大豆肽對(duì)果蠅睡眠的影響

易國(guó)富， 張 健， 李 赫， 劉新旗,*, 尹利端

(1.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心/北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/食品與健康學(xué)院， 北京 100048; 2.煙臺(tái)新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)有限公司， 山東 煙臺(tái) 264006)

人類三分之一的時(shí)間是在睡眠中度過(guò)的，睡眠是人體的一種主動(dòng)過(guò)程，可以恢復(fù)精神和解除疲勞。充足的睡眠、均衡的飲食和適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)，是國(guó)際社會(huì)公認(rèn)的三項(xiàng)健康標(biāo)準(zhǔn)。目前全球有三分之一的人患有睡眠障礙[1]。據(jù)2019年3月21日“世界睡眠日”的報(bào)道，我國(guó)目前約有38.5%的人患有睡眠障礙，并且睡眠障礙人群中女性是男性的1.5～2.0倍，而40%～70%的老年人患有睡眠障礙[2]。中國(guó)已經(jīng)步入老齡化社會(huì)，研究報(bào)道老年人相較于年輕時(shí)候，其消化和吸收的蛋白酶下降了30%～50%[3-4]，而作為宏觀營(yíng)養(yǎng)素的蛋白質(zhì)在人體承擔(dān)著各種生理活性的調(diào)節(jié)作用，其攝入不足容易引起人體“負(fù)氮平衡”，最終導(dǎo)致各種常見(jiàn)的老年人健康問(wèn)題，如睡眠障礙、記憶力下降、肌肉萎縮、免疫力下降等[5-9]。

大豆蛋白質(zhì)是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，其所含的必需氨基酸種類齊全、比例適當(dāng)，經(jīng)過(guò)蛋白酶水解或微生物發(fā)酵，再經(jīng)過(guò)超濾膜分離和噴霧干燥等工藝處理得到肽的混合物，其平均分子質(zhì)量分布低于1 000 Da[10]。大豆肽(soybean peptides, SBP)相較于大豆蛋白和游離氨基酸，在提供氨基酸方面具有吸收速度快、載體不飽和、易溶于水、無(wú)抗原性、生物活性高等特點(diǎn)[11]。生物活性肽具有抗氧化、降血壓、減脂、免疫調(diào)節(jié)、降糖、抗癌等功能特性，是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)[12-13]。

自Morgan首創(chuàng)性地在遺傳學(xué)上研究果蠅[14]，如今，果蠅已成為遺傳學(xué)研究的新寵。與其他模式生物相比，果蠅易繁殖、操作便捷、生命周期短(25 ℃，40～60 d)，且果蠅的基因與人類的基因同源性高達(dá)80%[15]。果蠅在20 d以后，表現(xiàn)出老年人的睡眠特征[16]，因此，利用果蠅遺傳學(xué)的優(yōu)勢(shì)，在20 d時(shí)研究果蠅的睡眠對(duì)老年人睡眠具有重要的參考意義。果蠅睡眠的調(diào)控是通過(guò)生物鐘系統(tǒng)和神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)協(xié)同作用完成的[17]。目前，研究報(bào)道了果蠅的十多個(gè)生物鐘基因，其中period(per)、timeless(tim)、clock(clk)、cycle(cyc)4個(gè)為核心的鐘基因[18]。調(diào)控睡眠的神經(jīng)遞質(zhì)，主要有促進(jìn)睡眠的γ-氨基丁酸(GABA)、五羥色胺(5-HT)，促進(jìn)覺(jué)醒的谷氨酸(Glu)和組胺(His)[19-21]，以及果蠅腦內(nèi)GABA的限速酶——谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)、5-HT的限速酶——色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase，TPH)、Glu的限速酶——谷氨酸脫氫酶(glutamic dehydrogenase，GDH)、His的限速酶——組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase，HDC)[22]。

本研究以果蠅為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用?dòng)物行為分析系統(tǒng)監(jiān)測(cè)SBP對(duì)20日齡雄性處女果蠅睡眠行為的影響，并檢測(cè)SBP對(duì)生物鐘基因(per、tim、clk、cyc)與參與調(diào)控睡眠神經(jīng)遞質(zhì)合成限速酶的基因(gad、tph、gdh、hdc)的影響，旨在探索SBP對(duì)老年果蠅睡眠營(yíng)養(yǎng)干預(yù)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，山東御馨生物科技有限公司；堿性蛋白酶(200 U/mg)、中性蛋白酶(100 U/mg)，上海源葉生物科技有限公司；野生型Canton S品系黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；TRIzol試劑，美國(guó)Life Technologies公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，美國(guó)Progema公司；5-HT ELISA試劑盒，中國(guó)江萊生物；SYBR Green Mix PCR試劑盒，賽默飛世爾(中國(guó))公司。

