兩種輔料對固態(tài)發(fā)酵紅曲米莫納可林K與紅曲色素產(chǎn)量的影響

史 成， 王 笑， 高嘉欣， 王小璐， 李 鵬， 王昌祿， 陳勉華

(天津科技大學 食品科學與工程學院， 天津 300457)

固態(tài)發(fā)酵(solid-state fermentation, SSF)是一種經(jīng)濟方便的發(fā)酵技術[1]，具有操作簡便、成本低等優(yōu)點[2]。紅曲霉(Monascusspp.)是傳統(tǒng)的食用、藥用真菌，在我國有近2000年的應用歷史[3-4]。紅曲霉以大米為基質，其固態(tài)發(fā)酵過程可產(chǎn)生多種有益的代謝產(chǎn)物，人們較為熟知的有莫納可林K(Monacolin K, MK)和紅曲色素(Monascuspigments, MPs)。

MK以酸型(MKA)和內酯型(MKL)兩種構型存在，MKA能競爭性抑制人體內膽固醇合成途徑中限速酶HMG- CoA活性，從而抑制膽固醇合成[5]。MKL 則需要在人體內轉化為酸型結構后發(fā)揮作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，紅曲產(chǎn)品中的 MK 與片劑藥物中MK相比，前者口服后的溶出度和生物利用度更高[7]。紅曲色素主要包括紅、黃、橙三類色調的色素，其結構屬于聚酮類化合物，具有熱穩(wěn)定性好，安全性高等優(yōu)點。此外，MPs 還具有抗癌、抗菌、減肥及調節(jié)血糖等作用[8-9]。

豆粕和豆渣作為大豆加工后的副產(chǎn)物，富含蛋白質、膳食纖維等成分，具有很高的再利用價值[10-11]。在以往紅曲研究中，代謝產(chǎn)物MK與MPs很難做到二者兼得，且以純大米進行發(fā)酵培養(yǎng)成本較高。本實驗將豆粕與豆渣作為輔料與大米復配，利用紅曲霉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的復雜酶系，作用于蛋白質和纖維含量較高的豆粕和豆渣基質，探討綜合提高紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物中活性物質產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本的可行性，同時研究添加輔料對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK及MPs的影響機制，以期為大豆副產(chǎn)物的高附加值再利用和紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)功能性食品和配料提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

煙灰色紅曲霉MPs- 7 (MonascusfuliginosusMPs- 7)，天津科技大學發(fā)酵食品與新資源開發(fā)實驗室。

大米，市售；豆粕、豆渣，天津山海關食品有限公司；Monacolin K標準品，Sigma公司；乙腈、無水乙醇(色譜級)，天津康科德試劑公司；無水乙醇(分析級)，天津江天化工有限公司；甲酸(色譜級)，天津市光復精細化工研究所；NH4NO3、NaNO3、KH2PO4、MgSO4、葡萄糖、蛋白胨，天津市化學試劑一廠。

1.2 儀器與設備

1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；XL- 3型掃描式電子顯微鏡，日本日立公司；ZWY- 2112D型恒溫搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；TDZ5- WS型離心機，湘儀離心機有限公司；KG- AP32L型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；Kjeltec 8400型福斯全自動凱氏定氮儀，丹麥福斯集團。

1.3 實驗方法

1.3.1培養(yǎng)基的配制

麥芽汁斜面培養(yǎng)基：大麥芽粒輕度粉碎，稱取250.0 g，加入1 L蒸餾水，60 ℃恒溫水浴4 h，過濾后加水稀釋糖度至12°Brix，加入3.0 g瓊脂，于121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基：6.0 g葡萄糖、2.0 g蛋白胨、1.0 g NaNO3、1.0 g KH2PO4、0.5 g MgSO4溶于100 mL蒸餾水并分裝至250 mL錐形瓶中，8層紗布和牛皮紙封口，于 121 ℃、0.1 MPa 條件下滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：25.0 g大米和蒸餾水按質量比1∶1在室溫下浸泡12 h，將水瀝干后裝入組培瓶中，添加12 mL蒸餾水，于121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。

添加輔料的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：在控制總干基質量不變(即輔料與大米共計25.0 g)的條件下，將豆粕、豆渣兩種輔料粉碎添加至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加量梯度分別為質量分數(shù)5%、10%、15%、20%、25%，加入相同質量的蒸餾水，在室溫下浸泡12 h，瀝干后裝入組培瓶中，添加12 mL蒸餾水。于121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。

