拮抗茶炭疽病菌的木霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化

周羅娜 趙興麗 周玉鋒 劉輝 羅林麗 賀圣凌 陳銀翠

摘 要：為優(yōu)化對茶炭疽病菌有拮抗作用的木霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基，以木霉菌發(fā)酵液處理后的茶炭疽菌菌落直徑為優(yōu)化指標(biāo)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，建立了發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化模型，獲得了最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配比如下：葡萄糖18.34g/L、酵母浸膏1.88g/L、磷酸氫二鉀0.86g/L、硫酸亞鐵0.63g/L。在此條件下，木霉菌發(fā)酵液處理后的茶炭疽菌菌落直徑為3.01cm，比未優(yōu)化前的菌落直徑縮小了13%。

關(guān)鍵詞：木霉菌;發(fā)酵液;茶炭疽菌;響應(yīng)面法

中圖分類號 S476.8;TQ920.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）18-0096-06

Optimization of the Fermentation Medium of Trichoderma Antagonistic to Colletotrichum Gloeosporioides

ZHOU Luona1 et al.

（1Institute of Biological Technology，Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang 550006，China）

Abstract：In order to optimize the fermentation medium of Trichoderma.which had antagonistic effect on tea anthrax，the optimal model of fermentation medium was established by using the colony diameter of Trichoderma. treated with fermentation broth.The optimum ratio of fermentation medium was glucose 18.34g/L、yeast extract 1.88g/L、potassium hydrogen phosphate 0.86g/L、ferrous sulfate 0.63g/L.At this condition，the diameter of Colletotrichum gloeosporioides colony was 3.01cm，which was 13% smaller than that before optimization.

Key words：Trichoderma;Fermentation broth;Colletotrichum gloeosporioides;Response surface method

茶炭疽病是一種由真菌引起的、茶樹上常見的葉部病害[1]，在我國各個茶區(qū)均有發(fā)生，通常在貴州、浙江、福建等雨水多、濕度大的省份發(fā)生較多[2-4]。該病主要由炭疽菌（Collectotrichums spp）引起，病菌多從嫩葉侵入，在茶樹成葉上發(fā)病，使得葉片焦枯、掉落，影響茶樹光合作用[5]，導(dǎo)致茶葉減產(chǎn)。目前防治炭疽病主要是利用抗病品種，但當(dāng)病害發(fā)生嚴(yán)重時，仍采用傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥防治方法為主[6]。然而，農(nóng)藥殘留不僅對茶葉品質(zhì)造成嚴(yán)重影響，而且還會導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)惡化等嚴(yán)重問題。因此，研究開發(fā)和使用無毒、無污染、環(huán)境相容性好的生物農(nóng)藥是大勢所趨，生物防治是實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。

木霉菌（Trichoderma spp）作為生防菌劑是近年來研究開發(fā)的熱點。木霉菌屬于半知菌亞門、絲孢綱、叢梗孢目、叢梗孢科的真菌，廣泛存在于土壤、空氣和植物體表面等生態(tài)環(huán)境中。目前，通過大量研究已經(jīng)成功鑒定得到了21個種類[7-8]。國內(nèi)外許多學(xué)者將木霉菌制劑用于防治植物病害，如紋枯病（Rhizoctonia solani）[9-11]、稻瘟?。≒yricularia grisea）[12-13]、水稻惡苗病（Fusarium moniliforme）[14-15]，并取得了較好的效果。筆者對1株具有拮抗茶炭疽病菌作用的木霉菌進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，以盡可能提高木霉菌發(fā)酵液中抑制茶炭疽病菌生長的物質(zhì)含量，在一定程度上節(jié)約成本，提高發(fā)酵效率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種 木霉菌（Trichoderma asperelloides）、茶炭疽病菌（Collectotrichum boninense）均由本實驗室分離保存。

1.1.2 儀器與設(shè)備 GI100DP滅菌鍋（致微（廈門）儀器有限公司）;BSD-YX3400恒溫?fù)u床（上海博訊醫(yī)療生物儀器有限公司）;SPX-250BⅢ生化培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;SW-CJ-2D型凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）;艾柯DZG-303A超純水制備儀;BSA224S-CW電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL。PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、蒸餾水1000mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 木霉菌菌種培養(yǎng) 平板活化：在PDA培養(yǎng)基上接種直徑5mm木霉菌菌餅，28 ℃ 恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)7d。種子液培養(yǎng)：在500mL錐形瓶中裝100mL PDB培養(yǎng)基，從平板上挑取菌落接種于搖瓶中，培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速 120r/min，培養(yǎng) 3d后進(jìn)行接種發(fā)酵。