1.2 儀器與設(shè)備

人工氣候培養(yǎng)箱，德國(guó)Binder公司；VideoTrack動(dòng)物行為分析系統(tǒng)，法國(guó)Viewpoint公司；Milli- Q Integral 5型純水儀，美國(guó)Millipore公司；Alpha1- 2LD型冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；LightCycler96型RT-qPCR儀，瑞士Roche公司；LC20A液相(色譜柱為TSK-GEL G2000SWXL，(7.8 mm×300 mm×5 μm))，日本Shimadzu公司；0.22 μm陶瓷微濾膜、2 000 Da超濾膜，江蘇久吾高科技股份有限公司；YXQ- LS- 75SⅡ型高壓滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Infinite 200 Pro Nanoquant型酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1SBP的制備

配置w=2%大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)水溶液，按照4 000 U/g的加酶量添加酶，分別添加堿性蛋白酶和中性蛋白酶，反應(yīng)溫度55 ℃、pH值為7、反應(yīng)時(shí)間4 h。然后在溫度85 ℃的條件下滅活15 min，用陶瓷微濾膜和超濾膜過(guò)濾，在40 ℃、60 MPa條件下過(guò)濾，得到的濾液在-40 ℃、壓強(qiáng)12 Pa、時(shí)長(zhǎng)30 h的條件下冷凍干燥，得到SBP。SBP的制備過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1 大豆肽的制備流程Fig.1 Preparation process of soybean peptides

1.3.2SBP分子量分布的測(cè)定

通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜法在LC20A上進(jìn)行測(cè)量。使用的色譜柱為TSK-GEL G2000SWXL(300 mm×7.8 mm×5 μm)。制備的肽質(zhì)量濃度為1 mg/mL，所有用于測(cè)量分子量的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度均為1 mg/mL。進(jìn)樣前，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均通過(guò)0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾。進(jìn)樣量為20 μL，流動(dòng)相V(水)∶V(乙腈)∶V(三氯乙酸)= 80∶20∶0.1，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

1.3.3果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配置

將培養(yǎng)瓶和指管清洗干凈，與橡膠塞一同放入滅菌鍋中滅菌，溫度120 ℃，時(shí)間30 min。冷卻后在紫外燈下照射30 min。在5 L的電飯煲中首先加入蒸餾水1.65 L，加入蔗糖31.62 g、葡萄糖63.24 g、酵母32.19 g、瓊脂10.6 g，并不斷攪拌升溫煮沸，加入玉米粉77.7 g，再煮15～20 min，保溫15 min(保溫13 min時(shí)加入山梨酸鉀2 g，無(wú)水氯化鈣0.726 g)，充分?jǐn)噭?，并將其通過(guò)食物注入槍注入指管中，每個(gè)指管裝6.5 mL，在紫外燈下照射30 min；注入培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶25 mL，在紫外燈下照射30 min。然后蓋上橡膠塞，并放在4 ℃的冰箱中待用[23]。

1.3.4果蠅的睡眠監(jiān)控

取20日齡雄性果蠅在二氧化碳麻醉臺(tái)上麻醉后，分為4組，每組32只，其中一組為空白組，另外3組添加2、4、8 mg/mL的大豆低聚肽。劑量設(shè)定是根據(jù)成年人體重70 kg的每日蛋白質(zhì)需求是60～70 g粗蛋白，作為優(yōu)質(zhì)蛋白源營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充約每日需要10 g/d的量，優(yōu)質(zhì)蛋白補(bǔ)充系數(shù)為1/7[10]。培養(yǎng)基配方中蛋白質(zhì)的含量約為29 mg/mL，故大豆低聚肽作為優(yōu)質(zhì)蛋白源添加到培養(yǎng)基的量為4 mg/mL的劑量，在4 mg/mL的基礎(chǔ)上試驗(yàn)添加了2 mg/mL和8 mg/mL濃度梯度進(jìn)行研究[24-25]，分別為高劑量組(8 mg/mL)、中劑量組(4 mg/mL)、低劑量組(2 mg/mL)。每個(gè)監(jiān)測(cè)管中裝1只果蠅，一端塞上能透氣的海綿，另一端附上0.5 cm的培養(yǎng)基或額外添加SBP的培養(yǎng)基并用蠟封以防止失水風(fēng)干。采用動(dòng)物行為分析系統(tǒng)VideoTrack，在12/12 h明暗的條件下監(jiān)測(cè)果蠅睡眠，20日齡21:00放入檢測(cè)管中，先讓果蠅適應(yīng)12 h，分析數(shù)據(jù)從第21日9:00至第26日9:00的睡眠數(shù)據(jù)，把監(jiān)測(cè)玻璃管固定到檢測(cè)板上，每5 min記錄一次數(shù)據(jù)，如圖2。

