水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)及其研究進(jìn)展

趙沙沙 田永宏 陳 波 房振兵 潘高峰

（湖北省襄陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，襄陽 441057）

水稻花藥培養(yǎng)是采用無菌操作技術(shù)，把發(fā)育到一定時(shí)期的水稻花藥接種到人工培養(yǎng)基上，通過改變花粉粒的發(fā)育程序誘導(dǎo)脫分化形成愈傷組織，然后使愈傷組織再分化形成單倍體植株的過程。單倍體植株經(jīng)過秋水仙堿或自然加倍，成為完整的二倍體植株。將花藥培養(yǎng)與其他育種技術(shù)相結(jié)合，可以快速純合育種材料，有效縮短育種周期，提高選擇效率，加快育種進(jìn)程[1]。

1 水稻花藥培養(yǎng)發(fā)展概況

日本學(xué)者新關(guān)（Niizeki）和大野（Oono）于1968年利用花藥培養(yǎng)技術(shù)首次獲得水稻單倍體植株[2]，開啟了水稻花藥培養(yǎng)研究的先河[3]。1970 年，我國開始水稻花藥培養(yǎng)的研究，并于1975 年第1 次利用花藥培養(yǎng)技術(shù)育成了粳稻新品種單豐1 號(hào)[4]。20世紀(jì)80 年代中期，研究者們開始將花藥培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于水稻育種，先后育成了中花系列、龍粳系列和花育系列等粳稻品種以及后續(xù)的其他品種[5]。但是應(yīng)用花藥培養(yǎng)技術(shù)選育的秈稻品種還比較少，到20 世紀(jì)末僅有5 個(gè)，其中江西農(nóng)科院4 個(gè)、江西農(nóng)業(yè)大學(xué)1 個(gè)，推廣面積都不大[2]。目前，通過花藥培養(yǎng)技術(shù)育成的常規(guī)水稻品種已有40 多個(gè)[6]。近年來，隨著研究的不斷深入，水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)也在逐步完善，并與其他技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用在遺傳育種上，已經(jīng)成為生物技術(shù)育種中相對(duì)成熟、實(shí)用而有效的技術(shù)[2]。

2 影響水稻花藥培養(yǎng)效率的技術(shù)要點(diǎn)

在實(shí)際操作過程中，由于受基因型、培養(yǎng)基組成以及培養(yǎng)環(huán)境的影響，水稻花藥培養(yǎng)仍然比較困難，尤其是秈稻花藥培養(yǎng)力過低，獲得的再生植株群體較小，育種選擇受到較大的限制，對(duì)后續(xù)研究產(chǎn)生很大影響。因此，提高花藥培養(yǎng)效率，適當(dāng)擴(kuò)大花藥培養(yǎng)后代群體，對(duì)水稻花藥培養(yǎng)育種成敗至關(guān)重要[7]。提高水稻花培效率，有必要處理好整個(gè)過程的每一個(gè)環(huán)節(jié)，完善和優(yōu)化水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)體系。

2.1 基因型選擇基因型對(duì)水稻花藥培養(yǎng)力的影響最大。一般認(rèn)為，花藥培養(yǎng)力的大小為糯稻>粳稻>粳秈雜交稻>秈型雜交稻>秈稻，但同一類型的不同品種之間也存在較大差異[8]。秈稻花藥培養(yǎng)力一般偏低，平均愈傷誘導(dǎo)率只有0.5%，一般不會(huì)超過5%，有些材料甚至不能誘導(dǎo)出愈傷組織或者難以得到再生植株[9]；綠苗分化率僅有0.1%～1.0%，平均0.5%[2]。與秈稻相比，粳稻類型更容易被誘導(dǎo)，愈傷誘導(dǎo)率可以達(dá)到40%，一般也會(huì)超過10%[10]。苗立新等[11-12]的研究表明，不同水稻材料之間的花藥培養(yǎng)效率存在明顯差異，F(xiàn)1的花培效率通常會(huì)介于雙親之間而偏向母本。如果雙親的花培效率高，則F1的效率也會(huì)較高。通常，如果親本材料有花培效率高的粳稻血緣，F(xiàn)1的花培效率也會(huì)較高。因此，可以通過篩選基因型，積累花培效率較高的水稻材料，用粳稻品種作為橋梁親本，配制優(yōu)異的雜交組合來獲取較大量的花培后代群體。