添加無機氮源的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：25.0 g大米和同質量的蒸餾水在室溫下浸泡12 h，將水瀝干后裝入組培瓶中，添加事先溶解NH4NO3的蒸餾水12 mL，NH4NO3添加量梯度分別為質量分數(shù)0.5%、1.0%、2.0%，于121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。

1.3.2菌種活化

將保存于4 ℃冰箱的菌種在超凈工作臺進行活化轉接，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

1.3.3種子液的制備

將滅菌后的無菌水在超凈工作臺內倒入活化好的菌種斜面中，用無菌接種環(huán)輕輕刮下孢子制成孢子懸浮液，轉接至種子液培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min恒溫搖床培養(yǎng)36 h，用血球計數(shù)板法計算其孢子數(shù)，調整孢子濃度至106個/mL。

1.3.4固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

搖床振蕩培養(yǎng)活化后的種子液用雙層紗布過濾菌絲體后，注入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和添加輔料的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，每瓶注入10 mL種子液，先置于30 ℃下培養(yǎng)7 d后，再于25 ℃培養(yǎng)14 d。每組樣品進行5次平行實驗。

1.3.5固態(tài)發(fā)酵基質原料蛋白質含量的測定

分別稱取1 g(精確到0.01 g)大米、豆粕、豆渣放入消化管中，加入2片消化片、12 mL濃硫酸，420 ℃消化1 h后置入福斯全自動凱氏定氮儀定氮。每組樣品做3次平行實驗。

1.3.6MK及MPs的提取

60 ℃烘干發(fā)酵產(chǎn)物后稱重，記錄數(shù)據(jù)。將發(fā)酵產(chǎn)物磨粉后過200目篩。準確稱取0.50 g加入10 mL離心管中, 料液比(g/mL)為1∶20，按照體積比4∶3∶3分3次加入體積分數(shù)75%乙醇溶液超聲提取30 min，3 500 r/min離心10 min，將3次上清液合并轉移至新的離心管中，得到MK及MPs的提取液。

1.3.7發(fā)酵產(chǎn)物色價測定

用移液槍準確吸取1～2 mL提取液，添加體積分數(shù)75%的乙醇溶液稀釋提取液，采用紫外分光光度計測量吸光度，并使吸光度控制在0.2～0.8，以75%乙醇溶液為參比，選取分別代表黃色(410 nm)、橙色(465 nm)和紅色(505 nm)的檢測波長測定色價。色價計算見式(1)：

S=A×V/m×n。

(1)

式(1)中：S，樣品的色價，U/g；A，稀釋后的吸光度；V，樣品提取液的體積，mL；m，樣品質量，g；n，提取液的稀釋倍數(shù)。

1.3.8MK及MPs定量分析

《上海護理》是上海市衛(wèi)生局主管、上海市護理學會主辦的面向國內外公開發(fā)行的綜合性護理技術類期刊。是中國科技論文統(tǒng)計源期刊(中國科技核心期刊)、中國期刊全文數(shù)據(jù)庫收錄期刊、中國學術期刊綜合評價數(shù)據(jù)庫來源期刊、中國學術期刊(光盤版)全文收錄期刊、萬方數(shù)據(jù)庫全文收錄期刊和中文科技期刊數(shù)據(jù)庫全文收錄期刊;首屆《CAJ-CD規(guī)范》執(zhí)行優(yōu)秀期刊。

用0.22 μm有機相濾膜過濾提取液至液相小瓶中，待HPLC檢測。以峰面積定量分析紅曲紅、紅曲黃色素產(chǎn)量；以MK標準品峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線計算樣品中MK的產(chǎn)量。

HPLC檢測條件：色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈- 體積分數(shù)0.1%甲酸水(體積比60∶40)，等度洗脫；二極管陣列檢測器；檢測波長237、410 nm；柱溫25 ℃；流速1 mL/min；進樣體積20 μL。

1.3.9兩種構型MK標準曲線的繪制

MKL標準曲線：準確稱量5 mg MKL標準品(精確至0.000 1 g)，用色譜級乙腈定容至10 mL，制作得到500 μg/mL的母液，吸取母液稀釋得到100、80、40、20、10、5 μg/mL的系列標準品溶液，用0.22 μm有機相濾器過濾至液相樣品瓶中。以HPLC峰面積Y對質量濃度X進行線性回歸，得到MKL回歸方程為y=63.349x-26.801，R2=0.999，MKL在5～100 μg/mL線性關系良好。

