HPLC法測(cè)定消食平胃散中蒼術(shù)素的含量

陳曉林，林仙軍，王 彬，蔡文金

(浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 311101)

消食平胃散由檳榔、山楂、蒼術(shù)、陳皮、厚樸、甘草等按比例粉碎，過篩，混勻，即得，具有消食開胃的功能，畜禽養(yǎng)殖中主要用于寒濕困脾，胃腸積滯病癥的治療。該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版二部[1]中，標(biāo)準(zhǔn)僅采用薄層色譜法對(duì)蒼術(shù)進(jìn)行定性，未測(cè)定其蒼術(shù)素的含量。蒼術(shù)素是蒼術(shù)藥材中有效成分之一，具有促進(jìn)胃排空、抗炎、抗腫瘤、降血糖、利尿等藥理活性[2]，因其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版二部含量測(cè)定項(xiàng)把蒼術(shù)素作為質(zhì)量指標(biāo)[1]。高效液相色譜法具有快捷、準(zhǔn)確、靈敏度高的特點(diǎn)[3-4]，高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器法(HPLC-DAD)結(jié)合了光譜掃描和數(shù)據(jù)庫功能，定性定量更準(zhǔn)確[5]；目前，沒有查詢到消食平胃散中蒼術(shù)素含量測(cè)定的有關(guān)文獻(xiàn)。因此，為了完善該產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法，研究并建立高效液相色譜法測(cè)定有效成分有現(xiàn)實(shí)意義。

1 儀器與材料

1.1儀器 高效液相色譜儀，Agilent 1260，配Agilent 1260 Infinity G4212A型二極管陣列檢測(cè)器；AG-285電子天平(Mettler公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RO 10多點(diǎn)磁力攪拌器(AKA公司)。

1.2試劑與材料 甲醇為色譜純，乙醇為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為milli-Q超純水。蒼術(shù)素對(duì)照品為中國(guó)食品藥品檢定研究院產(chǎn)品，批號(hào)111924-201404，含量99.5%；消食平胃散，為海寧新元亨動(dòng)物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)為2018041403、2018042901和2018061901。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液配制

2.1.1對(duì)照品儲(chǔ)備液和溶液 稱取蒼術(shù)素對(duì)照品5.91 mg置100 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，為蒼術(shù)素對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取蒼術(shù)素儲(chǔ)備液，分別為0.1、0.2、0.4、1.0、2.0 mL，置10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2試品溶液 取批號(hào)為2018041403的消食平胃散備用。

2.1.2.1 提取時(shí)間 精密稱取供試品3份，每份2 g，置具塞錐形中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，分別超聲處理15、30、60和90 min，置冷后再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定，記錄蒼術(shù)素峰面積，計(jì)算其含量。

2.1.2.2 提取方法 精密稱取供試品3份，每份2 g，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量。分別采用加熱回流30 min、超聲提取30 min、磁力攪拌30 min這3種提取方式進(jìn)行提取，提取后放冷，并用甲醇補(bǔ)足重量、搖勻、濾過，取續(xù)濾液10 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定，記錄蒼術(shù)素峰面積，計(jì)算其含量。

2.1.2.3 提取溶媒 精密稱取供試品3份，每份2 g，置150 mL圓底燒瓶中，分別精密加入50 mL 50%甲醇、甲醇、75%乙醇、95%乙醇，加熱回流30 min，提取后放冷，并用甲醇補(bǔ)足重量、搖勻、濾過，取續(xù)濾液10 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定，記錄蒼術(shù)素峰面積，計(jì)算其含量。

2.1.3陰性對(duì)照溶液 按處方比例和制備工藝，制備不含蒼術(shù)藥材的陰性對(duì)照制劑，按照“2.1.2”制備方法制成空白溶液。

2.2測(cè)定色譜條件 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(Agilent Eclipse XDB-C18250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(79∶21，v∶v)進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min，在190～400 nm范圍進(jìn)行掃描，記錄340 nm色譜圖。蒼術(shù)素對(duì)照品溶液色譜圖(圖1)、蒼術(shù)素對(duì)照品溶液光譜圖(圖2)、蒼術(shù)素供試品溶液色譜圖(圖3)、蒼術(shù)素供試品溶液光譜圖(圖4)、陰性對(duì)照溶液色譜圖(圖5)。

