培元固腎方含藥血清對已轉染HBV質粒的HK-2細胞中 TGF-β1、α-SMA、E-cadherin蛋白的影響*

劉 蓉，王耀光

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬太倉醫(yī)院，太倉 215400；2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300381）

乙型肝炎病毒（HBV）相關性腎炎（HBV-GN），是指HBV侵襲人體后，由HBV直接或間接誘發(fā)的腎小球腎炎，經(jīng)血清免疫學及腎活檢免疫熒光所證實，并排除其他繼發(fā)性腎小球腎炎的一種腎炎綜合征[1]。

HBV-GN于20世紀70年代由Combes等首次報道[2]。該病具有遷延性、多樣性、不典型性等特點，是中國較常見的繼發(fā)性腎臟病。HBV-GN的病理類型多種多樣，最常見的是乙型肝炎病毒相關性膜性腎?。℉BV-MN）[3]。目前關于HBV-GN的研究，其發(fā)病原因仍不甚明確。經(jīng)研究證實，腎間質纖維化幾乎是所有慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎臟病的共同病理過程[4-5]，是導致腎功能進行性衰竭的關鍵因素[6]。中國是慢性乙型肝炎大國，近年來HBVGN的檢出率也逐年上升，進入終末期腎病患者也不斷增長，因此，探討HBV-GN腎間質纖維化的機制、尋求有效的預防及治療方法，是延緩HBV-GN患者進入終末期腎臟病的重要措施。

“培元固腎方”是王耀光教授根據(jù)HBV-GN潛在病機及臨床經(jīng)驗自擬的經(jīng)驗方，具有培補脾腎、祛風搜絡、疏肝養(yǎng)血、活血祛瘀的作用。本實驗通過培元固腎方含藥血清對已轉染HBV質粒的人腎皮質近曲小管上皮細胞（HK-2細胞）模型的干預，探討其對延緩HBV-GN腎間質纖維化的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 本實驗所用的HK-2細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 質粒 本實驗質粒為C基因型重組乙型肝炎病毒質粒（pHY106-HBV）及pHY106真核表達載體（不含重組HBV空載質粒），由北京地壇醫(yī)院劉順愛教授惠贈。

1.3 主要儀器及試劑 生物安全柜（Haier HR40-ⅡA2）；CO2培養(yǎng)箱（SANYO MCO-15AC）；旋轉蒸發(fā)儀（Seastar公司）；倒置顯微鏡（UOP DSY2000）；酶標儀（Thermo公司）；4℃離心機（Eppendorf公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，北京中杉金橋公司）；胎牛血清（CellGro）；質粒提取試劑盒、Trans-5感受態(tài)大腸桿菌（購自天根）；Lipofectamine 2000（Invitrogen）；Opti-MEM、DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco）；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、E-cadherin抗體（Abcam公司）。

2 實驗方法

2.1 轉染方法 通過脂質體轉染法建立HBV轉染HK-2細胞的模型，將pHY106-HBV轉染至體外培養(yǎng)的正常HK-2細胞，方法參考濟南大學王義國教授團隊的研究[7]。

2.2 實驗藥物制備 培元固腎方：生黃芪30 g，炒白術 20 g，地龍 10 g，蟬蛻 6 g，防風 10 g，金櫻子20 g，芡實 10 g，鬼箭羽 10 g，丹參 15 g，覆盆子 10 g，澤蘭20 g，槐花15 g，購于天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院國藥堂，批號為2018002。于天津藥物研究院加工煎煮、過濾后，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至生藥含量為6.864 g/mL。裝入離心管中密封，保存于4℃冰箱備用。鹽酸貝那普利片（洛汀新）用制備為1 mg/mL的混懸液，保存于4℃冰箱備用。

2.3 分組標記 實驗使用成年雄性C57BL/6小鼠，共75只，體質量20～25 g之間，于中國科學院放射研究所屏障環(huán)境中適應性飼養(yǎng)7 d，觀察實驗小鼠一般生理狀況，一般生理狀況良好，隨機分為5組：空白對照組、貝那普利組、培元固腎方低劑量組、培元固腎方中劑量組、培元固腎方高劑量組，每組15只。