2.2 取材與低溫預(yù)處理研究普遍表明，水稻花藥培養(yǎng)的最佳時(shí)期是單核靠邊期，過早或過晚取穗都會(huì)影響愈傷誘導(dǎo)率[13]。田間取材的最佳時(shí)間一般為晴天的8：00-10：00 或16：00-18：00，此時(shí)花粉發(fā)育正處于分裂盛期[14]。田間取穗時(shí)可通過某些器官的形態(tài)指標(biāo)來判斷花藥的發(fā)育時(shí)期。通常，幼穗苞大而不破，劍葉與倒二葉的葉枕距為8～13cm，多數(shù)穎殼已接近成熟大小呈現(xiàn)黃綠色，花絲長度為穎殼的1/3～1/2。但在不同類型的水稻材料中，這種形態(tài)指標(biāo)會(huì)有所變化。因此，在實(shí)際操作過程中，應(yīng)首先參考植株的形態(tài)指標(biāo)，然后通過鏡檢結(jié)果來確定花粉發(fā)育的確切時(shí)期，以大部分花粉處于單核靠邊期為宜。

取材后的低溫預(yù)處理可以明顯提高水稻花藥培養(yǎng)的愈傷誘導(dǎo)率。低溫處理的作用機(jī)制是延緩花粉的退化、維持花粉發(fā)育的生理環(huán)境、提高內(nèi)源性生長素水平并降低乙烯水平、啟動(dòng)雄核發(fā)育等[3]。方法是將幼穗的葉片剪去大部分留葉鞘，用75%的酒精棉球擦拭表面進(jìn)行消毒，然后用干凈的濕紗布包裹放入保鮮袋中，置于冰箱中冷藏。以往的研究表明，一般低溫8～10℃，預(yù)處理7～10d，培養(yǎng)效果比較好，最長不超過20d[4]。另外，不同材料低溫處理的最適溫度和最適時(shí)間也會(huì)略有不同[9]。

2.3 培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基分為誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基和愈傷分化培養(yǎng)基，這兩種培養(yǎng)基的組成及配比十分重要，直接影響花藥培養(yǎng)力。培養(yǎng)基中基本培養(yǎng)基、激素、碳源和有機(jī)附加物等各種組分相互作用相互影響，目前，還很難找到一種可以適用于各種類型水稻材料的萬能培養(yǎng)基。

2.3.1 基本培養(yǎng)基水稻花藥培養(yǎng)中應(yīng)用的基本培養(yǎng)基種類很多，如N6、馬鈴薯培養(yǎng)基、合5、SK3、通用、M8 和改良M8 等。用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)同一材料，會(huì)表現(xiàn)出不同的花培效果。通過大量實(shí)驗(yàn)及比較分析，在誘導(dǎo)愈傷階段，N6 培養(yǎng)基適用于粳稻[15]、合5 適用于秈稻[16]、SK3 適用于秈粳雜交[17]、通用和M8 對(duì)秈稻和粳稻均較適用[18]；在愈傷分化階段，不論秈稻或粳稻，MS 培養(yǎng)基均比較適用。在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)該根據(jù)不同類型的水稻材料，適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基的各種組分及配比，以獲得最佳培養(yǎng)效果。