MKA標準曲線：準確稱量5 mg MKL標準品(精確至0.000 1 g)，用0.1 mol/L的NaOH(體積分數(shù)50%乙腈配制)定容至50 mL，50 ℃水浴1 h，超聲1 h，用1 mol/L的HCL調節(jié)pH值至中性，得到100 μg/mL的MKA母液。吸取母液稀釋得到80、40、20、10、5 μg/mL的系列標準品溶液，用 0.22 μm有機相濾器過濾至液相樣品瓶中。以HPLC峰面積Y對質量濃度X進行線性回歸，得到MKA回歸方程為y=65.641x-25.46，R2=0.998，MKA在5～100 μg/mL線性關系良好。

1.3.10掃描電鏡觀察

截取紅曲米橫截面，冷凍干燥24 h。用Eiko IB- 3型離子濺射儀噴金，XL- 3型掃描式電子顯微鏡(20 kV)掃描，觀察形態(tài)[12-13]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵基質原料含氮量分析

微生物培養(yǎng)過程中氮源對次級代謝產(chǎn)物會有顯著影響，過高或過低的C/N值都會對菌體的生長和代謝產(chǎn)生影響[14]。豆粕和豆渣作為大豆加工副產(chǎn)品，均含有豐富的氮元素，因此本實驗從固態(tài)發(fā)酵基質含氮量的角度出發(fā)，對基質各原料的含氮量進行測定，結果如表1。

表1 固態(tài)發(fā)酵基質原料含氮量Tab.1 Determination of nitrogen content in SSF substrate

3種發(fā)酵基質中，豆粕含氮量最高，達到(77.71±1.86) mg/g；豆粕是大豆除去油脂及脂溶性成分后的殘渣，富含蛋白質[10]，是優(yōu)質的植物蛋白源。豆渣干基含氮量為(43.02±0.85) mg/g；大米含氮量是3種原料中最低的，為(10.93±0.16) mg/g，因為大米中的主要營養(yǎng)成分為碳水化合物，含氮量相對較低。

2.2 添加輔料對發(fā)酵產(chǎn)物色價的影響

按照1.3.7方法對不同發(fā)酵基質的發(fā)酵產(chǎn)物色價進行測定，結果如圖1。

紅曲霉MPs- 7以大米為固態(tài)發(fā)酵基質時發(fā)酵產(chǎn)物的色價最高，410 nm測定色價達到638 U/g。隨著豆粕與豆渣添加量的增加，不同檢測波長下發(fā)酵產(chǎn)物色價與對照組相比均呈顯著下降趨勢(P<0.05)。Nimnoi等[15]、Srianta等[16]研究發(fā)現(xiàn)相同的趨勢。前者以豆粕為唯一底物進行紅曲霉固態(tài)發(fā)酵，其色價較低，僅為22 U/g ；后者以大米、玉米、高粱等不同谷物為唯一發(fā)酵基質進行紅曲霉固態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)大米比其他發(fā)酵基質色素產(chǎn)量更高。推測色價高低與發(fā)酵基質含氮量的多少有關。有研究指出，紅曲霉發(fā)酵前期會有大量己酸和辛酸合成，在發(fā)酵后期利用這兩種脂肪酸進一步合成色素，豆粕與豆渣含氮量較高，而氮源過高會限制脂肪酸的生成，無法合成色素，導致色素產(chǎn)量降低[17]。色價僅能初步評價發(fā)酵產(chǎn)物中色素混合物的總量，因此采用HPLC進一步對紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物中的單一色素進行定性和定量分析。

A.大米基質(對照組)，B1.添加5%豆粕，B2.添加10%豆粕，B3.添加15%豆粕，B4.添加20%豆粕，B5.添加25%豆粕，C1.添加5%豆渣，C2.添加10%豆渣，C3.添加15%豆渣，C4.添加20%豆渣，C5.添加25%豆渣。不同字母表示相同檢測波長下各組間色價差異顯著(P<0.05)。圖1 添加不同含量輔料對MPs- 7固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物色價的影響Fig.1 Effect of adding different contents of auxiliary substrate on color value of SSF products by MPs- 7

