桃杏果實(shí)內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析及軟腐病原菌的分離與驗(yàn)證

劉曉靜， 林 楊， 呂 卓， 李亞玲， 何 歡，李 玲， 朱 璇，*， 張志東，*

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

新疆日照充足、晝夜溫差大，利于瓜果糖分累積，是久負(fù)盛名的“瓜果之鄉(xiāng)”。桃和杏作為新疆的特色水果，果肉鮮美，富含多種維生素和礦物質(zhì)，深受廣大群眾的喜愛(ài)。然而，由于桃和杏的鮮果成熟期較為集中，采后易腐敗變質(zhì)，嚴(yán)重制約了其生產(chǎn)、銷售和新疆特色林果業(yè)的發(fā)展[1-3]。

細(xì)菌在瓜果腐爛中發(fā)揮了不能忽視的作用，多種瓜果腐爛與致病細(xì)菌有關(guān)[4]。周勝虎等[5]發(fā)現(xiàn),腐爛的水果中存在產(chǎn)纖維素的細(xì)菌；張大為等[6]證明了軟腐柑橘中的主要細(xì)菌為葡糖桿菌屬；戴寶玲等[7]利用高通量測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)草莓表面存在大量與植物軟腐病有關(guān)的細(xì)菌。此前，桃杏的軟腐多認(rèn)為是外部菌株侵染果實(shí)導(dǎo)致[8-10]，而對(duì)其內(nèi)生菌在采后軟腐中潛在作用了解較少。植物內(nèi)生菌廣泛存在于各種植物體內(nèi)，并在植物不同生長(zhǎng)時(shí)期發(fā)揮著重要的功能和作用，且其組成存在一定差異[11]。

高通量測(cè)序技術(shù)可更為準(zhǔn)確地反映出微生物的真實(shí)組成和分布[12]，彌補(bǔ)傳統(tǒng)可培養(yǎng)法的不足，已成為微生物研究的熱門(mén)工具。桃和杏是典型的核果類水果，均存在采后極易軟腐變質(zhì)的問(wèn)題。本研究擬通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，分析新疆油桃、庫(kù)車(chē)小白杏采后的主要內(nèi)生細(xì)菌群落組成與多樣性；利用傳統(tǒng)可培養(yǎng)法對(duì)其中的潛在病原細(xì)菌進(jìn)行分離、篩選，并對(duì)其致病能力進(jìn)行驗(yàn)證與分析。希望為進(jìn)一步從微生物角度闡明桃和杏的貯藏保鮮、軟腐病害的防治等相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2019年6月于新疆阿克蘇市庫(kù)車(chē)縣烏恰鎮(zhèn)(E82.8188°，N41.6781°)果園中采集樣品。根據(jù)轉(zhuǎn)黃率將果實(shí)分為青熟期(著色面積小于20%)、轉(zhuǎn)色期(著色面積 40%～60%)和完熟期(著色面積大于80%)三種不同成熟度[1]。選擇果實(shí)自然成熟，無(wú)明顯機(jī)械傷痕，無(wú)病變，且表皮有光澤，顏色、大小、硬度等表觀一致的樣品，發(fā)泡網(wǎng)包裹，裝筐、運(yùn)輸。實(shí)驗(yàn)組于室溫下貯藏(模擬庫(kù)車(chē)小白杏采后售賣(mài)時(shí)的溫度條件)，用于軟腐病原細(xì)菌的分離。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、38號(hào)培養(yǎng)基(葡萄糖4 g，麥芽浸粉3 g，酵母粉4 g，氯化鈉5 g，瓊脂18 g，pH值7.2左右)，由北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品的表面消毒

將樣品用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇、3.3%的H2O2分別處理5 min和3 min，無(wú)菌水沖洗干凈[13]。

1.2.2樣品的高通量測(cè)序

利用十六烷基三甲基溴化銨法[14]提取油桃、庫(kù)車(chē)小白杏果的DNA，檢驗(yàn)其濃度，達(dá)標(biāo)后利用515F和806R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15-16]?；厥债a(chǎn)物，送往北京諾禾致源生物信息科技有限公司，對(duì)樣品16S rDNA V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3潛在病原細(xì)菌的篩選