2.3.2 激素配比培養(yǎng)基中外源激素的種類及比例在水稻花藥培養(yǎng)過程中起著至關(guān)重要的作用，合理調(diào)節(jié)KT、2，4-D、NAA 和6-BA 等激素的用量和比例可以提高水稻花藥培養(yǎng)的效率。通常，在誘導(dǎo)愈傷階段以生長素類為主，一般用2，4-D、NAA等，其中2，4-D 是誘導(dǎo)愈傷組織最有效的物質(zhì)；愈傷分化階段以細(xì)胞分裂素類為主，一般用6-BA、KT 等。研究表明，使用復(fù)合激素較使用單一激素效果更好，不同材料的最適激素種類及比例有很大差異[4]。郭書巧等[19]以3 個(gè)秈粳雜交組合F1和粳稻品種武運(yùn)粳8 號(hào)為試驗(yàn)材料，結(jié)果表明2.0mg/L 2，4-D+1.0mg/L NAA+0.2mg/L KT 為最佳的激素誘導(dǎo)配比，2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L KT 具有更好的分化效果。向發(fā)云等[20]以5 個(gè)秈稻雜交組合F1的花藥為材料，發(fā)現(xiàn)2.0mg/L 2，4-D+3.0mg/L NAA+1.0mg/L KT 誘導(dǎo)愈傷效果較好，2.0mg/L KT+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA 分化效果較好。張艷敏等[21]以3 個(gè)粳稻品種為材料，研究表明誘導(dǎo)愈傷組織的最佳組合為2.0mg/L 2，4-D+0.5mg/L NAA+1.0mg/L KT。

2.3.3 碳源早期研究人員通常用蔗糖作為水稻花藥培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)碳源，適宜濃度為3%～6%[4]。隨后研究表明，在水稻尤其是秈稻的花藥培養(yǎng)中，麥芽糖作為碳源誘導(dǎo)愈傷效果要優(yōu)于蔗糖，并且誘導(dǎo)出的愈傷組織具有更好的分化效果[13，22]。朱永生等[23]的研究也得出相似結(jié)論，并證明混合使用蔗糖和麥芽糖（3%蔗糖+3%麥芽糖）有更好的花培效果。使用混合碳源比使用單一碳源的效果要好，原因可能是混合碳源在誘導(dǎo)愈傷過程中滿足了不同發(fā)育階段糖類代謝的不同需求[9]。

2.3.4 其他成分培養(yǎng)基中其他成分的添加也會(huì)影響愈傷誘導(dǎo)及分化。研究表明，在培養(yǎng)基中添加天然活性物質(zhì)如馬鈴薯提取液、椰子汁、玉米汁、絲瓜傷流液等和有機(jī)添加物如山梨醇、水解酪蛋白、酵母汁、脯氨酸等，對(duì)提高秈稻綠苗產(chǎn)出率有較為明顯的效果[24]?；钚蕴渴浅Ｓ玫奶砑觿?，丁元豐等[25]研究表明活性炭可以顯著增加水稻組合的苗高、根長、根數(shù)和鮮重，有利于花培苗的生長與分化。在秈稻誘導(dǎo)愈傷階段是否添加脯氨酸存在爭議，大多數(shù)人認(rèn)為添加適當(dāng)濃度的脯氨酸后，可以提高秈稻的愈傷組織誘導(dǎo)率[26]。

2.4 接種與培養(yǎng)用75%的酒精將稻穗表面消毒，然后剝除苞葉，將合適的帶枝小穗在新配制的10%次氯酸鈉溶液中浸泡10～20min，期間不時(shí)振蕩攪拌，然后用無菌水沖洗4～5 次，用無菌濾紙吸干水后，用“剪穎抖藥法”在無菌條件下把花藥接種到誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上，每皿接種200～300 枚花藥。在26～28℃的黑暗條件下培養(yǎng)，接種30～60d 內(nèi)統(tǒng)計(jì)愈傷組織塊數(shù)。

將已長出的2～3mm、淡黃緊湊的新鮮愈傷轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中進(jìn)行光照培養(yǎng)，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為1000～l500Lx，光照時(shí)間為10～12h/d，室溫保持在26～28℃，分化培養(yǎng)45d 內(nèi)統(tǒng)計(jì)綠苗叢數(shù)和白苗叢數(shù)。計(jì)算愈傷誘導(dǎo)率、綠苗分化率、白苗分化率、分化率以及綠苗產(chǎn)率，以確定培養(yǎng)材料花藥培養(yǎng)力的大小。計(jì)算公式如下。

2.5 壯苗與煉苗當(dāng)幼苗長至2～3cm 高時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中壯苗。培養(yǎng)約7d 后幼苗根長達(dá)1.5～2.5cm，打開瓶蓋煉苗3d，然后清洗根部培養(yǎng)基，將較老葉、黃根剪去，用清水繼續(xù)養(yǎng)苗3～5d 后，移栽到大田進(jìn)行常規(guī)管理。