2.4 給藥劑量及方法 1）小鼠的灌胃劑量為：0.02 mL/g，即每只0.4 mL。2）空白對照組：給予等劑量生理鹽水。3）貝那普利組：鹽酸貝那普利混懸液制成含生藥濃度為0.065 mg/mL的藥液。4）培元固腎方低劑量組：制備生藥濃度為1.144 g/mL的藥物。5）培元固腎方中劑量組：制備生藥濃度為2.288 g/mL的藥物。6）培元固腎方高劑量組：制備生藥濃度為4.576 g/mL的藥物。

2.5 含藥血清制備 于每日上午給藥，以每只0.4mL劑量灌胃，1次/日，連續(xù)灌胃7 d。于第6天晚上禁食，第7天給藥后1～2 h內(nèi)經(jīng)摘眼球采血（動、靜脈混合血），收集于離心管。室溫靜置1 h，3 000 r/min離心15 min，分離血清，56℃滅活處理，0.22 μm濾膜過濾除菌，最后于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3 實驗分組及給藥方法

實驗共分為7組：1）Mock組：空白對照組，HK-2細胞完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。2）Control組：轉染空質粒PHY106的HK-2細胞，生理鹽水含藥血清干預。3）HBV組：轉染PHY106-HBV質粒的HK-2細胞，生理鹽水含藥血清干預。4）HBV+ACEI組：轉染HBV質粒的HK-2細胞，貝那普利含藥血清干預。5）HBV+PYGS Low組：轉染HBV質粒的HK-2細胞，培元固腎方低劑量含藥血清干預。6）HBV+PYGS Middle組：轉染HBV質粒的HK-2細胞，培元固腎方中劑量含藥血清干預。7）HBV+PYGS High組：轉染HBV質粒的HK-2細胞，培元固腎方高劑量含藥血清干預。各組轉染6 h后予以藥物干預48 h，進行下一步實驗。

4 統(tǒng)計方法

應用SPSS 20.0及GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計及作圖。計量資料服從正態(tài)分布，用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較，采用單因素方差分析，組間兩兩比較進行LSD檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

5 結果

5.1 各組HK-2細胞形態(tài)的變化 藥物干預HK-2細胞48 h后，將各組細胞置于倒置顯微鏡下，觀察各組細胞的形態(tài)變化。Mock組、Control組細胞為上皮細胞形態(tài)，圓形或者橢圓形，鋪路樣生長，兩組細胞形態(tài)無明顯差異；HBV組細胞變大，變長，細胞大小形態(tài)不等，主要呈梭形，也可見多角形；西藥組（貝那普利組）細胞形態(tài)為圓形或橢圓形，鋪路樣生長；中藥低劑量和中劑量組細胞形態(tài)比HBV組細胞形態(tài)好轉，但仍有不同程度的細胞變形，變長，變?yōu)樗笮?；中藥高劑量組細胞為圓形或橢圓形，呈鋪路樣生長，細胞形態(tài)更接近上皮細胞，明顯好轉于HBV組，也好轉于中藥低劑量和中劑量組，但與西藥組比較差異不明顯。見圖1。

5.2 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒 e抗原（HBeAg）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）的表達

5.2.1 ELISA法檢測各組 HBsAg、HBeAg的表達 應用ELISA法檢測各組細胞裂解液中HBsAg的表達濃度情況，與Mock組比較，Control組無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與 Control組比較，HBV組HBsAg表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與 HBV 組比較，HBV+ACEI組、HBV+PYGS High組HBsAg表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），HBV+PYGS Low 組 和 HBV+PYGS Middle組HBsAg表達有所下調(diào)，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與 HBV+ACEI組比較，培元固腎方各組HBsAg表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；培元固腎方各組間比較，HBsAg表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 ELISA 法檢測 HBsAg、HBeAg的表達結果（±s）Tab 1.ELISA detection of HBsAg and HBeAg expression results（±s）