1.2.2 茶炭疽菌菌種培養(yǎng) 平板活化：在PDA培養(yǎng)基上接種直徑5mm茶炭疽病菌菌餅，25℃黑暗培養(yǎng)5d。

1.2.3 單因素試驗（1）木霉菌發(fā)酵液碳源的篩選及濃度確定。不同碳源對木霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響：基本培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，分別添加20g/L葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、乳糖替代PDA培養(yǎng)基中的碳源，并設(shè)置無糖作為對照。在制備好的平板中央接種直徑5mm木霉菌菌餅（每組實驗設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)）28℃恒溫培養(yǎng)。48h后采用“十”字交叉法測量菌落生長直徑作為菌絲生長狀況指標(biāo)，培養(yǎng)7d后用10mL滅菌ddH2O洗脫菌落孢子制成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù)孢子產(chǎn)量，公式如下：

1mL孢子懸浮中的總孢子數(shù)=A/5×25×104×B （1）

式中，A：5個中格的總孢子數(shù);B：稀釋倍數(shù)。

木霉菌發(fā)酵液最佳碳源添加量對茶炭疽病菌菌落生長的影響：基本發(fā)酵培養(yǎng)基為PDB培養(yǎng)基，最佳碳源添加量分別為0、5、10、15、20、25、30、35g/L，配置完成的培養(yǎng)基115℃滅菌30min。在500mL錐形瓶中裝100mL發(fā)酵培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中接種2mL種子液，培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，培養(yǎng)5d。

將上述發(fā)酵液經(jīng)抽濾、微濾后取濾液。將濾液與滅菌好的PDA培養(yǎng)基1∶9混合均勻，不添加濾液的PDA培養(yǎng)基作為對照實驗。在平板中央接種直徑5mm茶炭疽菌菌餅（每組實驗設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)），25℃黑暗培養(yǎng)5d。采用“十”字交叉法測量并記錄茶炭疽病菌菌落生長直徑。

（2）木霉菌發(fā)酵液氮源的篩選及濃度確定。不同氮源對木霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響：在基本培養(yǎng)基PDA中采用最佳碳源添加及其最佳添加量，分別添加硝酸鈉，蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、丙氨酸、尿素、硫酸銨，設(shè)無氮源為對照，添加量為2g/L，方法同上。木霉菌發(fā)酵液最佳氮源添加量對茶炭疽病菌菌落生長的影響：在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中添加最佳碳源添加量，最佳氮源添加量分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5g/L，方法同上。

（3）木霉菌發(fā)酵液磷源的篩選及濃度確定。不同磷源對木霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響：在基本培養(yǎng)基PDA中采用最佳碳源添加及其最佳添加量，分別添加磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀，設(shè)置無磷源為對照，添加量為1g/L，方法同上。木霉菌發(fā)酵液最佳磷源添加量對茶炭疽病菌菌落生長的影響：在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中添加最佳碳源添加量，最佳磷源添加量分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4g/L，方法同上。

（4）木霉菌發(fā)酵液微量元素的篩選及濃度確定。不同微量元素對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響：在基本培養(yǎng)基PDA中采用最佳碳源及其最佳添加量，分別添加硫酸鈉、硫酸亞鐵、硫酸鈣、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸錳，并設(shè)無微量元素作對照，添加量為0.5g/L，方法同上。木霉菌發(fā)酵液最佳微量元素添加量對茶炭疽病菌菌落生長的影響：在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中添加最佳碳源添加量，最佳微量元素添加量分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7g/L，方法同上。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果和Box-Behnken試驗設(shè)計原理，以最佳碳源、氮源、磷源、微量元素添加量為響應(yīng)面考察因素，每個因素設(shè)計3個水平，用（-1，0，1）作為編碼，以木霉菌發(fā)酵液處理后的茶炭疽病菌菌落生長直徑作為響應(yīng)值（Y），使用Design-Expert 10軟件進(jìn)行4因素3水平試驗優(yōu)化，每個處理3次重復(fù)。培養(yǎng)基因素水平如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌發(fā)酵液的碳源及濃度 碳源為菌體的生長代謝提供細(xì)胞的基本骨架，也是細(xì)胞生命活動的能量來源，會影響次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。由圖1可知，5種碳源中，添加葡萄糖，木霉菌菌絲生長較快，產(chǎn)孢量較多。

由圖2可知，選擇葡萄糖為最佳碳源，隨著木霉菌發(fā)酵液葡萄糖添加量的增大，發(fā)酵液抑制茶炭疽菌菌落的直徑先減小后增大。葡萄糖添加量為20g/L時，經(jīng)木霉菌發(fā)酵液處理后的茶炭疽菌菌落直徑最小，僅為4.11cm，抑菌效果最好。后續(xù)單因素試驗中，選擇葡萄糖添加量為20g/L。

2.2 木霉菌發(fā)酵液的氮源及濃度 菌體的生長和各種初級、次級代謝產(chǎn)物等含氮物質(zhì)的合成都需要氮源，氮源在發(fā)酵過程中還起著調(diào)節(jié)菌體生長及生物量的作用。由圖3可知，木霉菌對有機(jī)氮源利用效果比無機(jī)氮源好，其中酵母浸膏效果最好。

