炎癥與腫瘤發(fā)生對造血祖細(xì)胞發(fā)育失衡的影響

李曉玉 劉霖 邢兵 湯婧 劉亞平 周祖平 蒲仕明，

（1. 廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，桂林 541004；2. 廣西高校干細(xì)胞與醫(yī)藥生物技術(shù)重點實驗室，桂林 541004；3. 廣西師范大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，桂林 541004）

在小鼠中，多能祖細(xì)胞（Multi-potent progenitors，MPPs）是由造血干細(xì)胞分化而來，隨后開始向兩個方向分化，形成共同髓系祖細(xì)胞（Common myeloid progenitors，CMPs）和共同淋巴祖細(xì) 胞（Common lymphoid progenitors，CLPs）。CLPs主要負(fù)責(zé)分化產(chǎn)生各種淋巴系細(xì)胞（包括T、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等），而CMPs則進一步向下游分化形成粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞（Granulocyte/macrophage progenitors，GMPs）和巨核細(xì)胞/ 紅系祖細(xì)胞（Megakaryocyte/erythrocyte progenitors，MEPs）。GMPs主要負(fù)責(zé)分化為粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，MEPs則最終分化形成血小板和紅細(xì)胞［1］。近期研究表明，腫瘤的發(fā)生與骨髓細(xì)胞生成的內(nèi)部紊亂有關(guān)［2］。由GMPs分化形成的未成熟子細(xì)胞，統(tǒng)稱為髓源性抑制細(xì)胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs），大量累積［3-5］。MDSCs不僅能抑制T 細(xì)胞增殖和功能活性，并且能直接參與腫瘤發(fā)育和血管生成等細(xì)胞過程進而促進腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移［6-7］，這是導(dǎo)致腫瘤加速生長和免疫逃逸的主要“元兇”之一［8］。因此，本實驗以免疫系統(tǒng)中較上游的祖細(xì)胞為切入點，研究炎癥和腫瘤對機體免疫系統(tǒng)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 實驗使用C57BL/6小鼠（對照組，炎癥模型組：AOM/DSS處理4周，腫瘤模型組：AOM/DSS處理12周）。

1.1.2 實驗耗材 細(xì)胞培養(yǎng)皿、各種規(guī)格離心管、1 mL注射器、細(xì)胞篩、各種規(guī)格吸頭，手術(shù)盤以及剪刀鑷子等。

1.1.3 實 驗 試 劑 Azoxymethane（AOM，Sigma）、Dextran Sulfate Sodium Salt（DSS，YEASEN）、Antimouse Sca-1-PE-Cy7、Anti-mouse c-Kit-APC-eFluor780、Anti-mouse CD34-FITC、Anti-mouse CD135 APC、Anti-mouse CD90.1-PerCP-Cy5.5、Anti-mouse CD127 PerCP-Cy5.5、Mouse Hematopoietic Lineage Antibody Cocktail FITC、Anti-mouse CD16/32-PerCP-Cy5.5、Anti-mouse CD4-PE、Anti-mouse CD8-PE-Cy7、Antimouse B220- PerCP-Cy5.5、Anti-mouse Gr-1-APC、Anti-mouse CD11b-PE-Cy7、7-AAD、固定/滲透試劑Cell fixation and cell permeabilization kit（eBioscience）、FBS、DMEM Basic（Gibco）、20×PBS 緩沖液（上海生工生物工程有限公司）、雙抗、紅細(xì)胞裂解液、蘇木素染液和伊紅染液（Solarbio）等。