樣品表面消毒后去皮，利用平板劃線法、稀釋涂布法(切取病健交界處組織1.0 g加入至9.0 mL體積分?jǐn)?shù)0.85%的無(wú)菌生理鹽水中，搖勻，稀釋梯度為10-3，取100 μL于待測(cè)培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布)，對(duì)發(fā)生自然軟腐的桃、杏樣品中的病原細(xì)菌進(jìn)行分離、篩選。模擬采后條件，于室溫下進(jìn)行培養(yǎng)[17]。觀察并記錄各細(xì)菌的形態(tài)特點(diǎn)和數(shù)量，對(duì)單一菌落進(jìn)行純化[18]。

1.2.4潛在病原細(xì)菌的分子鑒定

利用細(xì)菌菌落克隆法，對(duì)桃、杏潛在病原細(xì)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[9]。回收產(chǎn)物，送往北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用EzTaxon 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，下載相似性較高的模式菌株序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[19-20]。

1.2.5潛在病原細(xì)菌致腐能力的驗(yàn)證

于無(wú)菌條件下，采用離體接種法對(duì)菌株的致病能力進(jìn)行測(cè)定。使用酒精棉對(duì)其表面進(jìn)行消毒，無(wú)菌水沖洗，晾干，用0.1 mL無(wú)菌針頭挑取小量菌體，將其接種于果肉中(接種深度距表皮2 mm)，采用保鮮膜包裹傷口處，于室溫下進(jìn)行貯藏。以接種無(wú)菌水的鮮果作為實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照組(以上每組樣品均設(shè)置3組重復(fù)實(shí)驗(yàn))，觀察并記錄鮮果的發(fā)病情況[21]。

1.2.6潛在病原細(xì)菌的再分離與比較

利用酒精棉對(duì)接種組已發(fā)生軟腐的鮮果進(jìn)行表皮擦拭消毒，無(wú)菌條件下去皮，并采用劃線培養(yǎng)法、稀釋涂布法對(duì)病灶組織中的微生物進(jìn)行分離、純化，經(jīng)16S rRNA基因序列擴(kuò)增、測(cè)序和序列分析，并與接種菌株進(jìn)行比較[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌群落組成分析

利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)新疆地產(chǎn)油桃、庫(kù)車(chē)小白杏內(nèi)生細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析，結(jié)果如表1。共獲得原始序列412 105條，過(guò)濾掉低質(zhì)量序列，總數(shù)為156 466條。所得序列經(jīng)聚類比對(duì)，以相似度低于97%聚類為1個(gè)操作分類單元(operational taxonomic units，OUT)，并去除植物體內(nèi)的線粒體、葉綠體相關(guān)序列后，以及序列reads低于200的低頻序列， 共獲得128個(gè)OTU，涉及9個(gè)門(mén)的117個(gè)屬。油桃中共包含102個(gè)OTUs，庫(kù)車(chē)小白杏共包含47個(gè)OTUs。在所有的128個(gè)OTUs中，21個(gè)OTUs均出現(xiàn)在油桃和庫(kù)車(chē)小白杏果實(shí)中。

表1 油桃、庫(kù)車(chē)小白杏微生物菌株測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.1 Statistical data of microbial strains in nectarine and Kuqa apricot after sequencing

圖2 屬水平上主要的內(nèi)生細(xì)菌群落組成Fig.2 Main composition of endophytic bacteria communities on genera level

