脫鈣率對(duì)同種異體骨理化性能的影響*

陳書香 張梅 楊潔 孫雪蓮 胡榮榮 史豐田*

關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨，是特殊的結(jié)締組織，主要由蛋白多糖凝膠及Ⅱ型膠原構(gòu)成[1]。它在關(guān)節(jié)部位起著緩沖應(yīng)力、吸收震蕩、潤(rùn)滑關(guān)節(jié)表面、防止磨損的重要作用。關(guān)節(jié)軟骨是無(wú)血管組織，沒有血液供應(yīng)，營(yíng)養(yǎng)來(lái)源于周圍關(guān)節(jié)滑液的滋潤(rùn)，一旦損傷就很難再生，故軟骨修復(fù)成為骨科醫(yī)生最具挑戰(zhàn)性的臨床難題之一[2]。

同種異體骨無(wú)論是形態(tài)學(xué)還是力學(xué)特征都具有合成材料無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。但由于其硬度大，植入軟骨處會(huì)對(duì)正常軟骨造成磨損，故不適于軟骨缺損的修復(fù)。脫鈣骨基質(zhì)具有和同種異體骨最接近的三維結(jié)構(gòu)[3]，主要成分為Ⅰ型膠原，適于細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)。脫鈣處理可以讓同種異體骨富有彈性、柔韌性，但脫鈣過(guò)度會(huì)使其力學(xué)性能變差，甚至破壞其三維結(jié)構(gòu)。脫鈣骨基質(zhì)作為一種天然的支架材料，已有很多文獻(xiàn)報(bào)道其生物相容性[4-6]，但是對(duì)其理化性能的研究較少，因此本文主要研究脫鈣率對(duì)支架物理性能的影響，為優(yōu)選軟骨組織工程支架材料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

同種骨植入材料（型號(hào):皮松質(zhì)骨塊，上海亞鵬生物技術(shù)有限公司），該產(chǎn)品已經(jīng)過(guò)脫脂、脫細(xì)胞、病毒滅活、去除免疫原、清洗、輻照滅菌等處理，盡量選用皮質(zhì)骨與松質(zhì)骨厚度差別不大的樣品;依地酸二鈉（南京化學(xué)試劑股份有限公司）;PBS緩沖溶液（pH=7.2，自制）；原子吸收分光光度計(jì)（TAS-990，北京市普析通用儀器有限責(zé)任公司）;單筒視頻顯微鏡（LHZ-45，重慶留輝科技有限公司）;智能孔隙率、吸水率分析儀[MAY-Entris120，秒準(zhǔn)科技（深圳）有限公司]；萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)[CMT6104，美特斯工業(yè)系統(tǒng)（中國(guó)）有限公司]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脫鈣液制備選用依地酸二鈉作為脫鈣劑，1 LPBS緩沖溶液（pH=7.2）中加入100 g依地酸二鈉，待完全溶解后，放置備用。

1.2.2 脫鈣處理

將骨塊浸泡于脫鈣液中。每天更換脫鈣液，檢測(cè)換下的脫鈣液中的鈣離子濃度，由脫鈣液中的鈣離子含量以及同種異體骨鈣含量，推算脫鈣率，待脫鈣率達(dá)到30%、50%、70%、80%、99.9%時(shí)取出骨塊，檢測(cè)產(chǎn)品的孔徑、孔隙率、吸水率、力學(xué)性能、降解率。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 同種異體骨鈣含量檢測(cè)

取1 g同種異體骨按照GB/T 14233.1—2008中7.3.1.1濕消解法制備檢測(cè)液，用原子吸收分光光度計(jì)檢測(cè)鈣離子含量，所用火焰為空氣—乙炔焰。配制一系列已知濃度的鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，以去離子水做空白對(duì)照，依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。試樣經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理后，在完全相同條件下測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線換算出被測(cè)溶液鈣離子濃度。儀器參數(shù)如下:波長(zhǎng)422.7 nm;光譜帶寬0.4 nm;推薦燈電流3.0 mA，負(fù)高壓295 V;燃燒頭高度10 mm;積分時(shí)間3 s;空氣壓力及流量分別為0.25 MPa，5 500 mL/min;乙炔壓力及流量分別為0.10 MPa，5 000 mL/min。