圖1 蒼術(shù)素對(duì)照品溶液色譜圖

圖2 蒼術(shù)素對(duì)照品溶液光譜圖

圖3 蒼術(shù)素供試品溶液色譜圖

圖4 供試品溶液光譜圖

圖5 陰性對(duì)照溶液色譜圖

2.3線性關(guān)系 取“2.1.1”系列對(duì)照品溶液和儲(chǔ)備液各10 μL，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蒼術(shù)素在0.5880～58.80 μg/mL范圍內(nèi)線性良好, 線性回歸方程為Y=118.52008X+14.30905，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 99。

2.4精密度和穩(wěn)定性 精密度試驗(yàn)取批號(hào)為2018041403消食平胃散供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算蒼術(shù)素的含量，其含量RSD為0.2%；穩(wěn)定性試驗(yàn)取上述溶液，分別于0、2、4、6、12和24 h進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算蒼術(shù)素的含量，其含量RSD分別為0.3%。

2.5加樣回收率 取批號(hào)為2018041403的消食平胃散的樣品(0.30 mg/g)6份，每份1 g，精密稱定，分別加入蒼術(shù)素對(duì)照品溶液150 μL(濃度為1.10 mg/mL)，按照“2.1.2”方法制備供試品溶液，進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果扣除消食平胃散樣品原有組分的量，計(jì)算加樣回收率和RSD。蒼術(shù)素平均加樣回收率為97.6%，RSD為1.3%。

2.6耐用性 在選定的色譜條件下，比較了Waters XSelect CSH C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Aglient Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，結(jié)果表明兩者均可使蒼術(shù)素與各雜質(zhì)分離良好；對(duì)溫度進(jìn)行了考察，在本文選定的流動(dòng)相設(shè)定溫度為25 ℃和35 ℃時(shí)，除出峰時(shí)間發(fā)生微小變化外，其余變化很?。粚⒘鲃?dòng)相中甲醇與水的比例調(diào)整為75∶25和83∶17進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明，流動(dòng)相比例的微調(diào)也僅能影響出峰時(shí)間，對(duì)峰形和理論塔板數(shù)影響甚小。綜上，不同品牌的色譜柱、不同流動(dòng)相有機(jī)相與水相比例以及不同溫度，均能滿足試驗(yàn)需要，方法耐用性較強(qiáng)。

2.7實(shí)際樣品測(cè)定 取批號(hào)為2018041403、2018042901和2018061901的消食平胃散，每一批做3個(gè)平行，依法測(cè)定蒼術(shù)素的含量。

3 討論與分析

3.1供試品溶液制備方法

3.1.1提取時(shí)間 由表1可見，提取30 min蒼術(shù)素已經(jīng)基本提取完全，增加提取時(shí)間蒼術(shù)素含量變化不明顯，故選擇超聲處理時(shí)間為30 min。

表1 提取時(shí)間的考察結(jié)果

3.1.2提取方法 由表2可見，采用加熱回流提取法進(jìn)行提取得到的蒼術(shù)素含量較高，故該試驗(yàn)供試品溶液的制備方法確定為加熱回流提取法。

表2 提取方法的考察結(jié)果

3.1.3提取溶媒 由表3可見，采用甲醇提取蒼術(shù)素含量最高，故選擇甲醇作為提取溶媒。

表3 提取溶媒的考察結(jié)果

3.2檢測(cè)波長(zhǎng) 本試驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器對(duì)蒼術(shù)素樣品溶液在190～400 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蒼術(shù)素在336 nm波長(zhǎng)有最大吸收，參考《中國(guó)獸藥典》2015年版二部蒼術(shù)藥材中蒼術(shù)素的測(cè)定方法，選擇340 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3含量測(cè)定 由表4可見，不同批號(hào)消食平胃散中蒼術(shù)素的含量差別不大。

表4 消食平胃散中蒼術(shù)素含量測(cè)定

3.5結(jié)論 本文采用HPLC法對(duì)消食平胃散中蒼術(shù)素的含量進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)提取時(shí)間、提取方式和提取溶劑等條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明該方法定性定量準(zhǔn)確，得到了滿意的結(jié)果，為消食平胃散質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)。