一起致瀉性大腸埃希菌食物中毒的病原學(xué)檢測(cè)分析

□ 王銀平 吳瑩 劉軍 張群 淄博市疾病預(yù)防控制中心

食源性疾病是指人體因攝食有毒有害物質(zhì)（包括生物性病原體）等致病因子所引發(fā)的疾病，無論是在發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家其都是目前最為突出的公共衛(wèi)生問題之一[1]。2020年6月，山東省淄博市某學(xué)校發(fā)生一起疑似食物中毒事件—6月29日～7月2日，該校陸續(xù)有30余人出現(xiàn)嘔吐、惡心、腹痛、腹瀉（多為水樣便，3～6次/天）等消化系統(tǒng)癥狀。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病患者均曾在該校食堂就餐，共同暴露食品為西紅柿炒雞蛋、炸蝦、稀飯等，除一名患者為食堂內(nèi)部工作人員外，其余均為學(xué)生，且共同進(jìn)餐人數(shù)約200人。本實(shí)驗(yàn)采用全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)對(duì)采集樣本混合樣進(jìn)行22種常見胃腸道感染相關(guān)病原體快速診斷，結(jié)果判定為致瀉大腸埃希菌，然后利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)所有樣本進(jìn)行致瀉大腸埃希菌初篩檢驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行樣本中致瀉大腸埃希菌的增菌培養(yǎng)、分離鑒定。結(jié)果證實(shí)，導(dǎo)致本次食物中毒事件的病原體是攜帶毒力基因escV和內(nèi)參基因uidA的EPEC。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及標(biāo)本來源

本次事件共采集樣本35份，其中，患者糞便23份、肛拭子7份、可疑食物3份（炸蝦、肉夾饃、西紅柿炒雞蛋）、熟食刀和熟食砧板涂抹物各1份。將被采集樣本裝入無菌采樣容器后進(jìn)行編號(hào)，然后立即送至市疾控實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原微生物檢驗(yàn)。質(zhì)控菌株為聚集性大腸埃希菌（EAEC）CMCC24186、產(chǎn)毒性大腸埃希菌（ETEC）CMCC10667、致病性大腸埃細(xì)菌（EPEC）CMCC24189、侵襲性大腸埃希菌（EIEC）CMCC10662、出血性大腸埃希菌（EHEC）CMCC24187，均由山東省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.1.2 主要儀器

FilmArray全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)，法國梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；ABI QuantStudio 5實(shí)時(shí)熒光PCR儀，美國ABI公司。

1.1.3 主要試劑

胃腸道感染檢測(cè)試條（FilmArray G1 Panel），法國梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；5種致瀉性大腸桿菌核酸檢測(cè)預(yù)分裝試劑盒（熒光PCR法），深圳生科原生物股份有限公司；營養(yǎng)肉湯、EE肉湯、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基等，北京陸橋有限公司，以上試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.2 方法

1.2.1 全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析檢測(cè)

按照胃腸道感染檢測(cè)試條（FilmArray G1 Panel）操作說明對(duì)被采集樣本混合樣預(yù)處理后，進(jìn)行22種常見胃腸道感染相關(guān)病原體的快速診斷。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

按照5種致瀉性大腸桿菌核酸檢測(cè)預(yù)分裝試劑盒（熒光PCR法）操作說明，應(yīng)用ABI QuantStudio 5實(shí)時(shí)熒光PCR儀對(duì)35份樣本進(jìn)行5種致瀉大腸埃希菌12種特異性基因檢測(cè)。

1.2.3 致瀉性大腸埃希菌的分離培養(yǎng)

依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》（GB/T 4789.6-2016）和《山東省食源性疾病主動(dòng)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》（2020年版），對(duì)所采集樣本進(jìn)行致瀉大腸埃希菌的增菌、分離和鑒定（肛拭子和糞便不增菌，直接進(jìn)行分離和鑒定）。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)通道及檢測(cè)基因

2 結(jié)果

2.1 全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果

使用全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)對(duì)所有樣本的混合樣進(jìn)行22種常見胃腸道感染相關(guān)病原體檢測(cè)，結(jié)果為檢出致瀉大腸埃希菌，具體型別為致病性大腸埃希菌（EPEC），詳見表1。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

選 擇 FAM、HEX/VIC/JOE、ROX、CY5這 4個(gè) 熒光通道分別對(duì)A/B/C管反應(yīng)液進(jìn)行熒光采集（見表2），記錄Ct值。樣本檢測(cè)結(jié)果判定：Ct值≤35，有明顯指數(shù)增長，為陽性；Ct值在35～38范圍，需對(duì)其重復(fù)檢測(cè)，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍，且有明顯指數(shù)增長，則判定為陽性，否則為陰性；Ct值＞38或無Ct值，判定為陰性。參照表3對(duì)35份樣本的Ct值進(jìn)行判讀，最終判定結(jié)果為10份樣本（2份肛拭子、8份糞便）初篩EPEC陽性，見表4。