1.1.4 實驗儀器 流式細(xì)胞儀（BD）、冷凍離心機、超純凈去離子水組合系統(tǒng)（Thermo）、石蠟切片機和石蠟包埋儀（Leica）等。

1.2 方法

1.2.1 小鼠炎癥性結(jié)腸癌模型構(gòu)建 用生理鹽水將100 mg AOM原液稀釋至1.25 mg/mL，選年齡性別相當(dāng)?shù)男∈箅S機分配3個組（對照組（N）、炎癥組（I）和腫瘤組（T）），按12.5 mg/kg小鼠體重對腫瘤組小鼠行單次腹腔注射AOM，繼而喂以含2%DSS的飲用水和普通飼料，喂藥周期以給藥1周停藥2周循環(huán)，停藥期間喂以正常飲用水，對照組小鼠則注射等量生理鹽水，喂正常飲用水。腫瘤組小鼠處理8周后，對炎癥組小鼠行單次腹腔注射AOM并按給藥周期給藥。腫瘤組腹腔注射12周（4個給藥周期，炎癥組4周）后，處死小鼠進行下一步實驗。

1.2.2 小鼠結(jié)腸石蠟切片和HE染色 處死小鼠，取結(jié)腸并沿徑向剖開，用PBS清洗結(jié)腸；并沿徑向卷起并投入波氏固定液中24 h，后流水沖洗6 h或過夜。將結(jié)腸組織修整后依次經(jīng)濃度梯度酒精（50%、60%、70%、80%、90%、95%I、95%II、100%I、100%II）脫水各35 min，在依次用二甲苯∶乙醇=1∶1溶液10 min，二甲苯I、二甲苯II各10 min，隨后將結(jié)腸組織投入58-60℃石蠟中透蠟2-3 h。將組織包埋在蠟塊中進行切片，厚度為4-5 μm；切片于38.5℃溫水上展片，待切片充分展平后撈至載玻片上進行烤片。隨后切片經(jīng)二甲苯II和二甲苯I各15 min、二甲苯∶乙醇=1∶1溶液10 min脫蠟，緊接著將切片按順序放入逆濃度梯度酒精和二次水中各5 min。將切片至于蘇木素染液中室溫條件下染色15-20 min，后放入水中洗去多余染液，并放入分化液中3-5 s，取出切片放入水中終止分化。隨后至于伊紅染液中染色5 min，后放入水中洗去多余的染液。95%I、95%II、100%I、100%II酒精各 2 min，二甲苯I、二甲苯II各2 min脫水透明，鏡檢封片成像。

1.2.3 小鼠骨髓細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備 脫頸處死小鼠，剪后肢并剔除股骨與脛骨上的肌肉，并將骨頭至于PBS中。用吸有DMEM完全培養(yǎng)基的注射器將骨腔內(nèi)的骨髓組織吹出，并用移液器反復(fù)吹打成單個懸浮細(xì)胞，經(jīng)300×g離心5 min（下同）后，棄上清液并加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，2 min后加入足量的PBS終止裂解，離心棄上清液。加6 mL PBS重懸細(xì)胞，用70 μm細(xì)胞篩過濾后待用。

1.2.4 細(xì)胞豐度分析 取骨髓單細(xì)胞懸液1 mL于2 mL離心管中離心，棄上清液，4℃避光孵育抗體30 min。后用PBS清洗細(xì)胞，并用1 mL PBS重懸細(xì)胞，進行流式細(xì)胞分析。

1.2.5 細(xì)胞周期分析 取骨髓單細(xì)胞懸液4 mL，離心棄上清液，避光孵育抗體30 min。加入500 μL固定液充分混勻，固定1 h，加入滲透液2 mL輕輕吹打均勻，750×g離心10 min，棄上清液，室溫避光孵育7-AAD染液1 h。隨后加入滲透液3 mL清洗細(xì)胞，并用3 mL滲透液重懸細(xì)胞，進行流式細(xì)胞分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠炎癥性結(jié)腸癌模型構(gòu)建

