響應面法優(yōu)化新疆風味調和茶總糖的提取工藝

袁巧云, 張建梅, 唐 鈺, 張 良, 顧 倩, 尚 志, 胡衛(wèi)成

(淮陰師范學院 生命科學學院, 江蘇 淮安 223300)

0 引言

新疆風味調和茶是新疆保健茶類的一種,迄今已有1600多年歷史.明朝談修在《滴露漫錄》中就有所指:以其腥肉之食,非茶不消;青稞之熱,非茶不解[1]．新疆人民根據(jù)傳統(tǒng)醫(yī)藥知識和日常生活經(jīng)驗,以茶為基礎,添加多種藥食兩用植物,總結和實踐出的一系列用于日常調養(yǎng)以增加營養(yǎng)[2],預防疾病的功能性飲品,形成了獨具特色的新疆風味調和茶,茶水湯色紅濃,滋味芳香,醇厚可口[3]．同時維吾爾醫(yī)學認為常飲調和茶具有消除疲勞、舒肝養(yǎng)胃、祛風驅寒、提神壯腎和利尿的神奇功效,其配方一年四季均有不同,會產(chǎn)生不同的功效,夏季可以消暑生津解渴,冬季則有增加熱量和御寒的功效[4]．

總糖即為糖類物質的總量,包括各種單糖、雙糖及多糖中的淀粉,其中多糖是糖天然存在的重要形式[5]．多糖是由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接形成的含醛基或酮基的天然高分子聚合物[6],是參與生命活動與代謝調節(jié)的重要成分,具有多種生物活性功能和藥理活性[7-9],如：抗腫瘤、抗炎、增加免疫力、降血糖[10]、抗輻射、降血脂、保肝等[11]．

已有文獻對新疆風味調和茶營養(yǎng)成分或與其功效相關的活性成分進行了研究分析[12-13],但尚未發(fā)現(xiàn)關于該茶糖類成分分析的相關報道．本文以新疆風味調和茶為原料,在單因素實驗的基礎上,通過響應面法[14-16]優(yōu)化其總糖的提取工藝,為新疆風味調和茶的進一步研發(fā)提供基礎數(shù)據(jù)和研究資料．

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆風味調和茶是由多種原料混合研磨制成,配方如下:豆蔻3 g，紅花6 g，玫瑰6 g，丁香0.6 g，薄荷4 g，小茴香3 g，甘草2 g，干姜0.6 g，姜黃1 g，茯磚茶30 g. 經(jīng)單獨研磨后,過18目篩,24 h凍干處理后,混合．葡萄糖(分析純),濃硫酸(分析純),5%苯酚(分析純),化學品均購自國藥集團化學試劑有限公司．

ALPHA1-2型冷凍干燥機(德國Christ公司);HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇億通電子有限公司);5810R型臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司); DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);Tecan Infinite M200 Pro型酶標儀(瑞士Tecan公司)．

1.2 實驗方法

1.2.1 總糖提取方法

稱取一定量的新疆風味調和茶粉末,于一定溫度水浴鍋中水浴提取一定時間,每30 min振動離心管,充分混勻料液．水浴完畢,4 000 r/min離心10 min,收集上清液定容至50 mL．取5 mL定容后的溶液冷凍在-20℃冰箱．各取5 mL經(jīng)處理的冷凍樣品水浴化開,渦旋振蕩(2 800 r/min, 0.5 min),每個樣品各取1 mL,4 000 r/min離心10 min．

1.2.2 標準曲線制作

稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的葡萄糖標準品50 mg,用水溶解于50 mL的容量瓶中定容,配制成1 mg/mL的葡萄糖標準液．

分別吸取葡萄糖標準溶液0,50,100,200,300,400和500 μL置于10 mL試管中,各加超純水至1 mL,再依次加入1 mL配制好的5%苯酚溶液,5 mL濃硫酸,移至渦旋儀,渦旋至混合均勻無分層,將試管置于30℃水浴鍋中水浴30 min,移至渦旋儀上渦旋．依次吸取200 μL的溶液于96孔板,置于酶標儀中在波長為490 nm處,測其OD值．以葡萄糖質量濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線,標準方程為:Y=0.0062X+0.0078,R2=0.9994．式中:Y為吸光度,X為總糖質量濃度(g/mL)．

1.2.3 總糖提取量測定

稱取0.5 g新疆風味調和茶粉末,加超純水溶解,水浴加熱,4 000 r/min下離心10 min,取上清液定容至50 mL容量瓶,得到待測樣品溶液．取500 μL樣品溶液,用苯酚-硫酸法測定總糖的含量,按照標準曲線的測定方法,測定樣品的OD值,根據(jù)回歸方程計算得到新疆風味調和茶溶液中總糖的提取量．

1.2.4 總糖提取單因素實驗

1) 提取溫度對總糖提取的影響

分別稱取0.5 g新疆風味調和茶粉末于50 mL離心管中,按料液比1:30 g/g加入超純水,混合均勻,分別于60,70,80,90和100℃條件下浸提2 h,考察不同溫度對新疆風味調和茶總糖提取量的影響．

2) 提取時間對總糖提取的影響

分別稱取0.5 g新疆風味調和茶粉末于50 mL離心管中,按料液比1:30 g/g加入超純水,混合均勻,于90℃條件下,分別浸提0.5,1.0,1.5,2.0,2.5和3.0 h,考察不同提取時間對新疆風味調和茶總糖提取量的影響．

3) 料液比對總糖提取的影響

表1 Box-Behnken實驗因素與水平

分別稱取0.5 g新疆風味調和茶粉末于50 mL離心管中,料液比1:10,1:20,1:30,1:40和1:50 g/g依次加入超純水,混合均勻,于90℃條件下,浸提2 h,考察不同料液比對新疆風味調和茶總糖提取量的影響．