表1 ELISA 法檢測 HBsAg、HBeAg的表達結果（±s）Tab 1.ELISA detection of HBsAg and HBeAg expression results（±s）

注：與 Control組比較，*P＜0.001；與 HBV 組比較，#P＜0.05。

組別 HBeAg（OD value）Mock 組 1.154±0.165 Control組 1.318±0.380 HBV 組 6.218±0.830*HBV+ACEI 5.003±1.388 HBV+PYGS Low 組 4.147±1.003#HBV+PYGS Middle組 4.457±0.742#HBV+PYGS High 組 4.371±1.315#n 3 3 3 3 3 3 3 HBsAg（OD value）1.447±0.237 1.573±0.518 3.934±0.680*2.702±0.799#3.060±0.598 3.022±0.601 2.639±0.641#

應用ELISA法檢測各組HBeAg的表達濃度情況，與Mock組比較，Control組無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與 Control組比較，HBV 組HBeAg表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與HBV組比較，HBV+ACEI組HBeAg表達下調(diào)，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），HBV+PYGS Low組、HBV+PYGS Middle組、HBV+PYGS High組HBeAg表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與HBV+ACEI組比較，HBV+PYGSLow 組、HBV+PYGSMiddle組、HBV+PYGS High組HBeAg表達相對較低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；培元固腎方各組間比較，HBeAg表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 1。

5.2.2 ELISA法檢測各組TGF-β1的表達 應用ELISA法檢測各組細胞裂解液中TGF-β1的表達濃情況，與Mock組比較，Control組TGF-β1表達相近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與 Control組比較，HBV組TGF-β1表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與 HBV 組比較，HBV+ACEI組、HBV+PYGS Low組、HBV+PYGS Middle組、HBV+PYGS High組TGF-β表達均有下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與 HBV+ACEI組比較，HBV+PYGS Low 組TGF-β1的表達相對較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），HBV+PYGS Middle組 TGF-β1 的表達相對較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），HBV+PYGS High組TGF-β1的下調(diào)程度相近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；培元固腎方各組組間比較，與HBV+PYGS High組比較，HBV+PYGS Low 組TGF-β1表達相對較多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），HBV+PYGS Middle組TGF-β1的表達相對較多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），HBV+PYGS Low組與HBV+PYGS Middle組比較，TGF-β1的表達相對較多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

5.3 免疫細胞化學法檢測α-SMA、E-cadherin的表達

5.3.1 α-SMA蛋白的表達結果 免疫細胞化學法檢測α-SMA蛋白表達情況，與Mock組比較，Control組無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Control組比較，HBV組α-SMA蛋白表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與HBV組比較，HBV+ACEI組、HBV+PYGS Low 組、HBV+PYGS Middle組、HBV+PYGS High組α-SMA蛋白表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與HBV+ACEI組比較，培元固腎方低、中、高劑量組α-SMA蛋白表達均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；培元固腎方各組組間比較，α-SMA蛋白表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。HBV組較Mock組和Control組比較，細胞胞質呈棕黃色；與HBV組比較，各治療組細胞胞質棕黃色顆粒均有不同程度的減少，且減少明顯，見圖2。

表2 ELISA法檢測TGF-β1的表達結果（±s）Tab.2 ELISA detection of TGF-β1 expression results（±s）

表2 ELISA法檢測TGF-β1的表達結果（±s）Tab.2 ELISA detection of TGF-β1 expression results（±s）

注：與 Control組比較，*P＜0.001；與 HBV 組比較，#P＜0.001；與HBV+ACEI組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.001；與 HBV+PYGS High 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.001；與 HBV+PYGS Low 組比較，▲P＜0.05。

組別Mock組Control組HBV組HBV+ACEI組HBV+PYGS Low組HBV+PYGS Middle組HBV+PYGS High組n 3 3 3 3 3 3 3 TGF-β1（ng/mL）2.144±0.180 1.663±0.711 10.606±0.764*3.517±0.643#6.257±0.469#☆☆△△5.027±0.080#☆△▲4.068±0.219#