1.3.2 脫鈣液鈣含量檢測(cè)

取換下的脫鈣液，稀釋至合適的倍數(shù)，使?jié)舛嚷湓跇?biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)，用原子吸收分光光度計(jì)檢測(cè)鈣離子濃度。

1.3.3 孔徑取待測(cè)的骨塊，用手術(shù)刀切成薄片，放于顯微鏡下檢測(cè)完整孔徑尺寸。每個(gè)觀察界面測(cè)量6次，取平均值。

1.3.4 孔隙率、吸水率

取待測(cè)的骨塊，用智能孔隙率、吸水率分析儀檢測(cè)，記錄結(jié)果。

1.3.5 彈性模量

取待測(cè)骨塊，修剪成10 mm×10 mm×10 mm的小塊，充分浸泡后，擦去表面水分，放于檢測(cè)臺(tái)上;用50 N壓力探頭進(jìn)行壓縮實(shí)驗(yàn)，壓縮速率為1 mm/min，應(yīng)變量達(dá)到50%時(shí)停止實(shí)驗(yàn)，獲取應(yīng)力—應(yīng)變曲線，依據(jù)該曲線的直線區(qū)計(jì)算彈性模量。

1.3.6 降解率

取6塊產(chǎn)品稱重后分別置于試管中，加適量人工降解液（0.1 mol/L PBS），置于37℃烘箱中降解。分別于2、4、6、8、10和12周取樣，室溫干燥，測(cè)質(zhì)量，取平均值并計(jì)算質(zhì)量損失率。換等量生理降解液繼續(xù)降解。計(jì)算出骨塊在各個(gè)時(shí)間段（每個(gè)時(shí)間段為2周）的降解率并繪制出降解率曲線，見公式（1）。

降解率P（%）=[（A0-A1）/A0]×100 （1）P:降解率;A0:降解前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)量平均值;A1:降解后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)量平均值。

2 結(jié)果

2.1 鈣含量

由實(shí)驗(yàn)可知，通常人骨鈣含量在26%左右[7]。隨著脫鈣液的持續(xù)更換，骨塊的鈣含量逐漸降低，通過(guò)脫鈣液中鈣含量計(jì)算的脫鈣率與骨塊實(shí)際鈣含量具有較高的一致性。隨著鈣離子的流失，骨塊的孔徑明顯增大，相應(yīng)壓縮模量迅速降低，相關(guān)數(shù)據(jù)見表1。

2.2 孔徑

未脫鈣的同種異體骨很硬，顯微鏡下觀察其骨片透明度差、質(zhì)白，松質(zhì)骨部分具有粗糙、疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小不等，形狀不規(guī)則，孔隙直徑為200～400 m，平均為353 m（見圖1、表1）。隨著脫鈣率的增大，骨塊透明度增加，脫鈣率為50%時(shí)即成明顯的透明狀，平均孔徑614 m。脫鈣率為70%～99.9%的脫鈣骨基質(zhì)呈海綿狀，富有彈性和一定的韌度，平均孔徑為650～1 000 m。

圖1 不同脫鈣率下的顯微鏡圖

表1 不同脫鈣率下的鈣含量、孔徑、壓縮模量

2.3 孔隙率、吸水率

由表1可知，隨著脫鈣率的增加，同種異體骨塊的孔隙率和吸水率均明顯增大，分別由未脫鈣時(shí)的40.39%和61.28%增加到脫鈣率為99.9%時(shí)的85.23%和610.74%。脫鈣率為70%之前，孔隙率的增長(zhǎng)較為迅速，此后趨緩。吸水率的變化趨勢(shì)則相反。

