高效液相色譜法測(cè)定黃連解毒散中梔子苷和黃芩苷

余功富

(臺(tái)州市路橋區(qū)橫街動(dòng)物衛(wèi)生所，浙江 臺(tái)州 318056)

黃連解毒散由黃連、黃芩、梔子和黃柏通過(guò)一定的工藝制得[1]。具有瀉火解毒的功效[2]，臨床主要用于三焦實(shí)熱[3-4]，瘡黃腫毒[5-6]。該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)獸藥典》2015年版二部[1]，標(biāo)準(zhǔn)采用薄層色譜法分別對(duì)黃芩、黃連和梔子苷進(jìn)行定性，采用三種不同的色譜系統(tǒng)和提取方法，用到乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、丁酮、乙醇、丙酮、甲酸、甲苯等近10種溶劑，環(huán)境污染嚴(yán)重，操作繁瑣，對(duì)操作人員人身傷害比較大。未對(duì)黃芩苷和梔子苷等進(jìn)行含量測(cè)定，不能全面評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量，控制方法不完善[7-8]。

高效液相色譜法快捷、準(zhǔn)確、靈敏度高，定性和定量均準(zhǔn)確。但未見文獻(xiàn)報(bào)道利用高效液相色譜法測(cè)定黃連解毒散中的黃芩苷和梔子苷。高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器法(HPLC-DAD)因其結(jié)合了光譜掃描和數(shù)據(jù)庫(kù)功能，定性更準(zhǔn)確，在獸藥檢驗(yàn)中將發(fā)揮更大的優(yōu)勢(shì)。本試驗(yàn)采用HPLC-DAD法對(duì)黃連解毒散中梔子苷和黃芩苷同時(shí)檢測(cè)的方法進(jìn)行了研究，為黃連解毒散質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 高效液相色譜儀，Agilent 1260，配Agilent 1260 Infinity G4212A型DAD檢測(cè)器；XS205電子天平(Mettler公司)；DELTA320 pH計(jì)(Mettler公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試劑與材料 乙腈為色譜純，甲醇、磷酸、鹽酸、氫氧化鈉、30%雙氧水均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為milli-Q超純水。黃芩苷對(duì)照品，來(lái)源中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)Z0271705，含量96.8%；梔子苷對(duì)照品，來(lái)源中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110749-201115，含量99.7%。黃連解毒散，來(lái)源浙江博信藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為20181001、20181002和20181003；來(lái)源杭州愛力邁動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)為T191001、T191002和T191003。

2 方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的配制 取黃芩苷對(duì)照品12.650 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理使溶解，定容；取梔子苷對(duì)照品7.00 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處理使溶解并稀釋至刻度，搖勻制成對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2供試品溶液的配制 精密稱取供試品約0.2 g于100 mL量瓶中，50%甲醇溶液適量，超聲處理10 min，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.3色譜條件 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：0.05%磷酸溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序見表1；進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min，用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行掃描，掃描范圍為200～400 nm，記錄240 nm波長(zhǎng)處的色譜圖。該色譜條件下梔子苷和黃芩苷峰分離良好。對(duì)照品溶液色譜圖見圖1，保留時(shí)間14.777 min的為梔子苷，保留時(shí)間19.634 min的為黃芩苷，梔子苷光譜圖見圖2，黃芩苷光譜圖見圖3；供試品溶液色譜圖見圖4，供試品溶液中梔子苷光譜圖見圖5，供試品溶液中黃芩苷光譜圖見圖6。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

圖1 梔子苷和黃芩苷對(duì)照品溶液色譜圖

圖2 梔子苷對(duì)照品溶液光譜圖

圖3 黃芩苷對(duì)照品溶液光譜圖

圖4 黃連解毒散色譜圖

圖5 黃連解毒散中梔子苷光譜圖

圖6 黃連解毒散中黃芩苷光譜圖

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍考察 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用50%甲醇稀釋2倍、5倍、10倍、20倍和50倍。制成相應(yīng)濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣分析，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果梔子苷在2.790～139.6 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，線性方程Y=12.36546X-10.12365，相關(guān)系數(shù)為0.999 79；黃芩苷在2.450～122.5 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，線性方程Y=13.23336X+31.11254，相關(guān)系數(shù)為0.999 68。