1.2.5 響應面分析法對提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)以上單因素實驗的結果確定因素水平范圍,依據(jù)Box-Behnken設計原理得到本次實驗中影響新疆風味調和茶總糖提取因素分別如下:提取溫度為80,90和100℃,提取時間為1.5,2.0和2.5 h,料液比為1:20,1:30和1:40(g/g),按測定總糖量的方法,應用響應面分析法對新疆風味調和茶的提取工藝進行優(yōu)化．實驗因素與水平見表1．

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取溫度對總糖提取量的影響

由圖1可知,隨著提取溫度的升高,新疆風味調和茶總糖提取率逐漸升高,當提取溫度由60℃上升到70℃時,新疆風味調和茶總糖提取率上升較快,說明含糖量增加幅度大．當提取溫度80℃到100℃時,曲線趨勢比較平穩(wěn),當提取溫度達到100℃時,總糖提取量的得率最高為7.89%,由于高溫可能影響到多糖的結構與其活性,當提取溫度超過100℃時,多糖易降解失活,所以選擇100℃為新疆風味調和茶總糖提取的最適溫度．

2.1.2 時間對總糖提取量的影響

由圖2可知,隨著提取時間的延長,新疆風味調和茶總糖提取量呈升高的趨勢．在0.5-2 h的范圍內,相應的含糖量顯著增加．當提取時間為2 h時,總糖的得率為7.60%,將時間延長到2.5 h后,總糖的得率只增加了0.01%,為了縮短加工時間,減少能源消耗,故選擇2 h為新疆風味調和茶總糖的最佳提取時間．

圖1 提取溫度對總糖提取率的影響 圖2 提取時間對總糖提取率的影響

2.1.3 料液比對總糖提取量的影響

由圖3可知,新疆風味調和茶的總糖提取量隨料液比的增大而增加．當料液比從1:10增大到1:20,總糖得率增加了1.98%,說明料液比對其影響顯著．當料液比為1:40,1:50時,其提取率之間無顯著差異,為了節(jié)約成本,選擇料液比為1:40(g/g)較為合適．

圖3 料液比對總糖提取率的影響

表2 響應面法實驗設計與結果

2.2 響應面法實驗結果

2.2.1 Box-Behnken實驗設計及結果

在單因素實驗結果的基礎上,選取有較顯著影響的提取溫度,提取時間,料液比,分別以A,B,C表示,以總糖提取量為響應值進行響應面分析(Design Expert V8.0.6軟件),實驗設計及結果見表2．

表3 方差分析結果

2.2.2 回歸模型建立與顯著性分析

根據(jù)Design Expert V8.0.6軟件處理,由實驗數(shù)據(jù)所得新疆風味調和茶總糖提取量與提取溫度,提取時間,料液比的二次多元回歸方程為:Y=848.14+42.20A+3.39B+61.49C-4.71AB-14.82AC+2.87BC+6.84A2-3.58B2+0.93C2

由表3回歸方程方差分析結果可知,由實驗數(shù)據(jù)所得模型的p值為0.0014,表示該模型具有極顯著性,回歸方程中因素A-溫度和C-料液比對新疆風味調和茶提取總糖量影響極顯著,且兩因素中的因素C-料液比對提取量的影響更加顯著其他因素不顯著．根據(jù)方程變量系數(shù)大小可知,影響總糖提取量的因素依次是:C-料液比>A-溫度>B-時間．

圖4 任意兩變量對總糖提取率影響的響應等高線圖

2.2.3 響應面分析與提取工藝優(yōu)化

根據(jù)提取溫度,提取時間和料液比對新疆風味調和茶總糖的提取量的影響,繪制響應等高線圖．由圖4可知,提取溫度,提取時間和料液比對新疆風味調和茶總糖的提取量都有影響且三者之間存在交互作用．利用Design Expert V8.0.6軟件進行模擬計算,以總糖提取量為評價指標,得到新疆風味調和茶提取的最優(yōu)工藝是:提取溫度100℃,提取時間2.02 h,料液比1:40．為了驗證響應面最優(yōu)提取工藝數(shù)據(jù)的有效性,采用最優(yōu)工藝對新疆風味調和茶進行提取驗證實驗,得總糖提取量為944.35 g/mL,與響應面法模擬出的理論值944.84 μg/mL基本一致,說明回歸方程與實際情況擬合較好,響應面分析實驗進一步證明了該優(yōu)化工藝的可靠性．

3 結論

以總糖提取量為評價指標,在單因素實驗的基礎上,采用苯酚-硫酸法建立新疆風味調和茶的總糖測定方法,應用響應面法進行優(yōu)化,用Box-Behnken實驗設計原理得到新疆風味調和茶總糖提取的最優(yōu)工藝為:提取溫度100℃,提取時間2.02 h,料液比1:40．采用以上最優(yōu)工藝對新疆風味調和茶進行實驗,得到總糖提取量為944.35 g/mL,接近于響應面法模擬所得出的理論值,說明該優(yōu)化工藝較為可靠．

新疆風味調和茶具有較廣泛的營養(yǎng)、保健和藥理功效,深入研究該調和茶的無機鹽、氨基酸及糖類等營養(yǎng)成分并研究活性成分的藥效機制具有重要意義．本文優(yōu)化了新疆風味調和茶總糖的提取工藝,為大量制備活性糖類成分,進一步研究新疆風味調和茶的功效和工業(yè)化生產(chǎn)提供了基礎數(shù)據(jù)和研究資料．