蛔蟲感染對過敏性哮喘小鼠免疫機制的影響*

★ 楊小軍 白高波 金桂林 楊軍平 彭國華（.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 南昌 330006；2.南昌市疾病預防控制中心 南昌 330038）

哮喘發(fā)病機制復雜［1］,近年來的研究表明過敏性哮喘發(fā)病率的不斷攀升與當?shù)馗腥拘约膊“l(fā)病率的下降存在密切關系，兩者呈正相關［2-6］。如近年報道：全世界范圍哮喘分布表現(xiàn)為發(fā)達國家高于發(fā)展中國家，城市高于農(nóng)村。根據(jù)疾病預防與控制中心的數(shù)據(jù)，美國近500 萬兒童被確診患有哮喘病。盡管采取了積極的研究和預防措施，在1980～1993 年間，美國兒童與哮喘病相關的死亡率仍上升了78%，而在我國北京市1990～2000 年l0年間兒童哮喘患病率也從0.78%上升到2.06%，增加了1.6 倍。對此有人認為哮喘發(fā)病率的增加可能是因為發(fā)達地區(qū)兒童與病原菌接觸的機率減少，使Thl/Th2 免疫反應失衡并偏向于有利于哮喘發(fā)作的Th2 型反應所致，但對此平衡理論爭論頗多。眾所周知，過敏性疾病和蠕蟲感染都是以IgE 水平增高，嗜酸性粒細胞浸潤為特征的Th2 型反應為特征［2,7］。不同的是，對于前者Th2 反應是人體異常的免疫調(diào)節(jié)反應，對于后者它卻是機體對抗蠕蟲感染中的一種重要保護機，當蠕蟲入侵人體時，Th2 型細胞通過產(chǎn)生IL-4 和IL-5 誘導體液免疫應答，產(chǎn)生多種高水平的抗體，來抑制蠕蟲感染［7-8］。然而，大量流行病學調(diào)查資料顯示，在蠕蟲感染高發(fā)區(qū)，遺傳性過敏癥和哮喘等過敏性疾病的發(fā)病率較低［9］，也就是說盡管蠕蟲及過敏原皆可誘發(fā)Th2 反應，而前者卻對后者有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 蛔蟲卵的收集與制備

1.1.1 采集 對蛔蟲感染者驅(qū)蟲治療（均知情同意），選用噻嘧啶 10 mg/kg 劑量，一次頓服，從服藥后的患者糞便中收集蛔蟲成蟲。

1.1.2 培養(yǎng) 自雌性蛔蟲成蟲子宮遠端分離蟲卵，保存于 0.1N 硫酸中，調(diào)整蟲卵濃度大約為25 個/μL避光培養(yǎng)，每周搖動2～3 次，25 ℃左右避光培養(yǎng)3周左右，至在顯微鏡下觀察90%以上的蟲卵發(fā)育為感染期蟲卵［10］。

1.1.3 蛔蟲卵劑量的確定 將發(fā)育為感染期的蛔蟲卵,經(jīng)過兩輪多次反復抽樣后調(diào)定到2000 個/mL，吸取0.5 mL 預先分裝于EP 管中，置5～10℃冰箱冷藏備用。

1.2 動物分組與模型建立

1.2.1 實驗動物與分組 SPF 級別C57BL/6 近交小鼠（購自上海斯萊克實驗動物中心）60 只，體重18～20g，雌雄兼用。60 只小鼠隨機分為4 組，每組15 只（A 組：蛔蟲感染組；B 組：過敏性哮喘組；C組：蛔蟲感染合并過敏性哮喘組；D 組：正常對照組）。

1.2.2 動物飼養(yǎng)條件 小鼠在潔凈室內(nèi)飼養(yǎng)，使用購入的真空消毒包裝飼料，飲用煮沸消毒開水，鼠籠墊料經(jīng)高壓滅菌消毒，以防其他病原體交叉感染。墊料每隔3～4 天更換以保持小鼠干燥生活環(huán)境。

1.2.3 建立感染蛔蟲小鼠模型［11］小鼠感染前均饑餓12 h，可進水。次日早上進行灌胃感染。感染劑量均為每只小鼠1000 個卵/（0.5 mL,只）。感染后，將小鼠按A、C 組分籠飼養(yǎng)。