3 水稻花藥培養(yǎng)存在的問題

水稻花藥培養(yǎng)是以系統(tǒng)選育與雜交育種為基礎(chǔ)，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展起來的一項(xiàng)育種新技術(shù)。與分子標(biāo)記輔助選擇、轉(zhuǎn)基因等其他分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，可以培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗、廣適的優(yōu)良新品種，但目前影響水稻花培效率的遺傳機(jī)理尚不清楚，在實(shí)踐中仍然存在許多技術(shù)困難。

水稻花藥培養(yǎng)整個(gè)過程步驟繁瑣、周期長、工作量大，并且綠苗產(chǎn)率不高，尤其是秈稻更低，有些材料甚至不能誘導(dǎo)出愈傷組織或者難以得到再生植株，從而阻礙了花藥培養(yǎng)技術(shù)在秈稻育種上的應(yīng)用。一般認(rèn)為，綠苗產(chǎn)率受基因型影響最大。目前，常用的方法是從綜合性狀優(yōu)良的水稻材料中，篩選出綠苗產(chǎn)率高的材料，再配制優(yōu)異的雜交組合進(jìn)行培養(yǎng)來獲取較大量的花培后代群體。

在花藥培養(yǎng)過程中，由于取材時(shí)期、培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件等因素的影響，往往會(huì)存在花藥褐化和白化苗的問題。在誘導(dǎo)愈傷早期花藥常常會(huì)褐化，小孢子由于得不到充足的營養(yǎng)而退化，從而影響愈傷組織的誘導(dǎo)形成。為減少褐化，除了取材時(shí)要選擇大部分花藥處于單核靠邊期的幼穗外，還應(yīng)注意適宜的光照強(qiáng)度、光照時(shí)間和培養(yǎng)溫度。在綠苗分化階段，通常還會(huì)產(chǎn)生大量的白化苗。已有不少報(bào)道表明，花藥的生長狀態(tài)和培養(yǎng)條件均可以影響白化苗分化率。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，適當(dāng)降低培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度和錳的含量，適量調(diào)整2，4-D 或者KT的激素配比[27]，既能提高愈傷誘導(dǎo)率，同時(shí)又能降低白苗分化率。在愈傷誘導(dǎo)和分化階段，在不影響正常生長和分化的前提下降低溫度，減少光照也可以降低白苗分化率。

4 水稻花藥培養(yǎng)的展望

目前，大部分水稻的綠苗產(chǎn)率仍然很低，尤其是秈稻，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足育種需要。提高水稻花藥培養(yǎng)效率，不僅要選擇綜合性狀優(yōu)良、花藥培養(yǎng)力高的水稻材料，還要完善和優(yōu)化水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)體系。供體材料確定后，應(yīng)在田間取材的最佳時(shí)間選取大部分花粉處于單核靠邊期的幼穗，為后期的花培過程奠定良好的基礎(chǔ)。在低溫預(yù)處理過程中，一般情況下8～10℃低溫預(yù)處理7～10d。誘導(dǎo)愈傷和綠苗分化階段，除了根據(jù)不同類型的水稻材料選擇合適的基本培養(yǎng)基、最適激素種類及配比、復(fù)合碳源和其他成分外，還應(yīng)注意合適的光溫條件，這對(duì)花藥培養(yǎng)效率有明顯的影響?？傊?，不同材料的適宜培養(yǎng)條件各不相同，所以要在實(shí)際工作中不斷摸索，尋找某種或某類材料的最佳培養(yǎng)條件。此外，在獲得幼苗后，注意移栽前要煉苗，移栽后加強(qiáng)田間管理，以提高成苗率。

基于目前水稻花藥培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀和存在問題，在今后的工作中，應(yīng)該完善和優(yōu)化水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)體系，在保證花培效率的同時(shí)，盡量使花藥培養(yǎng)流程標(biāo)準(zhǔn)化、簡單化、快速化。此外，還要拓寬水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)在水稻育種工作中的應(yīng)用，它不僅可以快速純合有益基因，應(yīng)用于傳統(tǒng)育種工作中，而且可以與分子標(biāo)記輔助選擇、基因工程等其他分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，加速優(yōu)良新品種的選育與應(yīng)用。