小鼠炎癥性結(jié)腸癌模型可以提供結(jié)腸炎和結(jié)腸癌兩組實驗動物。用AOM和DSS聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠4周，小鼠結(jié)腸可產(chǎn)生明顯的炎癥，誘導(dǎo)12周后可形成成熟的結(jié)腸癌，主要表現(xiàn)為炎癥組和腫瘤組小鼠結(jié)腸（平均長度分別為：9.3 cm和9.0 cm）較正常對照組小鼠結(jié)腸（11.6 cm）顯著縮短（圖1-A）。不僅如此，病理切片結(jié)果明顯表現(xiàn)出炎癥和腫瘤發(fā)生的情況（圖 1-B）。

圖1 AOM/DSS處理后小鼠結(jié)直腸炎癥和腫瘤發(fā)生情況

2.2 小鼠在炎癥和腫瘤狀態(tài)下HPCs豐度表現(xiàn)出特征性變化

為檢測小鼠炎癥和腫瘤進程中HPCs豐度的變化，對對照組、炎癥組和腫瘤組小鼠骨髓細(xì)胞進行了流式細(xì)胞分析（圖2-A）。結(jié)果顯示炎癥和腫瘤狀態(tài)下，小鼠骨髓中HPCs豐度呈特征性變化。主要表現(xiàn)為無論是腫瘤組與炎癥組，還是腫瘤組/炎癥組與對照組相比髓系祖細(xì)胞CMPs和GMPs的豐度均顯著性增加，而淋巴系祖細(xì)胞CLPs的豐度表現(xiàn)出顯著減少。如在正常生理條件下，CMPs細(xì)胞豐度為0.347%±0.024%，在炎癥和腫瘤狀態(tài)下其豐度分別為0.405%±0.018%和0.509%±0.017%，且腫瘤狀態(tài)下CMPs豐度顯著高于炎癥狀態(tài)（圖2-B）。GMPs在腫瘤和炎癥狀態(tài)下的含量分別為0.982%±0.123%和1.367%±0.150%，兩者相比，腫瘤狀態(tài)下GMPs含量顯著高于炎癥狀態(tài)并且均顯著高于正常生理狀態(tài)下GMPs的含量（0.660%±0.057%，圖2-B）。MEPs也表現(xiàn)出同樣的變化（N：0.665%±0.038%、I：0.875%±0.075% 以 及 T：1.283%±0.206%， 圖2-C），而對于CLPs而言，其在正常生理狀態(tài)下的豐度為0.029%±0.003%，炎癥和腫瘤狀態(tài)下分度分別為 0.021%±0.003% 和 0.012%±0.003%（ 圖 2-D）。炎癥和腫瘤小鼠的CLPs豐度顯著低于正常小鼠。此外，處于更上游的MPPs隨著炎癥和腫瘤的發(fā)生表現(xiàn)出細(xì)胞含量的顯著增加（N：0.015%±0.004%、I：0.026%±0.03%以及T：0.048%±0.012%，圖2-C）。上述結(jié)果表明小鼠炎癥和腫瘤發(fā)生中HPCs發(fā)生著特征性變化（主要偏向髓系細(xì)胞生成），提示了正常生理狀態(tài)與炎癥及腫瘤發(fā)生中的免疫系統(tǒng)特征性改變存在著遞進性的聯(lián)系。揭示了慢性炎癥誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)免疫能力的逐漸失衡可能是腫瘤形成的原因之一。

2.3 小鼠在炎癥和腫瘤狀態(tài)下HPCs增殖活性變化

圖2 小鼠造血祖細(xì)胞豐度分析

為檢測不同病理狀態(tài)下（炎癥和腫瘤）小鼠HPCs的增殖活性，利用7-AAD標(biāo)記HPCs核酸，通過核酸的含量來檢測其細(xì)胞周期時相分布。結(jié)果顯示，隨著炎癥和腫瘤的發(fā)生，HPCs進入分裂期的細(xì)胞顯著增加，其分裂能力顯著強于正常生理狀態(tài)下的分裂能力（CMPs：17.33%±1.03（N）、22.09%±1.78%（I）和30.63%±3.30%（T）；GMPs：17.41%±1.49%（N）、22.50%±0.89%（I）和 28.07%±1.77%（T）；MEPs：29.50%±1.81%（N）、35.10%±2.65（I）和42.10%±1.15%（T）以及MPPs：20.57%±0.59%（N）、24.55%±1.84%（I）和36.22%±4.57%（T），圖3），與炎癥和腫瘤狀態(tài)下小鼠HPCs豐度的結(jié)果一致。由細(xì)胞豐度和周期的結(jié)果可知，在炎癥和腫瘤狀態(tài)下，髓系祖細(xì)胞的分裂能力增強，其數(shù)量不斷積累。這提示了在炎癥和腫瘤狀態(tài)下HSPCs的髓系偏向。