2.4.2精密度試驗(yàn) 取批號(hào)為T191001黃連解毒散供試品溶液，按上述色譜條件重復(fù)連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得梔子苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%，黃芩苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%。表明此方法的儀器精密度符合要求。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為T191001黃連解毒散供試品溶液，分別于0、2、4、6、12和24 h進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得梔子苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%，測(cè)得黃芩苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%。表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.4方法專屬性 取T191001黃連解毒散各0.1 g，置25 mL量瓶中，分別加1 mol/L鹽酸溶液、1 mol/L氫氧化鈉溶液和5%過(guò)氧化氫溶液各1 mL，放置1 h，用50%甲醇溶液定容，依法測(cè)定。梔子苷和黃芩苷在鹽酸溶液和過(guò)氧化氫溶液中均穩(wěn)定，含量減少在3%以內(nèi)；在氫氧化鈉溶液中，黃芩苷和梔子苷含量均減少約50%。

2.4.5加樣回收率 取梔子苷和黃芩苷各適量，加甲醇配制成約1 mg每毫升的加樣回收率試驗(yàn)溶液。另取批號(hào)為T191001的黃連解毒散樣品6份，各0.1 g，分別精密加入加樣回收率試驗(yàn)溶液各2 mL，置100 mL量瓶中，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下條件檢測(cè)，結(jié)果扣除黃連解毒散樣品原有相應(yīng)組分的量，計(jì)算平均回收率及RSD，結(jié)果梔子苷平均回收率為98.5%，RSD為1.6%；黃芩苷平均回收率97.8%，RSD為1.1%。

2.4.6實(shí)際樣品的測(cè)定 取批號(hào)為T191101、T191102、T191103、20181001、20181002和20181003的黃連解毒散3個(gè)平行，各0.2 g，按照“2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，依法檢測(cè)，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算梔子苷和黃芩苷含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品中含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1提取溶劑的選擇 本試驗(yàn)選擇了水、甲醇、50%甲醇、50%乙醇和50%乙腈(分別由1、2、3、4、5代表)超聲處理20 min，結(jié)果見圖7。梔子苷在甲醇中提取效率較低，約50%，50%乙腈提取效率90%以上，但峰形較差，其他幾種溶劑均較好；黃芩苷在水中提取效率很低，只能提取出10%左右；在50%乙腈中提取效率在30%左右，其余溶劑均較好。因此，綜合考慮，選擇50%甲醇作為黃連解毒散供試品的提取溶劑。在這基礎(chǔ)上，做了超聲時(shí)間的確認(rèn)，試驗(yàn)分別超聲處理5 min、10 min、20 min和30 min，結(jié)果無(wú)顯著差異，見圖8。因此，超聲處理時(shí)間定為10 min。

圖7 提取溶劑對(duì)含量的影響

圖8 超聲處理時(shí)間對(duì)含量的影響

3.2檢測(cè)波長(zhǎng) 本試驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器對(duì)梔子苷、黃芩苷和連翹苷進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，梔子苷在240 nm波長(zhǎng)有最大吸收，黃芩苷在215 nm-277 nm、316 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，綜合考慮每個(gè)藥物的響應(yīng)值及雜質(zhì)干擾因素，選擇240 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3流動(dòng)相的選擇 考察了乙腈與0.01%磷酸溶液、0.05%磷酸溶液、0.2%磷酸溶液和0.4%磷酸溶液等酸溶液作為流動(dòng)相，各流動(dòng)相保留時(shí)間和峰形一致，而乙腈-0.4%磷酸溶液pH值為1.5，乙腈-0.2%磷酸溶液pH值為1.7，pH值小于2.0對(duì)色譜柱損害較大；而乙腈-0.05%磷酸溶液pH值為2.3左右。因此，選擇0.05%磷酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相，調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，兩種藥物分離較好，保留時(shí)間比較合適。最后，確定梯度洗脫程序。

4 結(jié)論

本文采用HPLC-DAD法對(duì)黃連解毒散中梔子苷和黃芩苷進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)提取溶劑、提取方式、檢測(cè)波長(zhǎng)、專屬性和色譜條件等進(jìn)行研究，結(jié)果表明該方法定性定量準(zhǔn)確，適用于黃連解毒散中的梔子苷和黃芩苷的含量檢測(cè)。