5.3.2 E-Cadherin蛋白的表達結果 免疫細胞化學法檢測E-cadherin蛋白的表達：與Mock組比較，Control組無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Control組比較，HBV組E-Cadherin蛋白表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與HBV組比較，HBV+ACEI組E-Cadherin蛋白表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），HBV+PYGS Low 組、HBV+PYGS Middle組和HBV+PYGS High組E-Cadherin蛋白表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與HBV+ACEI組比較，HBV+PYGS Low組表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；培元固腎方各組組間比較，與HBV+PYGS Low組比較，HBV+PYGS Middle組和HBV+PYGS High組E-Cadherin蛋白表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。HBV組較Mock組和Control組比較，細胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒減少，E-Cadherin蛋白表達明顯降低，其余治療組較HBV組比較，胞漿內(nèi)棕黃色顆粒均有不同程度的增多，E-Cadherin蛋白表達明顯增多，尤其是HBV+PYGS Low組，見圖3。

表3 各組細胞α-SMA和E-cadherin蛋白平均吸光值（±s）Tab.3 Mean absorbance value of α-SMA and E-cadherin protein in each group（±s）

表3 各組細胞α-SMA和E-cadherin蛋白平均吸光值（±s）Tab.3 Mean absorbance value of α-SMA and E-cadherin protein in each group（±s）

注：與 Control組比較，*P＜0.001；與 HBV 組比較，#P＜0.05，##P＜0.001；與 HBV+ACEI組比較，△P＜0.05；與 HBV+PYGS Low 組比較，△△P＜0.05。

組別Mock組Control組HBV組HBV+ACEI組HBV+PYGS Low組HBV+PYGS Middle組HBV+PYGS High組n 3 3 3 3 3 3 3 α-SMA 1.046±0.108 1.156±0.088 1.632±0.054*0.808±0.056##0.767±0.068##0.696±0.059##0.777±0.056##E-cadherin 1.178±0.242 1.233±0.046 0.565±0.075*0.927±0.137#1.267±0.010##△1.030±0.013##△△1.007±0.077##△△

6 討論

HBV-GN根據(jù)其臨床癥狀，可歸屬于中醫(yī)的“尿濁”“水腫”“瘀血 ”“ 郁 證”“ 腎風 ”“黃 疸 ”“ 虛勞 ”等范疇。王耀光教授認為本病屬本虛標實之證，本虛與標實共存，本為體虛，肝脾腎虧虛，標為邪實，濕熱痰濁瘀血毒邪等。王耀光教授在治療HBV-GN腎間質纖維化時，尤重視脾腎兩臟，以其本虛為主要矛盾，呂仁和教授[8]亦認為腎間質纖維化的根本原因是正氣虧虛，氣血不足。故王耀光教授基于培補脾腎、祛風活血、肝腎同治的治療原則，自擬“培元固腎方”，藥物組成為：生黃芪、炒白術、地龍、蟬蛻、防風、金櫻子、芡實、鬼箭羽、丹參、覆盆子、澤蘭、槐花。培元固腎方中含有玉屏風散，此方也是王耀光主任治療慢性腎炎的常用方、常用思路，補益肺脾，防止治療過程出現(xiàn)不同程度的外感而加重病情，導致功虧一簣，扶正又兼祛邪，又可避免閉門留寇，故在針對性治療時首先保證個體一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，則可提高治療效果。諸藥合用，標本兼治，共奏培補脾腎、祛風搜絡、疏肝養(yǎng)血、活血祛瘀之功。