圖2 果蠅在動(dòng)物行為分析系統(tǒng)中的睡眠監(jiān)控圖Fig.2 Drosophila sleep monitoring chart in animal behavior analysis system

1.3.5果蠅頭部取樣

選取日齡20日雄性果蠅，在當(dāng)日21:00，在培養(yǎng)基中(共4個(gè)組：空白組和SBP的3個(gè)劑量組，每組50只)培養(yǎng)48 h后，即22日晚上21:00，取待測(cè)果蠅通過(guò)二氧化碳麻醉，并裝在凍存管，迅速放入液氮罐中，5 min后取出迅速用力搖晃，使其充分破碎，倒入40目的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)篩(篩子提前用液氮冷卻)，篩子截留的就是果蠅的軀體，篩子下方放白紙，白紙上面就是果蠅的頭、腿、翅、觸角，再將白紙上的樣品倒入20目的篩子，篩子截留果蠅的頭部。將果蠅頭部置于凍存管中，放入液氮備用。

1.3.6果蠅頭部RNA提取和RT-qPCR測(cè)量

將收集的果蠅頭部樣品每組30只，使用液氮研磨，加入TRIzol試劑裂解樣品并根據(jù)試劑盒說(shuō)明書提取果蠅頭部總RNA。將RNA樣品1 μg用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)一步使用SYBR Green Mix試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，使用RT-qPCR儀檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)水平。RT-qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃下預(yù)變性10 min(1個(gè)循環(huán))，在95 ℃下10 s，60 ℃下1 min條件下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，收集Ct值數(shù)據(jù)后采用2^-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[26]，使用GAPDH基因作為內(nèi)參。表1為檢測(cè)使用的引物信息[27]。

表1 果蠅基因引物序列Tab.1 Drosophila gene primer sequences

1.3.7果蠅頭部5-HT的測(cè)量

從液氮罐中取出裝有果蠅頭的凍存管，每組30只，加入0.5 mL的生理鹽水，勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清，使用5-HT ELISA試劑盒，每組3個(gè)平行，在酶標(biāo)儀450 nm的波長(zhǎng)下測(cè)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用SPSS 16軟件通過(guò)單向方差分析所有數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)，認(rèn)為P<0.05為顯著差異，P<0.01為較顯著差異，P<0.001為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 SBP的分子量分布

與空白組比較，*表示顯著差異P<0.05，**表示較顯著差異P<0.01。圖3 大豆肽對(duì)果蠅睡眠時(shí)長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of soybean peptides on sleep duration of Drosophila

通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定SBP的分子量分布。見(jiàn)表2，觀察到分子量186～1 000 Da的比例為84.58%，平均分子量約為722.37 Da，由約2～5個(gè)氨基酸組成。