對(duì)門(mén)水平上油桃、庫(kù)車(chē)小白杏主要內(nèi)生細(xì)菌的種群多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1。由圖1可見(jiàn)，油桃和庫(kù)車(chē)小白杏內(nèi)生細(xì)菌以變形桿菌門(mén)為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其次為厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)。在屬分類單元中，油桃與庫(kù)車(chē)小白杏主要內(nèi)生細(xì)菌群落組成如圖2。圖2(a)中，油桃內(nèi)生細(xì)菌以泛菌屬(Pantoea)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、擬桿菌屬(Bacteroides)、溶桿菌屬(Lysobacter)、棲糞桿菌屬(Faecalibacterium)和布勞特氏菌屬(Blautia)種群最為多樣；其中，芽孢桿菌屬和泛菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群，分別約占總菌群的26.20%、23.96%；其次為擬桿菌屬、假單胞菌屬，分別約占總菌群的14.50%、12.90%，其余菌群所占比例均低于5.00%。圖2(b)中，庫(kù)車(chē)小白杏內(nèi)生細(xì)菌以葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、泛菌屬(Pantoea)、瘤胃球菌(Ruminobacter)、蟑螂桿狀體科未分類屬(unidentifiedBlattabacteriaceae)、克里斯滕森菌(Christensenella)、普氏菌屬(Prevotella)種群最為多樣；其中，葡糖桿菌屬為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，約占總菌群的74.09%；其次為泛菌屬、克里斯滕森屬、普氏菌屬、瘤胃桿菌屬，分別約占總菌群的4.17%、3.83%、3.65%、3.31%，其余菌群所占比例均不足2.00%。

圖1 門(mén)水平上主要的內(nèi)生細(xì)菌群落組成Fig.1 Main composition of endophytic bacteria communities on phyla level

2.2 潛在病原菌的篩選與鑒定結(jié)果

通過(guò)對(duì)軟腐桃和庫(kù)車(chē)小白杏中潛在致病菌的反復(fù)分離、純化、去重，獲得了2株油桃潛在病原細(xì)菌，分子鑒定結(jié)果表明為泛菌屬(Pantoea)和芽孢桿菌屬(Bacillus)；獲得了3株庫(kù)車(chē)小白杏潛在病原細(xì)菌，分子鑒定結(jié)果表明為葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、泛菌屬(Pantoea)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。獲得的病原菌中，1株為油桃和庫(kù)車(chē)小白杏共同的潛在病原細(xì)菌，結(jié)果如圖3。圖3中的菌落較小(直徑約為1.0～1.5 mm)、圓形、略隆起、邊緣整齊、黏稠、呈淡黃色，將其命名為XAAS-P1。經(jīng)PCR擴(kuò)增和16S rRNA 基因序列測(cè)序及比對(duì)，構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖4。確定菌株XAAS-P1歸屬于泛菌屬(Pantoea)，其與已知模式菌株P(guān)antoeabrenneriLMG 5343T序列相似性為99.49%，與PantoeavagansLMG 24199T序列相似性為99.13%，暫不能確定其具體分類，有待進(jìn)一步鑒定。

圖3 菌株XAAS-P1的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of strain XAAS-P1

圖4 菌株XAAS-P1 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain XAAS-P1

2.3 潛在病原菌致病能力分析

進(jìn)一步利用離體接種法對(duì)油桃和庫(kù)車(chē)小白杏共同的潛在病原細(xì)菌XAAS-P1的致腐能力進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖5。圖5顯示，菌株XAAS-P1對(duì)采后油桃表現(xiàn)出了較強(qiáng)的致腐能力。由圖5(a)可知，接種72 h時(shí)，油桃出現(xiàn)明顯的褐色病斑，并出現(xiàn)失水現(xiàn)象，致腐率為60%；由圖5(b)可知，接種96 h時(shí)，病斑顏色進(jìn)一步加深，失水現(xiàn)象明顯加重，致腐率達(dá)100%。在陰性對(duì)照組中，放置96 h時(shí)，油桃未觀察到明顯的病斑和失水現(xiàn)象；且與陰性對(duì)照組相比，接種菌株XAAS-P1的油桃提前出現(xiàn)了明顯的軟腐現(xiàn)象。