培元固腎方尤重視脾腎兩臟，其中兼顧腎絡微型癥瘕、從風論治、肝腎同源理論。1）尤重視脾腎：王耀光教授在治療HBV-GN腎間質纖維化時，尤重視脾腎兩臟。HBV-GN患者免疫功能低下在中醫(yī)屬脾腎兩虛，脾腎為生命能量之源，兩者相互依存，一榮俱榮，一損俱損。故在治療HBV-GN的本虛時，必須先后天同補。王耀光教授認為腎間質纖維化的形成和抗纖維化的同時都是消耗正氣的過程，故在治療腎間質纖維化的同時，補益脾腎具有重要的作用，可明顯提高其抗纖維化療效。2）瘀血（腎絡微型癥瘕理論）：“腎絡微型癥瘕”理論由著名中醫(yī)專家呂仁和教授最早提出，是在治療慢性腎病時結合絡病學相關知識，提出的腎絡微癥瘕的理論及益氣養(yǎng)血法的治療原則。腎間質纖維化與“腎絡微型癥瘕”在一定程度上具有一致性，因此，腎纖維化形成的根本原因，也是氣血不足。王耀光教授在治療腎間質纖維化時，活血祛瘀的同時也重視益氣養(yǎng)血。3）從風論治：風邪是腎病起病的重要因素，王耀光教授在治療HBV-GN時，重視風邪在HBV-GN發(fā)生發(fā)展過程中的作用，認為風邪是促進HBV-GN蛋白尿患者病機重要原因，在腎病的纖維化及硬化過程中也有著重要作用。風邪挾HBV侵襲人體后，稽留不去，日久入里，入于腎絡，可導致腎絡拙急，又因風邪流動不居，善行數(shù)變，入于體內(nèi)，?？勺兓脼槠渌皻?，加重HBV-GN病情并使其遷延難愈。故在治療腎間質纖維化時加祛風藥，可祛其久居體內(nèi)之風邪又可治療風邪侵襲腎絡導致的腎絡拙急，從而延緩HBV-GN腎間質纖維化的進展。4）肝腎同源：肝腎關系密切，有著“肝腎同源”之說，兩者關系主要表現(xiàn)在藏泄互用、精血同源以及相互滋生制約。兩者相互協(xié)調(diào)又相互影響，故肝腎之病常肝腎同治。

HBV-GN為乙肝病毒表面抗原及e抗原引發(fā)的炎癥免疫機制[9]，是中國常見的繼發(fā)性腎病。HBV-GN可逐漸發(fā)展為腎功能不全，最終導致慢性腎功能衰竭，而腎間質纖維化幾乎是所有慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎臟病的共同病理過程[4-5]，是導致腎功能進行性衰竭的關鍵因素[6]。HBV-GN腎間質纖維化的發(fā)生機制，可能涉及多種炎癥因子、細胞因子及信號通路。其中，腎小管上皮細胞-間充質細胞轉分化（EMT）是腎間質纖維化發(fā)生和發(fā)展的重要機制[10]，HBV感染機體后可直接感染腎臟，在上皮細胞上成功表達HBsAg和HBeAg，在腎小管上皮細胞持續(xù)表達介導其免疫炎癥反應，導致轉化生長因子 TGF-β1的表達增多，有研究顯示，TGF-β1又是誘導EMT過程的核心因子，且TGF-β1的表達量與腎間質纖維化程度成正相關[11]，提示TGF-β1可能通過誘導MET的過程進而參與HBVGN腎間質纖維化的進展。本研究中，培元固腎方可抑制促纖維化核心因子TGF-β1的表達，從而抑制EMT過程，對α-SMA蛋白表達具有明顯的抑制作用，對E-Cadherin蛋白表達有明顯上調(diào)作用，進而延緩其腎間質纖維化進展。

綜上，腎間質纖維化是各種慢性腎臟疾病進展到終末期腎臟病的必經(jīng)過程，培元固腎方對HBsAg、HBeAg的表達具有一定的抑制作用，并可明顯抑制促纖維化因子TGF-β1的表達，從而抑制EMT過程，最終延緩HBV-GN腎間質纖維化的進展，同時也為中醫(yī)藥在防治HBV-GN腎間質纖維化中提供了一定的理論依據(jù)。