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    長鏈非編碼RNA CCAT1調(diào)控MAPK信號通路對于膠質(zhì)瘤細胞的影響

    2020-10-26 05:44:04王春輝孟繁凱費邵陽鄭林杰
    中國實驗診斷學(xué) 2020年10期
    關(guān)鍵詞:劃痕膠質(zhì)瘤磷酸化

    王春輝,孟繁凱,費邵陽,陳 莫,鄭林杰

    (吉林省人民醫(yī)院 神經(jīng)外科,吉林 長春130021)

    神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)是腦神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤,預(yù)后極差,復(fù)發(fā)率高、死亡率高[1]。尋找有效的膠質(zhì)瘤診斷和治療分子靶點,提升治療效率一直是研究者關(guān)注的熱點,長鏈非編碼RNA( lncRNA)是人類轉(zhuǎn)錄組中一類重要的調(diào)控分子,近年來的研究表明lncRNA的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),然而與神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)的lncRNA報道仍然較為有限。結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)移因子-1(CCAT1),具有2628對堿基,位于染色體8q24.21上,2012年,首次被發(fā)現(xiàn)在大腸癌中特異性高表達[2],隨后的研究表明,其在肝癌、胃癌等消化道腫瘤中表達明顯升高,并與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲有著密切關(guān)聯(lián)[3,4],近年來的研究證明CCAT1在腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中也存在異常表達,而相關(guān)機制仍然有待闡明。因此本研究以神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251為研究對象,通過下調(diào)lncRNA-CCAT1的表達,以探討其在膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲能力的作用,并分析其對MAPK信號通路相關(guān)分子的影響,以其為CCAT1應(yīng)用于膠質(zhì)瘤診斷和治療提供數(shù)據(jù)支撐。

    1 材料及方法

    1.1 實驗材料

    人神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤細胞U251(源于多形性膠質(zhì)母細胞瘤細胞WHO IV級)購自中國科學(xué)院上海細胞庫。RPMI1640培養(yǎng)液購于美國Invitrogen公司,胎牛血清購自美國Gibco公司,胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素購自美國Sigma公司;BCA蛋白濃度定量試劑盒、ECL顯色試劑盒、相關(guān)抗體(磷酸化的ERK1/2單抗、ERK1/2單抗、p38單抗、磷酸化的p38單抗、JNK單抗、磷酸化的JNK單抗、HRP標記的山羊抗兔二抗)及MTT試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司;Trizol購于美國Invitrogen公司;Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen公司;SYBRGreen qPCR檢測試劑盒購于日本Takara公司; CCAT1 shRNA(5’-CACCAGCCGGATTAAAT CGTTAGGCCGACCTAC-

    TTAAGGCCTTCTTCG-3’);陰性對照sh-NC(5’-AGGTCCCTACGTTTAACCCCCTATTGGACTA-

    CGGAATTTTTCG-3’)均訂購自上海生工公司。

    1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

    細胞用1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。轉(zhuǎn)染前24 h,接種在六孔板中,每孔(0.5-2)×105個細胞,待細胞融合度為60%-80%。轉(zhuǎn)染過程參照lipofectamine 2000說明書進行。將細胞分為sh-CCAT1組、sh-NC組、空白組。轉(zhuǎn)染后置于37℃培養(yǎng)6小時后,繼續(xù)更換為10%血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞,進行下一步的檢測。

    1.3 qRT-PCR方法驗證敲低U251細胞lncRNA-CCAT1效率

    轉(zhuǎn)染48 h后的細胞總mRNA用Trizol法提取,mRNA的純度用Nanodrop測定,將提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板,參照qRT-PCR試劑盒說明配置反應(yīng)體系及條件,以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt方法計算各組lncRNA-CCAT1的mRNA相對表達量。重復(fù)3次。lnc-CCAT1檢測引物5’-GCATCCTTAGTACTCACTG-3’,5’-GGCCATCTCCTGCTGTTAG-3’。

    1.4 MMT法檢測細胞增殖變化

    將不同組的U251細胞分別接種到96孔板,接種濃度為4×103個/孔,轉(zhuǎn)染24小時、48小時、72小時、96小時后,分別取6個復(fù)孔細胞加入MTT試劑20 μl,37℃培養(yǎng)4 h后,加入DMSO 100 μl,振蕩反應(yīng)10 min后,利用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值(A值)。

    1.5 細胞劃痕試驗

    將三組細胞消化接種到新的6孔板,次日細胞長滿后,采用10 μl 移液器槍頭在6 孔板底部進行劃痕,采用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次,去除脫落細胞,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,采用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合情況并拍照。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

    1.6 Western blot 試驗

    收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組U251細胞,提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,每個樣品取40 μg上樣,SDS-PAGE電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上,室溫封閉1小時,分別加入相應(yīng)的蛋白抗體4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,加入二抗(1∶5 000),室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,加入ECL發(fā)光液顯色,利用Image J分析各條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,計算各組條帶的蛋白相對表達量。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

    用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗,P<0.05有顯著性差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 Sh-CCAT1對U251細胞lncRNA-CCAT1干擾效率的驗證