研究發(fā)現(xiàn)，菌株XAAS-P1對(duì)采后不同成熟度的庫(kù)車(chē)小白杏也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的致腐能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6。接種72 h時(shí)，不同成熟度的庫(kù)車(chē)小白杏均出現(xiàn)了淺棕色病斑，轉(zhuǎn)色期和完熟期出現(xiàn)輕微的失水現(xiàn)象，致腐率為50%；接種96 h時(shí)，青熟期、轉(zhuǎn)色期、完熟期的庫(kù)車(chē)小白杏由淺棕色病斑轉(zhuǎn)為深褐色病斑，致腐率達(dá)100%。在陰性對(duì)照組中，放置96 h時(shí)，庫(kù)車(chē)小白杏僅個(gè)別果實(shí)出現(xiàn)了輕微的軟腐現(xiàn)象，但未觀察到明顯的失水現(xiàn)象；且與陰性對(duì)照組相比，接種菌株XAAS-P1的庫(kù)車(chē)小白杏提前出現(xiàn)了明顯的軟腐現(xiàn)象，致腐率高達(dá)100%。

2.4 潛在病原菌的再分離驗(yàn)證結(jié)果

為進(jìn)一步證實(shí)菌株XAAS-P1是否是引發(fā)油桃和庫(kù)車(chē)小白杏軟腐變質(zhì)的病原細(xì)菌之一，分別對(duì)接種組中出現(xiàn)軟腐部分的果肉、另一側(cè)未接種但出現(xiàn)軟腐的果肉、自然軟腐果肉中的微生物進(jìn)行了分離、純化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7。對(duì)所獲菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析，結(jié)果如表2。由圖7和表2可知，菌株XAAS-P1大量分布于3組樣品中，且均為3組樣品中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群；因此，實(shí)驗(yàn)證明了菌株XAAS-P1是導(dǎo)致采后油桃和庫(kù)車(chē)小白杏軟腐病的主要病原細(xì)菌。

CK：自然對(duì)照組。圖5 油桃接種菌株XAAS-P1的致病力分析Fig.5 Pathogenicity analysis of nectarine inoculated strain XAAS-P1

圖6 不同成熟期庫(kù)車(chē)小白杏接種XAAS-P1菌后的變化情況Fig.6 Decay incidence of Kuqa apricot inoculated with strain XAAS-P1 in different maturation stages

圖7 接種組病灶組織劃線菌落形態(tài)Fig.7 Colony morphology of bacteria from lesion by streaking on PDA