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析

圖2 發(fā)酵樣品高效液相色譜Fig.2 HPLC of fermented sample

由于紅曲色素在紫外和可見波長范圍均有光譜吸收，而MK在237 nm處具有最大光譜吸收，為兼顧色素和MK的檢測，采用237 nm檢測波長同時對紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物MK和MPs進行定性分析。圖2為添加15%豆粕時發(fā)酵產(chǎn)物的高效液相色譜，結合MKA、MKL標準品HPLC洗脫時間以及各洗脫峰相應光譜分析，MPs- 7固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中共檢測出5種次級代謝產(chǎn)物，按洗脫時間先后順序，依次為紅曲紅色素1(R1)、MKA、紅曲黃色素1(Y1)、MKL和紅曲黃色素2(Y2)。雖然在色價測定時，465 nm處檢測色價略低于505 nm處，但HPLC未檢測到紅曲橙色素成分(依據(jù)紅曲橙色素的特征吸收光譜判定)。由于紅色素在465 nm也存在較大的光譜吸收，黃色素在相應檢測波長下無光譜吸收，因此，圖1在465 nm的檢測結果代表了紅色素相對含量，而非橙色素含量，410 nm檢測波長則綜合反映了紅色素和黃色素的相對含量。

2.4 添加輔料對發(fā)酵產(chǎn)物MK及MPs產(chǎn)量的影響

紅曲霉MPs- 7在以大米為基質進行固態(tài)發(fā)酵時，未檢測出MK；而添加輔料的發(fā)酵基質均有MK產(chǎn)出，見圖3。MK總產(chǎn)量隨豆粕添加量的增加呈先上升后下降的趨勢，在添加量為15%時產(chǎn)量達到最大值，為3 177 μg/g；又隨豆渣添加量的增加而增加，在添加量25%時產(chǎn)量達到1 908 μg/g。當兩種輔料添加量達到15%及以上后，MK主成分由豆粕或豆渣添加量為5%、10%時的內酯型轉變?yōu)樗嵝汀Ｅc大米基質對照組相比，在添加豆粕或豆渣后，3種色素(R1、Y1、Y2)的產(chǎn)量均受到抑制。且在5%～15%添加范圍內，相同的添加比例，豆粕比豆渣抑制色素產(chǎn)量更顯著(P<0.05)。當豆粕或豆渣添加量超過15%后，色素產(chǎn)量極低。以上實驗數(shù)據(jù)表明：大米基質中適量添加豆粕或豆渣，非常有利于紅曲發(fā)酵中次級代謝向MK的分流積累，同時降低了色素類次級代謝產(chǎn)物的合成。綜合分析MK與MPs兩類次級代謝產(chǎn)物，添加15%豆粕輔料最利于紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK的積累，但與此同時MPs產(chǎn)量受到顯著抑制；添加15%豆渣，提高MK產(chǎn)量的同時也能產(chǎn)生一定量的色素。由于豆渣本身含水量高，作為大米發(fā)酵輔料基質使用時可減少用水量，成本優(yōu)勢突出，在開發(fā)含有MK和紅曲色素的功能性食品配料時，較添加豆粕綜合優(yōu)勢更強。為探索添加豆粕或豆渣輔料對紅曲次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的影響是否與降低發(fā)酵基質中C/N值相關，在MPs- 7固態(tài)發(fā)酵基質中加入無機氮源NH4NO3，分析其對紅曲次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的影響是否與添加豆粕或豆渣輔料一致，結果見表2。

A.大米基質(對照組)，B1.添加5%豆粕，B2.添加10%豆粕，B3.添加15%豆粕，B4.添加20%豆粕，B5.添加25%豆粕，C1.添加5%豆渣，C2.添加10%豆渣，C3.添加15%豆渣，C4.添加20%豆渣，C5.添加25%豆渣。圖3 添加輔料對MK及MPs產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of adding auxiliary material on yield of MK and MPs

表2 添加無機氮與有機氮對MK及MPs產(chǎn)量的影響

A.大米基質(對照組)，B1.添加5%豆粕， B3.添加15%豆粕，B5.添加25%豆粕，C1.添加5%豆渣，C3.添加15%豆渣，C5.添加25%豆渣。圖4 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron micrograph of SSF products