表2 大豆肽的分子質(zhì)量分布Tab.2 Molecular weight distribution of soybean peptides

2.2 SBP對(duì)果蠅睡眠時(shí)長(zhǎng)的影響

以沒(méi)有添加SBP的培養(yǎng)基喂養(yǎng)的果蠅為空白組，在空白組中額外加入SBP(2、4、8 mg/mL)，研究對(duì)雄性果蠅睡眠時(shí)長(zhǎng)的影響，見(jiàn)圖3。由圖3a可知，與空白組相比，SBP的3個(gè)劑量組均能延長(zhǎng)果蠅白天的睡眠時(shí)長(zhǎng)且隨劑量的升高而升延長(zhǎng)，呈現(xiàn)濃度依賴性，尤其是高劑量組延長(zhǎng)效果最好，但3個(gè)劑量組相對(duì)于空白組都無(wú)顯著性差異。由圖3b可知，與空白組相比，第2天，SBP的低、中、高三個(gè)劑量組均能顯著(P<0.05)提高睡眠時(shí)長(zhǎng)，中劑量、高劑量能較顯著(P<0.01)提高睡眠時(shí)長(zhǎng)。在第1天、第3天高劑量顯著(P<0.05)提高睡眠時(shí)長(zhǎng)。由圖3c可知，果蠅全天睡眠的分析中，與空白組相比，SBP的低劑量和中劑量組顯著(P<0.05)延長(zhǎng)果蠅的睡眠時(shí)長(zhǎng)，高劑量組較顯著(P<0.01)延長(zhǎng)了果蠅的睡眠時(shí)長(zhǎng)，第3天高劑量組顯著(P<0.05)延長(zhǎng)了果蠅的睡眠時(shí)長(zhǎng)。

在添加SBP之后的前3天中，第2天效果最顯著能延長(zhǎng)睡眠時(shí)長(zhǎng)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，到了第4天、第5天SBP不再延長(zhǎng)果蠅的睡眠時(shí)長(zhǎng)，這可能是由于SBP在潮濕的環(huán)境下已經(jīng)變質(zhì)，有文獻(xiàn)報(bào)道肽類物質(zhì)相較于蛋白質(zhì)和氨基酸更易被微生物利用[28]。因此，在20日額外添加SBP，睡眠時(shí)長(zhǎng)延長(zhǎng)，最佳時(shí)效是48～60 h，最佳劑量為8 mg/mL。

2.3 SBP對(duì)果蠅生物鐘基因的營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)

果蠅的睡眠4個(gè)核心鐘基因(per、tim、clk、cyc)和其他鐘基因及其編碼蛋白組成了互相轉(zhuǎn)錄- 翻譯反饋環(huán)路以驅(qū)動(dòng)其晝夜節(jié)律，并且在果蠅和哺乳動(dòng)物之間保持一致，見(jiàn)圖4[29]。圖4顯示，首先DNA結(jié)合異二聚體CLK/CYC(clk和cyc轉(zhuǎn)錄而來(lái))與靶標(biāo)啟動(dòng)子中的E-box序列(通常為CACGTG)結(jié)合以激活基因per/tim，并轉(zhuǎn)錄表達(dá)形成PER/TIM蛋白二聚體，在傍晚光線消失后開始大量轉(zhuǎn)錄形成，到午夜的時(shí)候，達(dá)到頂峰，隨后，PER/TIM蛋白二聚體，慢慢解離，并進(jìn)入細(xì)胞核中，通過(guò)CK2、SGG、PP2A、PP1，調(diào)節(jié)形成PER和TIM的磷酸化并與DBT結(jié)合抑制DNA結(jié)合CLK/CYC，并與靶標(biāo)啟動(dòng)子中的E-box序列結(jié)合，抑制激活per/tim基因的轉(zhuǎn)錄。抑制CLK/CYC轉(zhuǎn)錄激活(白天)和抑制PER/TIM(夜晚)，完成整個(gè)晝夜的睡眠/覺(jué)醒的調(diào)節(jié)循環(huán)[29]。

圖4 cyc/clk和per/tim的調(diào)節(jié)反饋回路圖Fig.4 Feedback loop of cyc/clk and per/tim

SBP對(duì)果蠅睡眠調(diào)控生物基因的影響見(jiàn)圖5，SBP的3個(gè)劑量組均顯著上調(diào)per、tim、clk、cyc基因的表達(dá)水平。SBP的中劑量組對(duì)果蠅的4個(gè)核心鐘基因均較顯著上調(diào)(P<0.01)，低劑量組只對(duì)tim基因較顯著上調(diào)(P<0.01)，對(duì)per、clk、cyc這3個(gè)基因只是顯著上調(diào)；相較于空白組，果蠅睡眠基因的影響尤其是tim基因上調(diào)效果最好，低劑量和中劑量SBP均較顯著上調(diào)(P< 0.01)，尤其是高劑量SBP極顯著上調(diào)了tim基因(P<0.001)。這說(shuō)明SBP的攝入可能對(duì)果蠅的tim基因影響更敏感，從而促進(jìn)PER/TIM蛋白二聚體的形成，以延長(zhǎng)睡眠時(shí)長(zhǎng)。