2.3 致瀉性大腸埃希菌的分離培養(yǎng)

依據(jù)全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析檢測(cè)結(jié)果和實(shí)時(shí)熒光定量PCR初篩檢測(cè)結(jié)果，明確引起本次疑似食物中毒事件的病原菌為EPEC。對(duì)采集樣本進(jìn)行增菌培養(yǎng)后（肛拭子和糞便不增菌，直接進(jìn)行分離和鑒定），劃線至麥康凱瓊脂培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，挑取玫紅色可疑菌落劃線至腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)得到菌株純培養(yǎng)物。然后，再次應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)獲得的菌株純培養(yǎng)物進(jìn)行5種致瀉性大腸埃希菌的12種特異性基因復(fù)核鑒定，最終從6份糞便標(biāo)本中分離出攜帶毒力基因escV和內(nèi)參基因uidA的EPEC菌株。

3 討論

致瀉性大腸埃希菌（Diarrheagenic Escherichia coli，DEC）是一類能夠引起人體以腹瀉為主要癥狀的大腸埃希菌，其可通過污染食物引起人體患病。根據(jù)毒力因子、致病機(jī)理和流行病學(xué)特征可將DEC分為5類，即侵襲性大腸埃希菌（EIEC）、產(chǎn)毒性大腸埃希菌（ETEC）、致病性大腸埃希菌（EPEC）、出血性大腸埃希菌（EHEC）和聚集性大腸埃希菌（EAEC）。有文獻(xiàn)資料顯示，近年來，國內(nèi)已多次出現(xiàn)由致瀉性大腸埃希菌引起的食物中毒事件[2-5]。

表3 5種致瀉性大腸埃希菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果判讀

表4 疑似食物中毒35份樣本致瀉性大腸埃希菌檢測(cè)結(jié)果

學(xué)校作為一個(gè)特殊的公共場(chǎng)所，人員較為密集且流動(dòng)性大，一旦疏忽了對(duì)食品安全的日常監(jiān)管，放松了對(duì)食堂工作人員食品安全責(zé)任意識(shí)的培養(yǎng)，極易引起食源性疾病的暴發(fā)與流行。在此次食物中毒事件中，由于采集的樣本數(shù)量有限等原因，未能從食物樣本和刀板涂抹物樣本中檢出病原菌。值得注意的是，本次事件中有一名患者是該學(xué)校食堂內(nèi)部的工作人員，其發(fā)病時(shí)間比其他學(xué)生患者早2～3天，且該患者肛拭子樣本經(jīng)PCR初篩為EPEC陽性，由此推斷病原菌EPEC可能是食堂工作人員污染了食物，再經(jīng)污染的食物感染了多名學(xué)生。

本次事件中，35份樣本經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)初篩EPEC陽性共10份，經(jīng)增菌培養(yǎng)分離，最終從6份樣本中分離出EPEC菌株，其余4份PCR初篩陽性樣本未分離到目標(biāo)菌株。究其緣由，可能是因?yàn)镻CR技術(shù)靈敏度較傳統(tǒng)方法高，而肛拭子、糞便等樣本中背景菌群龐大、對(duì)目標(biāo)菌的分離存在干擾；同時(shí)，患者服用藥物也會(huì)影響目標(biāo)菌的存活量及存活狀態(tài)，這些因素都對(duì)目標(biāo)病原菌的培養(yǎng)分離產(chǎn)生較大影響。與傳統(tǒng)的病原菌分離培養(yǎng)方法相比，多重PCR技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)可以對(duì)疑似食物中毒事件的病原體進(jìn)行快速定性，并減少后續(xù)工作量。

鄧艷華對(duì)食品和公共場(chǎng)所從業(yè)人員致瀉性大腸埃希菌攜帶情況的一項(xiàng)研究[6]表明，在所有受檢人員中，致瀉性大腸埃希菌的檢出率明顯高于沙門氏菌、志賀菌的檢出率。由此可見，在食品從業(yè)人員的預(yù)防性健康體檢項(xiàng)目中，增加致瀉性大腸埃希菌的檢測(cè)具有一定的可行性和必要性。

實(shí)驗(yàn)室快速、精準(zhǔn)的現(xiàn)代化檢測(cè)技術(shù)在此次食物中毒事件的處置應(yīng)對(duì)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，為控制病情贏得了寶貴時(shí)間，患者發(fā)病后得到了及時(shí)的對(duì)癥治療，病情得以好轉(zhuǎn)，沒有造成嚴(yán)重的后果。食品和公共場(chǎng)所從業(yè)人員需提高安全責(zé)任意識(shí)，采購時(shí)選用新鮮食材，加工時(shí)做到生熟分開，及時(shí)消毒，并嚴(yán)格控制環(huán)境溫度、濕度等條件，抑制病原菌繁殖，以有效預(yù)防食物中毒事件的發(fā)生，更好地保障人民群眾舌尖上的安全。