2.4 壓縮模量

對(duì)未脫鈣原材料的力學(xué)分析表明，其抗壓力可達(dá)450 N以上，壓縮模量大，可達(dá)5.70 MPa，在壓縮過(guò)程中發(fā)生多次脆性斷裂（見圖2）。隨著脫鈣率的增加，樣品的壓縮模量迅速下降，抗壓力降至不足5 N，并且不再發(fā)生脆性斷裂。脫鈣率80%以上的脫鈣骨彈性極好，壓縮后可快速恢復(fù)。脫鈣率99.9%的骨塊已不再表現(xiàn)出能夠承受特定壓力的能力。不同脫鈣率下同種異體骨塊的壓縮模量見表1。

圖2 不同脫鈣率下同種異體骨的應(yīng)力—應(yīng)變圖

2.5 降解率

隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)論脫鈣程度如何，同種異體骨塊均發(fā)生明顯的降解反應(yīng)，且脫鈣率越高，降解速度越快。前4周降解速率較慢，此后逐漸加速，6周后降解速度明顯加快，當(dāng)?shù)?2周時(shí)99.9%脫鈣率的骨基質(zhì)迅速裂解，降解率達(dá)85%以上（見圖3）。

圖3 不同脫鈣率下的降解率

3 討論

同種異體骨作為一種自然生物支架材料，因其特有的結(jié)構(gòu)和富含多種生物活性因子，對(duì)軟骨組織缺損部位起到支撐和保護(hù)作用的同時(shí)可誘導(dǎo)缺損組織再生，故被廣泛應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨損傷再生修復(fù)的研究中[8]。

由于新鮮同種異體骨材料較難獲取，本研究選用市售產(chǎn)品為原材料，并在實(shí)驗(yàn)時(shí)作進(jìn)一步挑選，最大程度保證批次的均一性。所用同種異體骨由皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨兩部分組成，在植入關(guān)節(jié)軟骨缺損部位時(shí)，松質(zhì)骨在內(nèi)，皮質(zhì)骨在外。未脫鈣的同種異體骨雖富含膠原，但質(zhì)地堅(jiān)硬，與質(zhì)軟、滑潤(rùn)的關(guān)節(jié)軟骨組織不相匹配，因此必須對(duì)其作脫鈣處理。一方面，脫鈣可以解除同種異體骨中致密的礦物成分對(duì)骨形成蛋白（BMP）的包繞，使BMP能夠順利釋放，進(jìn)而與相關(guān)生長(zhǎng)因子協(xié)同作用，發(fā)揮誘導(dǎo)成骨潛能[9]。但脫鈣必須適度，因?yàn)檫m當(dāng)含量鈣離子的存在，可作為新生骨再鈣化的核心，為磷酸鈣的沉積提供晶核[10]。另一方面，脫鈣使同種異體骨中的膠原成分得以保留，同種異體骨塊的強(qiáng)度降低、韌性增加，從而與關(guān)節(jié)軟骨的匹配性增加。

此外，脫鈣導(dǎo)致同種異體骨的一系列物理性能發(fā)生了明顯改變，如孔徑、吸水率增加，壓縮模量下降等。骨組織工程支架材料的孔徑和孔隙率是三維多孔材料的兩個(gè)主要評(píng)價(jià)指標(biāo)[11]，孔徑影響成骨能力的主要原因是不同大小的孔徑在促進(jìn)成骨細(xì)胞沉積及黏附方面的能力不同，并且不同大小的孔徑材料的降解速度不同，從而影響新骨的形成和長(zhǎng)入[12]。

由于脫鈣對(duì)皮質(zhì)骨孔徑的影響較小，且松質(zhì)骨才是與軟骨下骨的接觸部位，故本研究重點(diǎn)關(guān)注松質(zhì)骨部分的性能變化。由表1可知，隨著脫鈣率的增大，骨塊的平均孔徑、孔隙率、吸水率均顯著增加。脫鈣率為50%時(shí)孔徑即可達(dá)600 m以上，原因是在脫鈣過(guò)程中，由于骨中的鈣元素不斷地被脫離下來(lái)，使骨小梁中的膠原膨脹拉伸而導(dǎo)致孔徑增大，這種結(jié)構(gòu)特征可提供寬大的空間，容納更大量的種子細(xì)胞，有利于細(xì)胞黏附、增殖，細(xì)胞外基質(zhì)沉淀，營(yíng)養(yǎng)的進(jìn)入以及代謝產(chǎn)物的排出[13]。同樣，隨著骨中鈣成分的流失，同種異體骨塊的表觀密度會(huì)變小，而孔隙率增大，脫鈣率達(dá)到70%以后，孔隙率增長(zhǎng)速度放緩，表明脫鈣并未明顯改變骨塊的三維多孔結(jié)構(gòu)，有利于此骨塊作為支架材料使用。相較而言，脫鈣率對(duì)吸水率的影響更為顯著，其主要原因是來(lái)自于鈣的流失[14]。