在選擇酵母浸膏為最佳氮源的條件下，在木霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同濃度的酵母浸膏進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，木霉菌發(fā)酵液的抑菌活性在酵母浸膏濃度為1.5g/L時最強(qiáng)，抑菌效果最好，經(jīng)木霉菌發(fā)酵液處理后的茶炭疽病菌菌落直徑為3.89cm，之后隨著酵母浸膏濃度的進(jìn)一步增加，抑菌效果反而降低。因此，選擇最佳酵母浸膏濃度為1.5g/L。

2.3 木霉菌發(fā)酵液的磷源及濃度 磷主要作用是維持菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。由圖5可知，添加磷酸氫二鉀對木霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢有促進(jìn)作用，添加磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀對菌絲生長及產(chǎn)孢略有抑制作用。

由圖6可知，選擇磷酸氫二鉀為最佳發(fā)酵磷源，木霉菌發(fā)酵液的抑菌活性在磷酸氫二鉀濃度為1g/L時最高，經(jīng)木霉菌發(fā)酵液處理后的茶炭疽菌菌落直徑最小，僅為4.02cm，抑菌效果最好。因此，選擇最佳磷酸氫二鉀濃度為1g/L。

2.4 木霉菌發(fā)酵液的微量元素及濃度 菌體的生長和發(fā)酵產(chǎn)物的形成需要一些微量元素作為酶的輔基或激活劑。由圖7可知，微量元素的添加對木霉菌菌絲生長及產(chǎn)孢影響不大，其中，添加硫酸亞鐵對菌絲生長和產(chǎn)孢略有促進(jìn)作用，而添加硫酸鋅、硫酸錳、硫酸鈣、硫酸銅、硫酸鈉、硫酸鎂略有抑制作用。

由圖8可知，選擇硫酸亞鐵為最佳發(fā)酵微量元素，木霉菌發(fā)酵液的抑菌活性在硫酸亞鐵濃度為0.6g/L時最高，經(jīng)木霉菌發(fā)酵液處理后的茶炭疽菌菌落直徑最小，為3.52cm，抑菌效果最好，因此選擇最佳硫酸亞鐵濃度為0.6g/L。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.5.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果和Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選擇葡萄糖、酵母浸膏、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵作為自變量，以經(jīng)木霉菌發(fā)酵液處理后茶炭疽病菌菌落生長直徑作為響應(yīng)值，進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗。試驗設(shè)計方案及結(jié)果如表2所示。

2.5.2 模型及顯著性 根據(jù)表2的實驗結(jié)果，運用Design expert 10.0軟件對結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到如下回歸方程：

Y=3.37+0.85A-0.42B+0.087C+0.29D-0.058AB-0.087AC-0.29AD+1.15BC-0.43BD+0.79CD+0.98A2+1.01B2+0.64C2+0.32D2

由表3可知，該模型P<0.0001，說明模型是極顯著的;模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9508，表明模型擬合較好;模型失擬項的P值為0.7556，差異不顯著，表明該模型符合實際情況。試驗結(jié)果表明，4個因素對木霉菌發(fā)酵液抑菌效果的影響大小依次為：葡萄糖>酵母浸膏>硫酸亞鐵>磷酸氫二鉀。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知：A、B、BC、CD、A2、B2、C2差異極顯著（P<0.01），D、BD、D2差異顯著（P<0.05），其他不顯著。

2.5.3 木霉菌發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基 通過Design-expert軟件繪制響應(yīng)面圖對試驗結(jié)果進(jìn)行可視化分析。從響應(yīng)面三維圖（圖9）可看出，該方程的拋物線圖形開口均向上，說明方程存在最小值。由軟件分析得到木霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄糖18.34g/L、酵母浸膏1.88g/L、磷酸氫二鉀0.86g/L、硫酸亞鐵0.63g/L時，木霉菌發(fā)酵液處理后的茶炭疽菌菌落直徑為2.98cm。

為驗證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，按照響應(yīng)面確定的各因素最優(yōu)濃度配制木霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行3次試實驗驗證。在試驗條件下，木霉菌發(fā)酵液處理后的茶炭疽菌菌落直徑為3.01cm，與預(yù)測值接近，說明響應(yīng)面可運用于實際預(yù)測。

3 結(jié)論與討論

以木霉菌為研究對象，對其發(fā)酵液抑制茶炭疽菌的活性進(jìn)行研究，并利用響應(yīng)面優(yōu)化其液體發(fā)酵培養(yǎng)基。結(jié)果表明：木霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)配比為葡萄糖18.34g/L、酵母浸膏1.88g/L、磷酸氫二鉀0.86g/L、硫酸亞鐵0.63g/L;在此條件下，木霉菌發(fā)酵液處理后茶炭疽菌菌落直徑為3.01cm，與未優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基處理后的茶炭疽菌菌落直徑（約為3.46cm）相比，茶炭疽菌菌落直徑縮小了13%。后續(xù)將對發(fā)酵液中的小分子物質(zhì)、脂溶性物質(zhì)、水溶性物質(zhì)分離、純化后進(jìn)行下一步的研究，以期得到更穩(wěn)定、高效的木霉菌抑制茶炭疽菌制劑。

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（責(zé)編：徐世紅）