與空白組比較，*表示顯著差異P<0.05，**表示較顯著差異P<0.01，***表示極顯著差異P<0.001。圖5 大豆肽對(duì)果蠅睡眠調(diào)控生物基因的影響Fig.5 Effect of soybean peptides on sleep-regulating biological genes of Drosophila

2.4 SBP對(duì)果蠅睡眠調(diào)控相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)合成基因的營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)

SBP對(duì)果蠅睡眠調(diào)控相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)合成基因的影響見(jiàn)圖6，相較于空白組，SBP的高劑量組對(duì)gdh和hdc的基因表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)，對(duì)gad的基因表達(dá)水平較顯著上調(diào)(P<0.01)，對(duì)tph的基因表達(dá)水平極顯著上調(diào)(P<0.001)。

與空白組比較，*表示顯著差異P<0.05，**表示較顯著差異P<0.01，***表示極顯著差異P<0.001。圖6 大豆肽對(duì)果蠅睡眠調(diào)控相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì) 合成基因的影響Fig.6 Effect of soybean peptides on sleep regulation-related neurotransmitter synthesis genes of Drosophila

大豆肽對(duì)果蠅腦部五羥色胺含量的影響見(jiàn)圖7，SBP的中劑量組對(duì)gad和gdh均顯著上調(diào)(P<0.05)，tph較顯著(P<0.01)上調(diào)，而對(duì)hdc的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SBP的低劑量組只對(duì)tph基因上調(diào)較顯著(P<0.01)，其他3個(gè)基因影響無(wú)差異，結(jié)合圖3b，第2天晚上SBP的低劑量組是顯著性促進(jìn)果蠅睡眠延的。因此，SBP對(duì)果蠅睡眠延長(zhǎng)是通過(guò)上調(diào)tph基因的表達(dá)完成的。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證，測(cè)量了tph調(diào)節(jié)相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)五羥色胺的含量。由圖7可知，相較于空白組，SBP高劑量組對(duì)果蠅的5-HT含量顯著性升高(P<0.05)，而低劑量和中劑量組對(duì)五羥色胺含量都有升高。SBP在對(duì)小鼠睡眠延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中，促進(jìn)了五羥色胺的分泌并顯著提高了小鼠的褪黑素含量導(dǎo)致小鼠睡眠延長(zhǎng)[30]，這與SBP對(duì)果蠅睡眠延長(zhǎng)影響一致，又據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，升高果蠅五羥色胺的含量可較大程度促進(jìn)果蠅睡眠[31-32]。故而，SBP是通過(guò)上調(diào)果蠅腦內(nèi)5-HT的限速酶TPH表達(dá)，進(jìn)而提高5-HT含量來(lái)促進(jìn)果蠅睡眠。

3 結(jié) 論

在研究老年果蠅睡眠實(shí)驗(yàn)中，研究發(fā)現(xiàn)SBP的3個(gè)劑量組(2、4、8 mg/mL)對(duì)其睡眠時(shí)長(zhǎng)上調(diào)最佳的時(shí)間為第2日的晚上，即加入SBP后的48～60 h之間，最佳劑量8 mg/mL。通過(guò)核心鐘基因(per、tim、clk、cyc)的測(cè)定，得到響應(yīng)最強(qiáng)的是tim基因，因此，SBP促進(jìn)果蠅睡眠是上調(diào)了tim基因表達(dá)提高PER/TIM蛋白二聚體含量來(lái)促進(jìn)果蠅夜晚睡眠的。SBP對(duì)果蠅腦中γ-氨基丁酸、五羥色胺、組胺和谷氨酸合酶基因gad、tph、gdh、hdc的表達(dá)水平的影響中，只有低劑量組顯著上調(diào)了tph基因表達(dá)，進(jìn)而又測(cè)定了5-HT的含量，研究表明，SBP提高了果蠅腦內(nèi)5-HT的含量。因此SBP是通過(guò)上調(diào)tim基因，提高轉(zhuǎn)錄形成PER/TIM蛋白二聚體，進(jìn)而上調(diào)TPH的酶活，增加5-HT的含量來(lái)延長(zhǎng)果蠅的睡眠。后續(xù)將SBP對(duì)果蠅的睡眠影響機(jī)制進(jìn)行更深入的研究，為SBP對(duì)睡眠的影響提供更多的科學(xué)依據(jù)。