表2 菌株XAAS-P1分子鑒定結(jié)果

3 結(jié) 論

高通量測(cè)序技術(shù)目前已成為研究微生物群落組成與分布的重要手段，被廣泛用于腸道[22]、植物[23]、土壤[24]等的微生物研究中，也成為內(nèi)生菌研究的重要方法[25]。近年來(lái)，相關(guān)研究已從食用玫瑰花瓣[26]、諾尼果[27]、柑橘、番茄[28]、哈密瓜[29]等瓜果的果實(shí)和種子中發(fā)現(xiàn)存在大量?jī)?nèi)生細(xì)菌，其中，假單胞屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬、歐文氏菌屬、乳酸桿菌屬等為主要組成菌群。研究表明，泛菌如成團(tuán)泛菌、菠蘿泛菌、分散泛菌等易引起黃桃罐頭[30]、臺(tái)灣青棗等植物或瓜果的腐爛、變質(zhì)[31]，但有關(guān)桃、杏果實(shí)中腐敗病原細(xì)菌的研究較為有限。李昱佳等[32]從桃樹(shù)枝條中分離得到了泛菌10DM4-1；馮曉師[33]從采后桃果中分離到了菠蘿泛菌，猜測(cè)其與桃果實(shí)褐變有關(guān)。現(xiàn)有研究表明，菠蘿泛菌可引起多肉植物發(fā)生褐腐病[34]、玉米發(fā)生細(xì)菌性病害[35]。王建輝等[36]也證實(shí)，帶蓬鮮蓮在4℃貯藏條件下的優(yōu)勢(shì)腐敗菌主要為分散泛菌、成團(tuán)泛菌和葡萄球菌類菌群，其隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)證明了新疆地產(chǎn)油桃和庫(kù)車(chē)小白杏果實(shí)中存在豐富的內(nèi)生細(xì)菌資源，且假單胞菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬、歐文氏菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬等優(yōu)勢(shì)菌群的分布比例在健康果實(shí)和軟腐果實(shí)中存在明顯差異，以泛菌屬類菌群差異最為明顯；同時(shí)，采用可培養(yǎng)篩選法對(duì)腐爛油桃、庫(kù)車(chē)小白杏中的主要微生物進(jìn)行了分離。從腐爛油桃中分離獲得了泛菌屬和芽孢桿菌屬的分離株，從腐爛庫(kù)車(chē)小白杏中分離獲得了葡糖桿菌屬、泛菌屬和芽孢桿菌屬的分離株，并對(duì)所獲菌株的致腐能力進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，葡糖桿菌屬對(duì)油桃的致腐能力不明顯，但對(duì)庫(kù)車(chē)小白杏的致腐能力較強(qiáng)；芽孢桿菌屬對(duì)油桃和庫(kù)車(chē)小白杏的致腐能力均不明顯；而泛菌屬對(duì)油桃和庫(kù)車(chē)小白杏的致腐能力均較強(qiáng)。重點(diǎn)對(duì)泛菌屬的致腐能力進(jìn)行了驗(yàn)證與分析，結(jié)果表明：菌株P(guān)antoeasp. XAAS-P1為采后油桃、庫(kù)車(chē)小白杏軟腐病灶的優(yōu)勢(shì)菌群(約占病灶中微生物菌落分離數(shù)的90%左右)，且具有較強(qiáng)的致腐能力；接種4 d后，該菌株致腐率可達(dá)100%，并呈現(xiàn)出與自然軟腐一致的病狀。此外，前期對(duì)庫(kù)車(chē)小白杏的研究表明，青熟期和完熟期的庫(kù)車(chē)小白杏中均存在泛菌屬，且隨著庫(kù)車(chē)小白杏的成熟，其所占比例呈倍數(shù)增長(zhǎng)，最高可增加416倍[13]。本研究證實(shí)了泛菌屬類菌群是導(dǎo)致油桃和庫(kù)車(chē)小白杏軟腐變質(zhì)的主要病原細(xì)菌之一。

實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)盡管桃杏中存在豐富的內(nèi)生菌資源，但分離獲得微生物種類較為有限。實(shí)際上，不僅僅在內(nèi)生菌資源挖掘方面存在這類問(wèn)題，在環(huán)境微生物分離篩選中也普遍存在類似的問(wèn)題，這已成為微生物資源挖掘的瓶頸問(wèn)題。一般認(rèn)為，人工培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)濃度過(guò)高，原有生態(tài)關(guān)系被破壞，生長(zhǎng)緩慢的微生物被忽視，單純地將待分離樣品涂布在分離培養(yǎng)基中，是致使多數(shù)微生物表現(xiàn)為不可培養(yǎng)，分離的微生物種類有限的主要原因[37-38]。“不可(未)培養(yǎng)微生物”并不意味著絕對(duì)不能被培養(yǎng)，只是其某些生長(zhǎng)需求尚不清楚，暫時(shí)未能獲得純培養(yǎng)物。微生物培養(yǎng)組學(xué)概念的提出，為環(huán)境微生物的無(wú)漏分離篩選提供了理論依據(jù)。近年來(lái)，采用高通量測(cè)序技術(shù)，結(jié)合大量篩選與多種篩選培養(yǎng)方法，獲得了大量“不可培養(yǎng)”微生物，也有效糾正了相關(guān)高通量測(cè)序分析的實(shí)驗(yàn)偏差[39]。根據(jù)本研究的桃杏內(nèi)生菌高通量測(cè)序結(jié)果，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)相關(guān)內(nèi)生菌微生物培養(yǎng)組學(xué)，從而挖掘更多的微生物資源，并進(jìn)一步校正相關(guān)群落組成等，有待進(jìn)一步深入研究。