量見(jiàn)圖6.不同批次馬齒莧中5個(gè)三萜類(lèi)化合物的量見(jiàn)表5.定量結(jié)果表明化合物1和3在所有測(cè)試樣品中含量較高.樣品Anhui中化合物1、3及5的量高于其他樣品,樣品Heibei-4中化合物2在所有測(cè)試樣品中最高.樣品Liaoning中化合物4在所有測(cè)試樣品中最高.我們的研究結(jié)果表明,不同生產(chǎn)區(qū)域的樣品中5個(gè)三萜類(lèi)化合物的差別很大.

    圖6 不同來(lái)源馬齒莧中含五個(gè)三萜的總量(n=3,μg/ g)

    3 結(jié) 語(yǔ)

    本文開(kāi)發(fā)的MWE-UPLC-MS/MS方法只需要10 min就可以提取馬齒莧中的5個(gè)三萜類(lèi)化合物,在11 min內(nèi)就可對(duì)這些三萜類(lèi)化合物進(jìn)行定量分析.此外該方法也可大量減少溶劑消耗.驗(yàn)證數(shù)據(jù)表明,微波提取法結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)是十分可靠和穩(wěn)定的.這些藥物活性成分的測(cè)定為馬齒莧質(zhì)量評(píng)估及臨床應(yīng)用提供了很有價(jià)值的信息.

    表6 來(lái)自不同來(lái)源的西洋參中含五個(gè)三萜的量(n=3,μg/ g)

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