1.2.4 建立過敏性哮喘小鼠模型 模型組分別于第1 天、第8 天用新鮮配制的OVA（Grade V）1mg+氫氧化鋁200mg+生理鹽水1mL 混懸液在小鼠兩腹股溝、腹、前足跖，共4 點做皮下注射，每點0.2mL、同時腹腔注射0.2 mL。正常對照組以生理鹽水代替OVA 致敏。于實驗第15 天，將小鼠置于20 cm×20 cm×15 cm 大小的密閉容器中，由PARI BOY 高頻霧化器（CE，Germany）提供霧化動力，以1% OVA（Grade II）進行霧化吸入激發(fā)，每次霧化30min，連續(xù)6d。正常對照組以生理鹽水代替OVA 激發(fā)。

1.2.5 建立蛔蟲感染合并過敏性哮喘小鼠模型 將感染蛔蟲的C 組小鼠按1.2.4 步驟造模。

1.3 外周血嗜酸性粒細胞直接計數(shù)（EOS） 造模21 天后（通過預實驗此時免疫反應最強烈）對蛔蟲感染組、過敏性哮喘組、蛔蟲感染合并過敏性哮喘組以及正常對照組的小鼠，以10%異戊巴比妥鈉腹腔麻醉（0.1 mL/kg），75%乙醇浸泡3min 消毒皮膚，取仰臥位固定于手術臺上，打開胸腔，無菌心臟采血1.5 mL,其中0.5 mL 注入EDTA-K2 抗凝管中用于全自動血細胞分析儀（深圳邁瑞公司生產(chǎn)的6800）計數(shù)嗜酸性粒細胞；其余血液注入不加抗凝劑的干凈EP 管中，離心分離出血清后放冰箱冷藏備用。

1.4 血清總IgE 測定 取備用血清0.2 mL，在日立生化儀（(HITACHI 7180）上檢測血清中總IgE 的濃度。

1.5 血清中IL-4、IL-10、TNF-α、INF-Υ 水平測定 采用ELISA 試劑盒測定各組小鼠血清中IL-4、IL-10、TNF-α、INF-Υ 的濃度。

1.6 T 淋巴細胞免疫分型測定 用流式分析儀（Beckman Coulter Cytomics FC500）檢測外周血中CD3、CD4、CD8 淋巴細胞絕對數(shù)及CD4/CD8 比值。

1.7 統(tǒng)計學方法 對組間數(shù)據(jù)用SPSS17.0 軟件進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 外周血嗜酸性粒細胞直接計數(shù)（EOS）和總IgE 的測定 蛔蟲感染組、過敏性哮喘組、蛔蟲感染合并過敏性哮喘組和正常對照組的每只小鼠經(jīng)心臟穿刺取血后，分別測定全血的EOS 及血清的總IgE 濃度。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠嗜酸性粒細胞計數(shù)(EOS)和總IgE結(jié)果比較（，n=15）

表1 各組小鼠嗜酸性粒細胞計數(shù)(EOS)和總IgE結(jié)果比較（，n=15）

注：與正常對照組相比較，*P＜0.05；與正常對照組相比較，**P＜0.01。

從表1 的結(jié)果中可以看出,各組實驗動物EOS比較，蛔蟲感染組、過敏性哮喘組明顯高于正常對照組（P<0.01），蛔蟲感染合并過敏性哮喘組高于正常對照組（P<0.05），過敏性哮喘組高于蛔蟲感染組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；蛔蟲感染組和過敏性哮喘組均高于蛔蟲感染合并過敏性哮喘組（P<0.05）；各組實驗動物總IgE 比較，蛔蟲感染組、過敏性哮喘組明顯高于正常對照組（P<0.01），蛔蟲感染合并過敏性哮喘組高于正常對照組（P<0.05），過敏性哮喘組高于蛔蟲感染組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；蛔蟲感染組和過敏性哮喘組均高于蛔蟲感染合并過敏性哮喘組（P<0.05）。

2.2 血清中細胞因子的表達 蛔蟲感染組、過敏性哮喘組、蛔蟲感染合并過敏性哮喘組和正常對照組的每只小鼠經(jīng)心臟穿刺取血后，測定血清中細胞因子的表達。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠血清細胞因子水平比較（，n=15） pg/ml