2.4 炎癥和腫瘤進程中HSPCs的髓系偏向

圖3 小鼠造血祖細(xì)胞周期分析

為進一步驗證炎癥和腫瘤狀態(tài)下HSPCs偏向髓系分化，本研究繼續(xù)分析了小鼠骨髓（Bone marrow，BM）中髓系和淋巴系免疫細(xì)胞的產(chǎn)生情況。結(jié)果顯示，在炎癥和腫瘤狀態(tài)下，小鼠骨髓中MDSCs（CD11b+Gr-1+）比例顯著高于正常生理狀態(tài)（N：44.47%±1.22%、I：64.73%±2.60% 以 及 T：85.20%±1.21%，圖4-A）。相反，小鼠骨髓中淋巴系B細(xì)胞（B220+）比例則隨著炎癥和腫瘤的發(fā)生而顯著下降（N：19.50%±1.25%、I：15.23%±1.82%以及T：4.71%±1.78%，圖4-B）。分析結(jié)果說明，HSPCs在炎癥和腫瘤進程中偏向髓系分化。

2.5 腫瘤狀態(tài)下小鼠細(xì)胞免疫功能失衡

為檢測炎癥和腫瘤狀態(tài)下免疫機體免疫系統(tǒng)的免疫能力，本研究分別檢測了外周血（Peripheral blood，PB）中CD4+和CD8+T細(xì)胞的含量。通過CD4+/CD8+T細(xì)胞比值推測免疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫狀態(tài)。CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值作為免疫調(diào)節(jié)的一項指標(biāo)，正常值約1.4-2.0之間，超出或低于此范圍則表明細(xì)胞免疫功能失衡［9］。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠CD4+和CD8+T細(xì)胞含量（分別為：20.57%±1.27%和13.67%±1.50%）相比，在炎癥狀態(tài)下的CD4+和CD8+T細(xì)胞含量（分別為：19.56%±0.32%和13.47%±0.64%）無明顯變化，CD4+/CD8+T細(xì)胞比 值（ 分 別 為：1.51±0.15和 1.45±0.06） 也 無明顯差異。但是在腫瘤狀態(tài)下，CD4+T細(xì)胞含量（16.73%±0.35%）顯著降低而CD8+T細(xì)胞含量（18.20%±0.70%）顯著增加，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值（0.917）也明顯低于正常水平（圖4-C-E）。結(jié)果表明：在腫瘤狀態(tài)下CD4+/CD8+T細(xì)胞比值顯著下降，說明小鼠細(xì)胞免疫功能下降。

3 討論

長期以來，癌癥與慢性炎癥兩者間的關(guān)系備受關(guān)注。許多研究指出慢性炎癥與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，并能促進腫瘤的進程［10-12］。然而，人們對慢性炎癥與癌癥兩者關(guān)系的潛在機制知之甚少。為此，我們以AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠炎癥性結(jié)腸癌模型為研究基礎(chǔ)，分別對炎癥和腫瘤狀態(tài)下造血祖細(xì)胞的豐度和周期狀態(tài)進行了分析，并檢測了一些終末分化的免疫細(xì)胞含量變化，旨在詮釋慢性炎癥和腫瘤進程中免疫系統(tǒng)的變化規(guī)律。