關(guān)節(jié)軟骨是關(guān)節(jié)部位的主要負(fù)重組織，表面軟骨能夠承受的局部壓力為0.8～2 MPa[15]，以成人髖關(guān)節(jié)為例，站立時(shí)軟骨接觸面的靜態(tài)壓力約為0.1 MPa，行走時(shí)增加到4 MPa，跳躍時(shí)可達(dá)10 MPa[16]。同時(shí)要具有一定的彈性，以滿足關(guān)節(jié)活動(dòng)時(shí)應(yīng)力傳導(dǎo)的需要[17]。

當(dāng)同種異體骨的鈣含量較高時(shí)，骨硬而脆，進(jìn)行壓縮模量檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，壓縮模量大、壓縮時(shí)易壓碎。隨著脫鈣率的增加，骨塊韌性逐漸增加、壓縮模量下降。脫鈣率大于80%時(shí)，同種異體骨干燥時(shí)質(zhì)地仍較硬，水溶液浸泡后，質(zhì)地柔軟，松質(zhì)骨部分類似海綿，壓縮初始形變大，并可承受一定的壓力（約4.2 N），且形變?cè)趬毫θコ罂煽焖倩謴?fù)。質(zhì)地柔軟的同種異體骨方便植入人體，并能有效減少對(duì)正常軟骨的磨損，故非常適合于關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)。

骨組織工程支架的降解速度主要由材料本身性質(zhì)和植入后局部的生理環(huán)境決定。在體內(nèi)的降解主要與破骨細(xì)胞、多核巨細(xì)胞的作用有關(guān)，同時(shí)也與局部的血運(yùn)供應(yīng)有關(guān)。新骨形成過(guò)程中，破骨細(xì)胞釋放出溶酶體酶等成分，分解支架材料，巨噬細(xì)胞則吞噬殘存碎片，從而使支架材料逐漸被降解、吸收。

前述已表明，脫鈣對(duì)同種異體骨材料本身性質(zhì)造成顯著改變，從而明顯改變了骨塊的降解性能。無(wú)論鈣含量如何，前4周降解速率較慢，此后逐漸加速，6周后降解速度明顯加快，表明材料本身的三維結(jié)構(gòu)在6周后被明顯破壞，10周時(shí)，80%脫鈣率的同種異體骨塊已降解近40%，10周時(shí)降解近80%，若在體內(nèi)有酶類物質(zhì)和細(xì)胞組織代謝物的作用的話，其降解速率勢(shì)必更快。而有研究表明軟骨形成需要6～8周[12]。因此，選擇合適的脫鈣率以保證恰當(dāng)?shù)慕到馑俾?，并與軟骨形成保持同步非常重要。

綜上所述，以同時(shí)包含皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的同種異體骨塊為原料，對(duì)不同脫鈣率下骨塊的理化性能進(jìn)行研究。結(jié)果表明，隨著脫鈣率的增加，骨塊的孔徑、孔隙率、吸水率、降解率均明顯增加，鈣的流失使同種異體骨的強(qiáng)度降低、韌性增加，與關(guān)節(jié)軟骨的匹配性增強(qiáng)。研究結(jié)果表明，在80%脫鈣率條件下，同種異體骨塊的性能最優(yōu)，在保證擁有合適的孔徑、孔隙率的前提下，還具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，其降解速率與成骨速率也相當(dāng)，是一種非常有前景的軟骨修復(fù)支架材料。