    在腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251中,轉(zhuǎn)染sh-CCAT1后,qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,sh-CCAT1組lnc- CCAT1的表達(0.31±0.04)顯著低于sh-NC組(1.03±0.03)和空白組(1.00±0.11)(均P<0.05),sh-NC組與空白組間無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染sh-CCAT1可以有效地抑制膠質(zhì)瘤細胞U251中l(wèi)ncRNA-CCAT1的表達。

    2.2 sh-CCAT1對于U251細胞增殖能力的影響

    MMT法檢測各組細胞活力顯示,空白組和sh-NC組在轉(zhuǎn)染U251細胞24-96 h間的細胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而sh-CCAT1轉(zhuǎn)染組,從48 h起細胞活力顯著低于空白組,見表1。說明下調(diào)lnc RNA-CCAT1可以顯著地抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖,提示lnc RNA-CCAT1有潛力成為抑制膠質(zhì)瘤的新分子靶點。

    表1 MMT法檢測sh-CCAT1對于U251細胞增殖能力的影響

    2.3 抑制lncRNA-CCAT1對于U251細胞侵襲和遷移能力的影響

    利用細胞劃痕試驗檢測轉(zhuǎn)染后各組膠質(zhì)瘤細胞的侵襲和遷移能力,結(jié)果如圖1,劃痕試驗中,24 h后,sh-CCAT1組的劃痕愈合率(31.1±6.3)%明顯低于sh-NC(59.78±3.72)%組和空白組(61.1±2.72)%(P<0.05),而sh-nc組與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明抑制lncRNA-CCAT1的表達可以降低膠質(zhì)瘤細胞U251的侵襲和遷移能力。

    2.4 抑制lnc RNA-CCAT1對于MAPK信號通路相關(guān)蛋白的影響

    Western blost檢測MAPK信號通路相關(guān)的關(guān)鍵蛋白,結(jié)果如圖2所示,下調(diào)lncRNA-CCAT1之后,而ERK、P38、JNK的表達沒有明顯改變,而p-ERK、p-P38、p-JNK則受到顯著抑制,說明lncRNA-CCAT1 抑制了這些關(guān)鍵蛋白的磷酸化,這提示lncRNA-CCAT1可能通過抑制MAPK信號通路的活化,抑制膠質(zhì)瘤U251細胞的增殖和侵襲、遷移。

    圖1 劃痕實驗檢測三組U251細胞的侵襲和遷移能力

    3 討論

    越來越多的研究表明,長鏈非編碼RNA是長度大于200nt的非編碼RNA,其在表觀遺傳調(diào)控、細胞周期調(diào)控等諸多生命活動中均扮演了重要的角色,幾乎參與了生物體所有生理和病理過程,越來越多的臨床和實驗證據(jù)均表明,lncRNA異常表達與人類多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),有潛力成為腫瘤診斷和治療的關(guān)鍵靶點。其中l(wèi)nc RNA-CCAT1,最早在結(jié)腸癌中被發(fā)現(xiàn)特異性高表達,位于人類染色體8q24上,與多種疾病的易感性有關(guān),進一步的研究表明CCAT1與多種腫瘤有關(guān)。在膽管癌中,CCAT1的高表達通常意味著較差的預(yù)后;在急性髓細胞白血病中,CCAT1正調(diào)控miR-490-3p,參與了MAPK信號通路的激活[5];在胃癌細胞中,CCAT1可以促進腫瘤細胞的增殖,同時被miR-219-1所拮抗[6];在膠質(zhì)瘤組織中也發(fā)現(xiàn)了CCAT1的高表達,并有研究表明CCAT1與膠質(zhì)瘤細胞的凋亡相關(guān)[7]。我們的研究發(fā)現(xiàn),在膠質(zhì)瘤細胞U251中,CCAT1可以有效抑制腫瘤細胞增殖和侵襲,為探討其中的分子機制,我們選擇檢測三組細胞中MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達情況。

    圖2 Westen blot分析檢測lnc RNA-CCAT1下調(diào)對于MAPK信號通路相關(guān)蛋白的影響

    絲裂原活化蛋白激酶是細胞感受外界信號的重要中介酶體,是由一組可以被多種細胞外界刺激(細胞因子、激素等)所激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。MAPK信號通路是一種高度保守的三級激酶模式,包括MAPK激酶激酶(MKKK)、MAPK激酶(MKK)和MAPK,三種激酶通過逐級磷酸化依次激活將信號向下傳遞,參與細胞多種生理和病理過程。MAPK級聯(lián)通路涉及了多種關(guān)鍵信號因子,ERK廣泛參與細胞的增殖分化的調(diào)控[8];JNK家族涉及細胞各種應(yīng)激原誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),參與細胞對溫度、壓力、輻射等應(yīng)激反應(yīng)[9];p38則是介導(dǎo)炎癥、凋亡的關(guān)鍵因子[10,11]。我們的結(jié)果表明,在lncRNA-CCAT1被抑制后,MAPK通路中的關(guān)鍵因子,自身表達量未發(fā)生明顯變化,而其磷酸化被顯著抑制,這提示lnc-CCAT1很可能參與了MAPK通路的激活。

    綜上所述,lnc RNA-CCAT1可以顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞U251的增殖和遷移,CCAT1可能是通過影響MAPK信號通路的激活,參與腫瘤細胞的增殖。本研究的成果將有助于理解CCAT1參與腫瘤生物行為的分子機制,為尋找腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診療新靶點提供幫助。

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