經(jīng)過研究和分析發(fā)現(xiàn)，炎癥和腫瘤進程中，免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)異常，髓系造血祖細(xì)胞異常增加，HSPCs偏向髓系分化；炎癥和腫瘤能不同程度的誘發(fā)免疫抑制作用；慢性炎癥可能會逐漸誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的失衡，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的免疫能力下降，從而使腫瘤細(xì)胞得以規(guī)避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和抑制，并最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

圖4 小鼠骨髓和外周血中免疫細(xì)胞含量的統(tǒng)計分析

在小鼠的免疫系統(tǒng)中，HSPCs偏向髓系分化可能是機體應(yīng)激的結(jié)果。有研究報道，Toll樣受體（TLR），一種能識別微生物或病毒成分并引發(fā)先天免疫反應(yīng)的生物分子，除了在成熟的免疫細(xì)胞中表達(dá)外，在早期的造血祖細(xì)胞也有表達(dá)，說明早期的造血祖細(xì)胞能夠直接響應(yīng)外界的刺激，如炎癥和外傷感染等［13］。由此可以推斷HSPCs的髓系偏向和髓系造血祖細(xì)胞特別是GMPs的積累，與炎癥和腫瘤的發(fā)生相關(guān)。此外，免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生與衰老進程中的調(diào)節(jié)和變化具有諸多相似之處。在本研究組的前期研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠衰老進程中HSPCs也出現(xiàn)偏向髓系分化的現(xiàn)象［14］。Peng等［15］的研究也提出，人類HSCs也隨著衰老進程而偏向髓系分化，因此，HSPCs偏向髓系分化可能是機體應(yīng)激、衰老進程乃至腫瘤進程中的一個共同特征。

本研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤狀態(tài)下，小鼠細(xì)胞免疫功能下降，結(jié)果與其他研究相一致［16-18］。腫瘤的生成和發(fā)育與機體免疫功能狀態(tài)有著緊密的聯(lián)系。由外周血T淋巴細(xì)胞（CD4+和CD8+T細(xì)胞）構(gòu)成的細(xì)胞免疫是抗腫瘤免疫的重要形式。在臨床上，使用CD4+/CD8+T細(xì)胞比值來衡量免疫系統(tǒng)狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，在荷瘤小鼠PB中，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值顯著下降，說明腫瘤可能干擾和調(diào)控機體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致機體細(xì)胞免疫功能失衡。

在腫瘤多發(fā)的今天，腫瘤干擾和調(diào)控免疫系統(tǒng)一直是該領(lǐng)域的熱門研究內(nèi)容。腫瘤的發(fā)生與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)異常有關(guān)，但是腫瘤如何影響免疫系統(tǒng)的發(fā)育和調(diào)節(jié)仍未有清晰的認(rèn)識。HSPCs的髓系偏向并伴隨著腫瘤的免疫抑制可能是腫瘤發(fā)生中的共同特性。在腫瘤的治療中，解決HSPCs髓系偏向問題可能才是腫瘤治療的關(guān)鍵所在。

4 結(jié)論

在炎癥和腫瘤進程中，造血-免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)異常，髓系祖細(xì)胞包括MPPs、CMPs和GMPs豐度和細(xì)胞分裂能力顯著性增加，而淋巴系祖細(xì)胞CLPs分度和細(xì)胞分裂能力均顯著下降，揭示了HSPCs發(fā)生髓系偏向。腫瘤狀態(tài)下，小鼠外周血CD4+/CD8+T細(xì)胞比值下降，說明腫瘤可能干擾和調(diào)控機體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致機體細(xì)胞免疫功能紊亂。此外，炎癥和腫瘤狀態(tài)下的免疫系統(tǒng)兩者間存在著密切的關(guān)系，慢性炎癥可能通過誘導(dǎo)造血-免疫系統(tǒng)的失衡，使得腫瘤細(xì)胞得以規(guī)避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和抑制作用并最終導(dǎo)致腫瘤的形成。