綜合分析圖3、表2發(fā)現(xiàn)：無機氮源NH4NO3添加量的增加，顯著增加了MK的產(chǎn)量(P<0.05)，當添加2.0% NH4NO3時，MK總產(chǎn)量達到1 047 μg/g，而色素產(chǎn)量大幅度下降，與大米基質對照組相比，R1、Y1、Y2峰面積分別下降了93%、82%、94%。該結果與大米基質中添加豆渣或豆粕后對MK和色素的影響效果完全一致，說明大米基質中添加豆渣或豆粕，利于MK積累的同時，抑制色素合成的現(xiàn)象，與其適當降低了發(fā)酵基質中的C/N值直接相關。MK與MPs的生物合成都是利用丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A進行縮合得到二酮化合物，之后二者的合成途徑開始分支[17]，適當降低發(fā)酵基質中的C/N值，促進MK合成并抑制色素積累，因此推測其調控靶點位于二者共同合成途徑分支的下游。眾所周知，適當?shù)腃/N值有益于微生物生長，但發(fā)酵基質中的C/N值截然相反地影響紅曲中MK和色素兩類次級代謝產(chǎn)物的現(xiàn)象和相關機制研究未見報道。有關糖多孢紅霉菌等放線菌氮源代謝中心調控因子(GlnR)在分子水平交叉影響碳源和氮源的代謝走向和次級代謝產(chǎn)物生成的研究成果，可能為揭示紅曲發(fā)酵基質C/N值影響次級代謝產(chǎn)物合成的分子機制提供參考[18]。

雖然添加無機氮源對代謝產(chǎn)物的影響與添加輔料基質有相同的趨勢，但添加15%以上的有機氮源豆渣或豆粕，更利于MKA的積累，提示豆渣或豆粕輔料的添加除了提供豐富的氮源營養(yǎng)因素外，可能其持水能力較強的纖維素成分也為紅曲霉的生長創(chuàng)造了有益于MKA合成的微生態(tài)環(huán)境。

2.5 掃描電鏡觀察紅曲米微觀結構

在紅曲霉發(fā)酵初期，菌絲體主要集中在大米表面，隨著發(fā)酵時間的推移，菌絲體深入大米基質內部。MK大部分是在菌體內積累，只有少量被分泌到胞外。通過觀察發(fā)酵產(chǎn)物紅曲米橫截面菌絲體的生長情況，可以幫助分析發(fā)酵基質影響MK產(chǎn)量的原因。

固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物掃描電鏡圖如圖4。圖4(a)為大米基質發(fā)酵樣品，紅曲米內部菌絲體分布稀疏，且量少。有研究指出，基質黏度是影響MK產(chǎn)量的一個很重要的因素，對照組為純大米基質，淀粉含量高，在發(fā)酵過程中更黏稠，容易形成大塊，不適合菌絲體生長[19]。圖4(b)為添加輔料基質樣品。與空白對照相比菌絲體量明顯增多。其中豆粕添加量為5%時能夠觀察到很多分生孢子，菌絲體量并不是很多；當添加量為15%時能觀察到大量菌絲體在紅曲米內部空間延伸，基質被分割成更小的團塊；隨著添加量的繼續(xù)增加，菌絲體密度略有下降。豆渣組樣品則隨著添加量的增加，菌絲體量也隨之增多，當添加量達到15%之后，菌絲體緊密地交織成網(wǎng)狀。由此可見，豆粕和豆渣作為輔料添加至培養(yǎng)基中，有利于紅曲霉菌絲體生長，且與MK的產(chǎn)量增加呈正相關的關系。

3 結 論

在大米基質基礎上，添加不同比例的豆粕、豆渣作為輔料進行復配，均提高了紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物MK的產(chǎn)量，顯著抑制了MPs的產(chǎn)生。在相同添加量的條件下，添加豆粕比豆渣更有利于MK的積累，對MPs的抑制更顯著。添加無機氮源同樣顯著提高MK產(chǎn)量，降低色素產(chǎn)量。說明豆粕或豆渣兩種輔料的添加，降低了發(fā)酵基質中C/N值是有效提高MK產(chǎn)量的重要原因之一，其更深層面的分子調控機制有待進一步深入研究。本實驗探討了大豆加工副產(chǎn)物用于紅曲霉發(fā)酵同時生產(chǎn)MK及MPs的可行性，大米基質中添加15%豆渣，提高了MK產(chǎn)量的同時也保證了一定的MPs產(chǎn)量，且成本比豆粕低，更適合開發(fā)同時富含MK和MPs的功能性食品配料。

篩選相對高色價并具有生產(chǎn)MK能力的紅曲菌株，掌握C/N值截然相反地影響紅曲中 MK和色素兩類次級代謝產(chǎn)物合成的規(guī)律和解析相關調控機制，將為充分利用富含氮源的農(nóng)副產(chǎn)品，開發(fā)兼具MK和高色價的功能紅曲色素新產(chǎn)品提供理論支撐。