表2 各組小鼠血清細胞因子水平比較（，n=15） pg/ml

注：*與正常對照組相比較P＜0.05；**與正常對照組相比較P＜0.01。

由表2 結(jié)果可以看出，各組實驗動物IL-4、IL-10、TNF-α 比較，蛔蟲感染組、過敏性哮喘組明顯高于正常對照組（P<0.01），蛔蟲感染合并過敏性哮喘組高于正常對照組（P<0.05），過敏性哮喘組高于蛔蟲感染組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；蛔蟲感染組和過敏性哮喘組均高于蛔蟲感染合并過敏性哮喘組（P<0.05）；各組實驗動物INF-Υ 比較，蛔蟲感染組、過敏性哮喘組、蛔蟲感染合并過敏性哮喘組均高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；蛔蟲感染組和過敏性哮喘組均高于蛔蟲感染合并過敏性哮喘組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.3 T 淋巴細胞免疫分型測定 蛔蟲感染組、過敏性哮喘組、蛔蟲感染合并過敏性哮喘組和正常對照組的每只小鼠經(jīng)心臟穿刺取血后，計數(shù)全血中的T淋巴細胞絕對數(shù)。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠全血CD細胞絕對計數(shù)結(jié)果比較（，n=15）

表3 各組小鼠全血CD細胞絕對計數(shù)結(jié)果比較（，n=15）

注：*與正常對照組相比較P＜0.05；**與正常對照組相比較P＜0.01。

由表3 結(jié)果可以看出，各組實驗動物CD3、CD4、CD8 比較，蛔蟲感染組、過敏性哮喘組明顯高于正常對照組（P<0.01），蛔蟲感染合并過敏性哮喘組高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；蛔蟲感染組和過敏性哮喘組均高于蛔蟲感染合并過敏性哮喘組（P<0.05）；各組實驗動物CD4/CD8 比較，蛔蟲感染組、過敏性哮喘組均高于正常對照組（P<0.05）、蛔蟲感染合并過敏性哮喘組高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3 討論

Araujo 等［12］研究顯示，有寄生蟲感染的患者血清總IgE 和寄生蟲特異性IgE 水平高于未感染者，而未感染者的變應原特異性IgE 水平高于前者，變應原皮膚試驗陽性率也高于感染者，提示寄生蟲特異性IgE 可能對變應原特異性IgE 有抑制作用。本研究結(jié)果顯示，蛔蟲感染合并過敏性哮喘組血清總IgE 高于正常對照組，但低于蛔蟲感染組和過敏性哮喘組，可能與蛔蟲分泌的特異性抗體對過敏性哮喘產(chǎn)生的抑制作用有關。

過敏性哮喘總的來說存在Th 細胞功能失衡，Th2 細胞活化亢進的現(xiàn)象［13］。已有的研究表明，細胞因子、抗原、抗原遞呈細胞（APC）、共刺激信號以及一些基因調(diào)控因子均為Thl/Th2 極化提供了重要信號［14］。本研究中各組實驗動物IL-4、IL-10、TNF-α 比較，蛔蟲感染組、過敏性哮喘組明顯高于正常對照組（P<0.01），蛔蟲感染合并過敏性哮喘組高于正常對照組（P<0.05），但低于蛔蟲感染組和過敏性哮喘組，與Shirai 等［15］的研究結(jié)果相一致。

本研究結(jié)果顯示，蛔蟲感染組、過敏性哮喘組CD3、CD4 均明顯高于蛔蟲感染合并過敏性哮喘組和正常對照組，CD8 比較差異無統(tǒng)計學意義，提示寄生蟲感染和過敏性疾病可刺激T 淋巴細胞分泌細胞因子，使機體的免疫功能亢進。而蛔蟲感染合并過敏性哮喘可能使機體的免疫功能受到抑制，本研究的CD4/CD8 結(jié)果也符合這一推斷。

通常認為，蠕蟲感染可造成宿主明顯的慢性免疫改變，一般是使Thl/Th2 極化向著強化Th2 的狀態(tài)偏移，并伴隨有高嗜酸細胞血癥、高血清IgE 以及Th2類細胞因子如IL-4、IL-5和IL-10的表達［16］。蛔蟲可能主要是通過免疫耐受和免疫剌激實現(xiàn)對過敏反應的抑制作用。雖然多數(shù)研究支持寄生蟲感染對哮喘的抑制作用，但蠕蟲種類繁多，各蟲種間差異較大，抗原表位復雜，即使是同一蟲種的不同階段引起的免疫應答也不盡相同，多種因素可以影響其對過敏反應的結(jié)果，比如蛔蟲感染組的各項指標會不會與其被感染的天數(shù)有關？這些有待于今后的實驗去進一步證實。